不同來源外泌體對骨骼發育及骨骼疾病的影響

劉新新,周恩友,安智遠,蔡春霞,張露潔,李建增,李轉見,閆峰賓,康相濤,高延玲,韓瑞麗*

(1.河南農業大學動物科技學院,鄭州 450046;2.神農種業實驗室,鄭州 450002;3.河南農業職業學院,鄭州 451450)

骨骼是人和動物運動系統重要的構成部分,是機體堅硬的支撐結構。骨骼系統具有支撐軀體、保護內臟器官、供肌肉附著和作運動的杠桿等作用,同時骨也是鈣和磷的儲存場所[1],且紅骨髓在成體動物的身體中還能制造血細胞。骨的形成和發育同時進行,在骨的形成發育過程中,外界機械因素、營養因素、病理因素及遺傳性[2]等都可能會引起骨代謝紊亂,導致骨代謝疾病的發生。骨骼疾病是多種骨與關節病的一個總稱,臨床常見的有骨質疏松癥(osteoporosis,OP)、骨關節炎(osteoarthritis,OA)、股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)、脛骨軟骨發育不良(tibial dyschondroplasia,TD)和肢體內外翻畸形(valgus-varus deformity,VVD)等。在畜禽生長過程中,骨骼疾病尤其是腿部骨骼疾病不僅造成骨強度和骨密度的降低,還會影響采食、飲水等基本行為,導致機能及生長性能水平顯著下降[3],進而影響動物福利和經濟效益。

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)包括外泌體、微囊泡和凋亡小體,幾乎由所有類型的細胞產生和釋放。EVs的大小、性質和分泌途徑取決于原始細胞[4],不同細胞來源發揮的功能也不同。其中,外泌體(exosome,exo)的脂質雙層膜結構可以使其內容物免受溶酶體降解,從而可以在相鄰和遠端細胞之間傳遞蛋白質和遺傳信息。

外泌體來源廣泛,一方面,它可由多種細胞產生,如間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)[5]、巨噬細胞[6]、內皮細胞[7]、免疫細胞[8]、樹突狀細胞[9];另一方面,外泌體幾乎存在于所有體液中,如血漿[10]、尿液[11]、腹水[12]、乳汁[13]、精漿[14]等都能檢測到外泌體的存在。外泌體也因來源廣泛、更穩定、易保存、可人為調節用量等優點,攜帶miRNA通過旁分泌的形式,介導某些信號通路的表達,進而調控骨代謝以及參與骨骼疾病的診斷與治療。

外泌體中包裹的含有與細胞來源相關的蛋白質、mRNA和非編碼RNA(miRNAs、lncRNAs、circRNAs)等,其內含物的種類和數目由遺傳基因和所處的內環境兩方面決定。外泌體被釋放后主要通過旁分泌的方式以受體細胞內吞、受體-配體介導的胞吐以及與受體細胞膜融合這3種形式將內容物exomiRs釋放作用于受體細胞,進入受體細胞的exomiRs與mRNA靶基因結合,從而調控靶基因的降解或抑制其翻譯過程[15],進而參與相關疾病的發生與治療。有報道,外泌體也是“無細胞”再生醫學關注的熱點[16]。

1 外泌體的結構和功能

外泌體,單層膜,是一類直徑在40～160 nm之間胞內形成的微小囊狀結構,由細胞膜雙層內陷形成胞內多泡體(multivesicular bodies,MVBs),成熟的MVBs與細胞膜融合,將囊泡釋放到胞外形成外泌體[17]?？赏ㄟ^細胞外刺激、微生物攻擊和其他應激條件的誘導而產生,其含有細胞特異的蛋白質、脂質、miRNA和lncRNA等這些物質可以作為信號分子參與細胞間的信息傳遞。外泌體本身具有高度異質性,且其異質性根據其大小、含量(載物)、對受體細胞的功能影響以及細胞來源會出現差異,具備不同的功能。隨著外泌體研究的不斷深入,已不僅僅限于各種腫瘤疾病的診斷與治療、臨床藥物遞送載體以及醫學美容等領域[18-20],同時在骨骼系統、神經系統等疾病中有廣泛應用。近年來研究發現,外泌體具有良好的骨特異性和強大的骨再生能力使得其擁有潛在治療價值,可增強骨骼的生長發育和治療臨床骨疾病[21]。以下將介紹不同來源的外泌體對骨骼生長發育以及骨骼疾病中的影響。

