鼠曲草抗慢性阻塞性肺疾病的質量標志物篩選 Δ

劉婉婷 ，謝 榕 ，林達淮 ，葉向麗 ，嚴國鴻 ，李 煌 （.福建中醫藥大學藥學院，福州 50；.福建醫科大學附屬協和醫院呼吸內科，福州 5000；.福建中醫藥大學附屬人民醫院藥學部，福州 50004）

鼠曲草為菊科植物鼠曲草Gnaphalium affineD.Don的干燥全草，別名佛耳草、清明菜等，最早記載于《名醫別錄》，曾收載于1977年版《中國藥典》，具有化痰止咳、祛風平喘的功效。作為藥食兩用資源，鼠曲草的民間食用歷史悠久，如川渝地區的“清明粑”，以及福建三明、永泰等地區的“鼠粬餅”[1]?，F代研究發現，鼠曲草主要成分為黃酮類、有機酸、揮發油等[2]，具有較好的抗炎、抗氧化、抗痛風等作用[3]，尤其對呼吸系統疾病，如慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD），療效顯著[4―5]。

世界上鼠曲草屬品種多樣，其中我國有19 種[6]，已有的研究主要集中在鼠曲草化學成分提取分析、藥效活性評價等方面[7]。然而上述研究均忽略了不同產地來源鼠曲草的質量差異，目前尚未見較為全面的基于中藥質量標志物理念的鼠曲草質量標準。本研究運用網絡藥理學方法，分析預測鼠曲草抗COPD 的有效成分及靶點；在此基礎上采用高效液相色譜（HPLC）法以10 批不同產地的鼠曲草為研究對象，建立HPLC 指紋圖譜，借助化學模式識別分析探究鼠曲草的質量標志物并測定其含量，以期為全面進行鼠曲草質量評價和質量標志物的量化辨識提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

e2695 型HPLC 儀購自美國Waters 公司；Mettler Toledo XS105 型分析天平購自梅特勒托利多科技（中國）有限公司；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器購自昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、金絲桃苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、芹菜素對照品（批號分別為W10B104178、MUST-17030620、M27GB143417、M04HB177048、MUST-11122003、W17J10C90785、O20GB164741、100081-200406、111901-202004，純度均不低于98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；10批不同產地鼠曲草藥材經福建中醫藥大學藥學院劉小芬副教授鑒定均為菊科植物鼠曲草G. affineD. Don 的干燥全草，產地包括廣東潮汕、廣西桂林、湖南衡陽、江西吉安、廣東梅州、湖南邵陽、福建閩侯、江西宜春、四川達州、福建三明（編號依次為S1～S10）；乙醇（分析純）購自西隴科學股份有限公司；磷酸（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 鼠曲草抗COPD的有效成分及靶點預測

檢索TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、CNKI（https：//www.cnki.net/）、PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲取鼠曲草成分，并以口服藥物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（druglike properties，DL）≥0.18 為條件進行篩選[8]，得到鼠曲草的活性成分。通過活性成分獲取其對應的藥物靶點。將所得藥物靶點輸入到UniProtKB（https：//www.uniprot.org/）數據庫中尋找其對應的基因簡稱，方便后續分析；在OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫中以“chronic obstructive pulmonary disease”為關鍵詞進行檢索，設置relevance score≥20，得到抗COPD的相應靶點。使用Venny 2.1.0找出藥物-疾病共同靶點。結果顯示，鼠曲草的主要活性成分有貝殼杉烯酸、2-（3S）-3-羥基-3-甲基戊-4-烯基、4-膽甾烯-3-酮等（表1）；扣除重復靶點后得到共同靶點91 個。已有研究表明，黃酮類及有機酸類成分可通過調節氧化應激相關通路起到抗COPD的作用[9]，因此，本課題組綜合現有文獻及網絡藥理學結果以原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、金絲桃苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、芹菜素為對照，開展進一步研究。

表1 鼠曲草抗COPD的活性成分（OB值排名前10位）

2.2 鼠曲草HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

采用Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，10%A→30%A；10～20 min，30%A→35%A；20～28 min，35%A→45%A；28～35 min，45%A→70%A；35～40 min，70%A→10%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為310 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取鼠曲草粉末1.00 g，置于錐形瓶中，精密加入50%乙醇40 mL，超聲（功率400 W）提取2 次，每次30 min，過濾，濾液蒸干后置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，提取液通過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、金絲桃苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、芹菜素各0.65、4.86、0.48、1.92、1.07、1.21、1.88、1.15、1.15 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成質量濃度分別為0.13、0.972、0.096、0.384、0.214、0.242、0.376、0.23、0.23 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.4 精密度試驗

取鼠曲草供試品溶液（編號S1），按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6針，以7號峰（芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.01%～0.02%，相對峰面積的RSD 為2.17%～2.85%（n＝6），表明方法精密度良好，符合指紋圖譜技術要求。

2.2.5 重復性試驗

取鼠曲草藥材（編號S1），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以7 號峰（芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.02%～0.26%，相對峰面積的RSD 為2.35%～2.81%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗

取鼠曲草供試品溶液（編號S1），按“2.2.1”項下色譜條件，分別在放置0、2、4、6、8、12、24 h 時進樣分析，以7號峰（芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.06%～0.26%，相對峰面積的RSD 為0.88%～2.49%（n＝6），表明鼠曲草供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.7 指紋圖譜的建立與相似度評價

取10批鼠曲草藥材，按“2.2.2”項下方法分別制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將10批鼠曲草HPLC數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）》進行評價，設置S1樣品圖譜為參照，采用平均數法，時間窗寬度設置為0.1 min，經過多點校正和Mark 峰匹配，得到10 批鼠曲草藥材的共有峰模式（圖1）及鼠曲草對照指紋圖譜R（圖2）。其中標定了9 個共有峰（1 號峰為原兒茶酸，2 號峰為綠原酸，3號峰為咖啡酸，4號峰為1，3-O-二咖啡?；崴?，5 號峰為金絲桃苷，6 號峰為異毛蕊花糖苷，7 號峰為芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，8 號峰為槲皮素，9 號峰為芹菜素），以7號峰（芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，9 個共有峰相對保留時間的RSD 為0.43%～1.85%（n＝9），相對峰面積的RSD 為53.29%～102.30%（n＝9），表明不同產地鼠曲草的化學成分含量存在較大差異。以生成的對照指紋圖譜為對照，計算各批次鼠曲草藥材的相似度。結果顯示，10批樣品相似度均大于0.90，表明不同產地的鼠曲草藥材化學成分一致性較好。

圖1 10批鼠曲草藥材的共有峰模式

圖2 鼠曲草對照指紋圖譜R

2.3 10批鼠曲草藥材的化學模式識別分析

2.3.1 聚類分析

選擇歐氏距離為測度，采用組間連接法進行聚類分析。結果顯示，10 批樣品呈明顯的分類趨勢，當歐氏距離為20 時，10 批樣品聚為3 類，其中S3、S4、S6、S7、S10聚為一類，S2、S5、S8、S9 聚為一類，S1 聚為一類，結果見圖3。

圖3 10批鼠曲草藥材聚類分析樹狀圖

2.3.2 主成分分析

將10 批鼠曲草藥材指紋圖譜中的9 個共有峰數據導入SPSS 21.0 軟件進行主成分分析，計算得到主成分特征值、累計方差貢獻率。結果顯示，主成分分析共提取3 個特征值大于1 的主成分，累計方差貢獻率為87.804%，表明提取的前3 個主成分可以代表鼠曲草藥材指紋圖譜共有峰中大部分的信息。旋轉后的成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小，結果顯示，2、3、6、8、9號峰對第1主成分的貢獻較大，即綠原酸、咖啡酸、異毛蕊花糖苷、槲皮素、芹菜素對第1主成分影響較大；5、6、8 號峰對第2 主成分的貢獻較大，即金絲桃苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素對第2 主成分影響較大；1、7號峰對第3 主成分貢獻較大，即原兒茶酸、芹菜素7-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷對第3主成分影響較大。

將9 個共有峰峰面積導入SIMCA 14.0 軟件進行主成分分析，得到得分散點圖（圖4），其集中程度與聚類分析結果相符。

圖4 10批鼠曲草藥材的主成分分析得分散點圖

2.3.3 正交偏最小二乘-判別分析

運用SIMCA 14.0 軟件對10 批鼠曲草藥材的9 個共有峰峰面積進行正交偏最小二乘-判別分析，得正交偏最小二乘-判別分析模型（圖5）。結果顯示，模型擬合度R2Y為0.751，模型預測能力Q2為0.624，二者均高于0.5，表明模型擬合較好、穩定可靠、預測能力強，可有效判別分析10 批鼠曲草藥材的質量差異。變量重要性投影（variable importance projection，VIP）結果顯示，9 個化學成分影響程度由大到小依次為：芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷＞1，3-O-二咖啡?；崴幔揪G原酸＞咖啡酸＞槲皮素＞異毛蕊花糖苷＞芹菜素＞金絲桃苷＞原兒茶酸，其中芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（VIP＝1.460 4）、1，3-O-二咖啡?；崴幔╒IP＝1.247 6）、綠原酸（VIP＝1.114 3）、咖啡酸（VIP＝1.024 7）是影響鼠曲草質量的差異性成分（VIP＞1），可作鼠曲草的潛在質量標志物。這提示應關注鼠曲草中上述成分含量，建立其質量控制體系，以提高產品質量的穩定性與一致性。

圖5 10批鼠曲草藥材的正交偏最小二乘-判別分析模型

2.4 4種潛在質量標志物的含量測定

采用HPLC法對“2.3.3”項下所得4種潛在質量標志物（綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）的含量進行測定。

2.4.1 色譜條件

色譜條件同“2.2.1”項。

2.4.2 混合對照品溶液的制備

取綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品各適量，按“2.2.3”項下方法制成質量濃度分別為1.88、0.48、0.65、4.86 mg/mL的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