2 細胞來源的外泌體在骨骼發育與骨骼疾病中的應用

2.1 間充質干細胞源性外泌體

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新、再生、分化和修復功能,有多種來源的多能基質干細胞,其再生潛力及其免疫調節能力在骨損傷的修復和治療中顯示出巨大的前景[22]。常見的MSCs一般是從骨髓、脂肪、臍帶、臍血等組織提取,并具有很好的離體增殖能力、自我更新及多向分化能力,因此常用間充質干細胞來源的外泌體作為載體(如包裹藥物)或攜載miRNA、蛋白質等來探究外泌體及內容物在骨骼發育及骨骼疾病中的診療機制。有研究發現,MSCs外泌體含有無活性的糖酵解酶和產ATP的酶,這些酶似乎可通過外泌體的轉移來補償人OA中線粒體功能障礙,提高軟骨缺損修復能力,使軟骨再生[23]。

2.1.1 骨髓間充質干細胞源性外泌體 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)除具有間充質干細胞的功能外,還可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪生成譜系等,促進骨形成和骨再生[24]。BMSCs是新骨形成的關鍵成分,BMSCs的成骨分化過程受多個信號通路和基因的調節,可以通過其細胞來源的外泌體轉運miRNA調控靶基因表達,介導成骨通路參與一些骨病的發生與治療。研究發現,BMSCs的外泌體運輸miR-424-5p通過調節WIF1介導的wnt/β-catenin軸減弱成骨,從而過表達WIF1部分逆轉BMSCs來源的外泌體在骨質疏松癥患者中的成骨作用,即促進成骨作用[25]。BMSCs來源的外泌體攜帶miR-935,通過靶向STAT1促進成骨細胞增殖和分化,從而減輕了大鼠的骨質疏松癥癥狀[25]。有研究發現,關節內注射骨髓來源的間充質干細胞可增強膝關節骨關節炎的再生,而BMSCs通過旁分泌信號機制和可溶性營養因子(包括骨形態發生蛋白-2(BMP2)和胰島素樣生長因子-1(IGF1))的分泌促進修復[26]。目前,畜禽BMSCs分離鑒定技術逐漸完善,也推動了從骨髓間充質干細胞本身到其來源的外泌體在畜禽骨骼生長發育與骨骼疾病尤其是腿部骨骼疾病中的研究。

2.1.2 脂肪間充質干細胞源性外泌體 骨骼和脂肪在功能上相互聯系,共同調節機體“骨-脂”代謝穩定。最新研究表明,外泌體作為一種細胞外囊泡可攜帶多種生物活性分子,在“骨-脂肪 Crosstalk”(即骨與脂肪間存在交互作用的關系)中發揮關鍵調控作用[27]。脂肪間充質干細胞(adipose mesenchymal stem cells, ADSCs)是存在于脂肪組織中具有多向分化和自我更新能力的一種間充質干細胞,相比于骨髓、血清、臍帶血等間充質干細胞來源,ADSCs所分泌的外泌體因其具有來源豐富、提取便捷以及創傷較小等優點,已在再生醫學領域受到了極大的關注[28]。ADSCs作為細胞治療和再生領域最有前途的工具之一,由其衍生的外泌體攜帶不同的蛋白質和miRNAs等參與多種生物過程?；蛞耘苑置诘男问结尫偶毎蜃拥任镔|促進骨骼修復,進而預防和改善骨質疏松等疾病[28-29]。此外,最新研究表明,ADSCs-exo與基因修飾技術和組織工程技術的結合,可增強成骨細胞活性以及加速骨的再生[30],為外泌體作為基因遞送載體的應用奠定了基礎,極大地推動了ADSCs-exo在骨的生長發育與骨質疏松等骨骼疾病治療中的應用。

2.1.3 其他間充質干細胞源性外泌體 除了骨髓和脂肪間充質干細胞來源的外泌體在骨骼系統上的較多應用外,也有其他間充質干細胞來源的外泌體被應用,如臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)、滑膜間充質干細胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)等。有研究發現,UCMSCs(憑借其強大的自我更新和分化能力)已被證明對軟骨損傷有治療作用,前期發現lncRNA H19是介導臍帶間充質干細胞外泌體調控軟骨細胞活性的重要活性分子,并反向驗證了 H19-Exos 是通過 TGF-β1/Smad3 通路促進軟骨細胞的增殖和再生[31]。以及SMSCs外泌體來源的長鏈非編碼RNA(lncRNA) SNHG14(SMSC-EXO-SNHG14)在骨關節炎(OA)中具有促進軟骨合成和修復的潛在作用。不同來源外泌體的靶向性和功能可能有所不同,除干細胞來源外,也有研究證明,MSCs來源外泌體的骨靶向性要比成骨前體細胞(MC-3T3-E1)、乳腺癌細胞(4T1)和腎上皮細胞(293 T)的更強,有更好的促組織修復能力,因此,MSCs來源的外泌體多用于骨代謝相關細胞的活性調控以及多種類型的組織修復與再生[32]。

2.2 非干細胞源性外泌體

間充質干細胞靠本身強大的自我更新與分化能力被應用于眾多領域。但此外,成骨細胞[33]、破骨細胞[34-35]、骨細胞、軟骨細胞[36]、巨噬細胞[37]、癌細胞[38]、內皮細胞[39]等來源的外泌體也在骨的生長、修復和再生過程中發揮著關鍵作用。有科學家發現,不同細胞來源的外泌體在參與骨骼發育與骨損傷等生理病理過程時,其生理病理蛋白聚集物通過外泌體從組織細胞中釋放出來,進而調控骨組織周圍微環境。此外,外泌體包含的miRNA通過上調或下調成骨相關基因介導相關信號通路,調節成骨細胞或破骨細胞活性,平衡骨形成和吸收,參與骨重塑和骨再生過程。

3 體液來源的外泌體在骨骼發育與骨骼疾病中的應用

外泌體不僅可以由幾乎所有類型細胞分泌,也廣泛存在于體液中,如血漿、尿液、唾液、母乳、精液和腹水等。先前研究中,外泌體具有在疾病侵襲機體時數量增加、在體液中穩定存在且易獲取、不易被酶解的特點,因而可通過外泌體分泌和轉移大部分腫瘤標志物[40]以及基因或藥物的有效載體[41]。目前已經發現,體液中的外泌體已成為多種疾病如類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)、ONFH、OA的生物標志物,可用于疾病的診斷[42]。近年來,不同體液來源的外泌體再生療法成為促進骨骼生長與再生的研究熱點,在骨骼發育與相關疾病中發揮重要作用?；谕饷隗w可以包裹多種具有生物活性的核酸分子,如miRNAs、mRNAs等,當發生疾病或處于病理狀態時,外泌體中各種成分的組成可發生明顯的改變,因此,可通過調控外泌體中miRNA的表達來促進或抑制成骨細胞的增殖和分化,調控骨生成,進而參與骨骼發育與相關疾病的發生與治療。

3.1 血漿來源外泌體

血漿外泌體miRNAs不僅限于癌癥領域,在RA[43]、OA、膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)[44]等疾病中也逐漸有研究應用。有很多研究均提示,外泌體特異性miRNA水平與疾病的發生和發展存在密切關聯。外泌體miRNA是參與骨重建的重要因子,能在細胞之間傳遞生物學信息,對基因的表達起著重要的調控作用[45]。最近的研究表明,通過將小檗堿包封在源自富血小板血漿的外泌體中,通過wnt/β-catenin途徑促進骨髓間充質干細胞的軟骨分化,為軟骨重建提供了新的見解[46]。此外,通過輻射調節外周血漿外泌體中與成骨和氧化相關的miRNA的表達,可影響骨代謝和再生的方式,介導成骨方式[47]。也有研究證實,miR-26b-3p在特發性身材矮小(ISS)血漿外泌體中的過表達可抑制AKAP2/ERK1/2軸導致生長板軟骨的增殖和軟骨內骨化障礙,從而誘導ISS[48]。