制備方法同“2.2.2”項。

2.4.4 專屬性試驗

取“2.4.2”“2.4.3”項下混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖略）。結果顯示，各成分色譜峰分離良好，提示該方法專屬性良好。

2.4.5 線性關系考察

精密吸取“2.4.2”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻制得系列混合溶液。按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，以各差異性成分進樣質量濃度為橫坐標（X，mg/mL），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表2。

表2 4種差異性成分的線性關系考察結果

2.4.6 精密度試驗

取“2.4.3”項下供試品溶液（編號S1），按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄各差異性成分的峰面積。結果顯示，綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰面積的RSD 分別為2.39%、2.91%、2.56%、1.31%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.7 穩定性試驗

取“2.4.3”項下同一供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰面積的RSD 分別為2.97%、2.71%、2.89%、0.42%（n＝6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.4.8 重復性試驗

取同一批鼠曲草藥材（編號S1）6 份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并根據標準曲線計算含量。結果顯示，綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷含量的RSD 分別為2.95%、1.73%、1.95%、0.61%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.4.9 含量測定

取10批鼠曲草藥材，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各差異性成分的峰面積，并根據標準曲線計算綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，平行測定3次，取平均值。結果見表3。

表3 10批鼠曲草藥材中4種差異性成分的含量測定結果（mg/g，n＝3）

3 討論

鼠曲草作為一種藥食兩用資源，分布廣泛，便于采摘。中藥質量標志物能夠反映中藥材的質量特征，因此近年來在建立質量標準和質量評價方法時常采用中藥質量標志物來反映其藥效和質量。中藥指紋圖譜穩定性好、專屬性強、整體性高，能夠全面反映中藥材整體的化學成分信息[10]?；诖?，本研究采用網絡藥理學結合指紋圖譜，預測鼠曲草的中藥質量標志物，篩選出芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3-O-二咖啡?；崴?、綠原酸、咖啡酸4 種差異性成分為鼠曲草的潛在質量標志物。

3.1 網絡藥理學預測指標成分

芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、咖啡酸具有抗氧化活性，且起到鎮咳和祛痰等作用[11—12]；1，3-O-二咖啡?；崴釣榭Х弱；崴嵫苌?，具有抗氧化活性和自由基清除活性[13]；槲皮素具有祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用，臨床常用于治療慢性支氣管炎[14]；芹菜素的抗氧化性對急性肺損傷具有保護作用[15]。因此，基于網絡藥理學預測結果，結合現有的研究報道，本研究以原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、金絲桃苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、芹菜素為定量控制指標成分，對鼠曲草的質量評價方法展開研究，建立能夠體現鼠曲草整體特征的HPLC指紋圖譜，研究不同產地鼠曲草的質量差異，為鼠曲草的質量控制提供參考。

3.2 色譜條件的選擇

在色譜條件優化方面，本研究比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水等多種流動相及其配比。結果發現，以乙腈-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫時，基線較平穩，色譜峰分離較好。在多波長（245、254、260、288、310 nm）的對比中，實驗發現在310 nm 波長處鼠曲草指紋圖譜中各色譜峰分離良好，峰數較多，故選擇該波長作為檢測波長。同時在相同條件下，比較了Diamonsil、Ultimate XB、PLATISIL ODS 等C18色譜長柱和短柱，最終確定了以乙腈-0.1%磷酸為流動相，以Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱的液相色譜條件。

3.3 指紋圖譜及化學模式識別分析

本研究共指認出10批鼠曲草藥材的9個共有峰，與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明不同產地鼠曲草藥材化學成分較為一致。聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判別分析結果均顯示，湖南衡陽、江西吉安、湖南邵陽、福建閩侯、福建三明產鼠曲草聚為一類，廣西桂林、廣東梅州、江西宜春、四川達州產鼠曲草聚為一類，廣東潮汕產鼠曲草聚為一類。

3.4 質量標志物的篩選及含量分析

本研究共篩選出綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷4 種差異性成分為鼠曲草的潛在質量標志物，對其進行含量測定發現，10批鼠曲草藥材中綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量分別為0.070～7.653、0.010～0.097、0.001～0.036、0.508～6.627 mg/g。其中，綠原酸含量以江西吉安樣品最高，咖啡酸含量以江西吉安及福建三明產地樣品最高，1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量均以廣東潮汕樣品最高。由此可知，這些潛在質量標志物可用于區分不同產地的鼠曲草藥材，可為該藥材質量控制提供參考。

綜上所述，本研究整合網絡藥理學及指紋圖譜的方法，篩選出綠原酸、咖啡酸、1，3-O-二咖啡?；崴?、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作為鼠曲草的潛在質量標志物，其中綠原酸成分含量以江西吉安產鼠曲草最高，咖啡酸成分含量以江西吉安與福建三明產鼠曲草最高，后兩種成分含量以廣東潮汕產鼠曲草最高。