3.2 尿液來源外泌體

目前,尿液來源的外泌體主要在腎病患者或膀胱癌等癌癥疾病中應用較多,大多數作用方式為參與一些信號通路介導癌細胞的生長與凋亡,進而對疾病進行診斷和治療。而在骨骼發育與骨骼疾病方面應用很少。有報道,將人尿源性干細胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)過表達miR-1-1p的外泌體處理大鼠KOA模型,結果表明hUSCs-exo處理KOA模型的軟骨細胞增殖和遷移能力增強,細胞凋亡受到抑制,促進了軟骨再生和軟骨下骨重塑,且hUSCs-exo過表達miR-140-5p相比干細胞來源外泌體本身治療OA更具有優越性[11]。尿液外泌體中還有一些特有蛋白質,如水通道蛋白1、銅綠菌素、尿調節蛋白、前列腺干細胞抗原等,主要作為檢測體液的生物標志物[49-50]。

3.3 其他來源外泌體

研究表明,乳源性外泌體可參與代謝過程、發育過程、免疫系統過程,與生物粘附和細胞增殖有關,可以促進腸道上皮細胞的活力,增強其增殖能力,并刺激腸道干細胞的活性,以及通過外泌體運輸母乳中miRNA來影響嬰兒的生理功能發育,如糖脂代謝、腸道、神經發育、免疫功能發育、表觀遺傳學和嬰兒疾病防治方面[51-52]。唾液來源的外泌體既可作為口腔疾病(如口腔癌)的理想標志物,也用于參與調控損傷修復過程中的炎癥反應,促進損傷部位的組織修復[53-55]。精液外泌體中包含的附睪體相關蛋白質、前列腺體相關蛋白質在精子成熟中起著不可或缺的作用[56]。子宮內膜異位癥患者腹水外泌體中相比對照組存在5種特異性蛋白質,因此腹水來源的外泌體中蛋白質的鑒定為疾病的診斷和研究開辟了新途徑[57]。在羊水外泌體中Let-7 d-5p可能通過調節BACH1表達促進唐氏綜合征胎兒大腦中的氧化應激[58]。布魯氏菌感染病人的汗液外泌體較唾液外泌體、尿液外泌體及血漿外泌體有5種共同的蛋白和896種獨特的蛋白質,作為精神分裂癥、老年癡呆癥和外胚層發育不良的生物標記物[59]。但以上體液來源的外泌體在畜禽骨骼發育與骨代謝方面目前還無過多研究。

4 展 望

近年來,外泌體的應用取得了諸多進展,尤其在骨骼修復與再生方面。外泌體憑借其來源廣泛、穩定易保存,可以人為地改變其內容物的種類和數量,且無活細胞,因此可以避免因細胞過度增殖而放大療效或癌變,以及有可能避免某些針對間充質干細胞調控問題的出現,因此外泌體有代替間充質干細胞等細胞發揮作用的趨勢,其攜帶的miRNA或蛋白質等通過旁分泌介導某些信號通路,參與骨骼發育、抑制炎癥反應、組織修復與再生等。

綜上,不同來源外泌體在疾病治療方面有頗多研究,如間充質干細胞來源的外泌體在心臟、肺、腦、肝臟、皮膚、腎臟等多個方面均具有治療效果。在骨骼方面不僅調節骨骼代謝,也參與骨重塑、骨骼疾病的發生與治療以及在全身內環境、關節腔環境中發揮重要作用。外泌體及其內容物在畜禽遺傳育種上已有不少應用,如豬上防止組織損傷、促進組織新生,促進生長發育與繁殖等;牛上促進個體生長發育,參與體內免疫平衡等;家禽上促進子代的生長發育,參與免疫應答與感染,以及妊娠羊上也有應用。而在畜禽骨骼領域,大多研究集中在飼料添加劑(Ca、P、微量元素、抗營養因子、中藥等)、不同日齡與生長環境以及與骨骼相關的基因、miRNA、mRNA、circRNA、蛋白等對骨骼的影響與作用機制,外泌體相關研究較少。因此,外泌體及其內容物在畜禽骨骼生長發育與骨骼疾病方面具有很大的應用潛力,為畜禽骨骼領域的研究奠定基礎。