共刺激信號與心血管疾病的研究進展

都昌樂 王瑜 梅仁彪 （安徽理工大學醫學院基礎醫學系，淮南 232001）

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）在全球發病率和病死率百余年都居高不下，是世界重要的公共衛生問題。CVD包括原發性高血壓（essential hypertension，EH）、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、免疫性心肌炎（autoimmune myocarditis，AM）和心肌梗死（myocardial infarction，MI）等疾病。研究表明 T細胞的免疫失調會造成脂質顆粒和炎癥細胞因子在血管內沉積，使血管結構異常并引起血管重塑，這是CVD發病的潛在病因［1］。共刺激信號作為T細胞活化的第二信號，在T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）與抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）經主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）-抗原肽相互作用提供抗原刺激后，通過 APC表面共刺激配體與T細胞表面同源受體結合參與T細胞激活并決定T細胞后面的免疫反應，若無共刺激信號T細胞會進入無能狀態甚至發生凋亡［2］。共刺激信號按照功能特性可分為正、負性信號，介導正性信號的共刺激分子主要有CD28、ICOS、CD27、OX40等，介導負性信號的主要有CTLA-4、PD-1、TIM-3等。正性信號促進T細胞活化，而負性信號向激活的T細胞提供抑制信號，因此了解共刺激信號在CVD的作用或許能為治療該疾病帶來希望。

1 正性共刺激信號

1.1 CD28介導的共刺激信號 CD28為Ⅰ型跨膜糖蛋白，其胞質尾區擁有兩個基序：YMNM和PYAP。CD28與其配體CD80/CD86結合后與TCR形成微簇并磷酸化基序中的酪氨酸殘基，近端YMNM基序與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的調節亞基p85相結合啟動蛋白激酶B（protein kinase B，AKT），AKT一方面激活下游靶點核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）促進T細胞活化；另一方面促使哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）上調葡萄糖轉運蛋白表達，增強T細胞攝取葡萄糖從而加速T細胞代謝。遠端基序PYAP與淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte cell-specific protein-tyrosine kinase，LCK）和生長因子受體結合蛋白2（growth factor receptor bound protein 2，Grb2）結合增強T細胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）核易位并誘導IL-2的產生促進T細胞增殖［3-4］。最新研究表明位于CD28跨膜結構域的YxxxxT基序可在T細胞表面穩定CD28二聚體的表達，從而協助TCR信號促進CD28與配體的結合，因此CD28中3個不同的基序共同參與了共刺激信號的誘導［5］。

1.2 可誘導共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）介導的共刺激信號 ICOS的胞質尾區同樣也包含3個不同的基序，而YMFM基序的研究較為廣泛。該基序在ICOS與配體ICOSL結合后，招募PI3K中調節亞基p85與T細胞表面受體酪氨酸結合使酪氨酸磷酸化，促使PI3K將催化亞基p110募集到細胞質膜并激活，隨后二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol diphosphate，PIP2）被激活后的亞基p110磷酸化生成三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3），PIP3可激活AKT磷酸化FOXO轉錄因子（可抑制生長因子生成，促進凋亡分子表達）并將其輸出至細胞核外通過結合14-3-3蛋白降解失活，最終促進Tfh細胞分化和IL-2、IL-17A釋放［6-7］。

1.3 CD27介導的共刺激信號 CD27為糖基化的跨膜蛋白，其天然配體為CD70。當樹突狀細胞（dedritic cell，DC）收到來自CD40和病原體受體的信號后會上調CD70的表達，此時CD27與配體CD70結合并招募腫瘤壞死因子受體相關因子（TNF receptor-associated factor，TRAF），TRAF能通過NF-κB途徑激活CD8+T細胞，同時上調抗凋亡因子（如BCL-1和BCL-XL）和細胞因子受體（IL-21Rα和IL-ZRβ）表達，提高CD8+T細胞對細胞因子的敏感性［8］。另外該信號還能促進c-Jun N端激酶的激活（JNK），增強轉錄因子T-bet表達并刺激CD4+T細胞分化為能產生IFN-γ的Th1細胞，增強免疫效應［9］。

1.4 OX40介導的共刺激信號 腫瘤壞死因子受體OX40具有4個富含半胱氨酸的結構域，與其天然配體OX40L結合會形成三聚體復合物，而位于OX40胞質尾區的基序QEE招募TARF2、3、5并與NF-κB α亞基和NF-κB誘導激酶相互作用，通過調控NF-κB途徑增強抗凋亡因子的表達。另外OX40信號可通過PI3K磷酸化AKT增加生存素和極光激酶B（Aurora-B）表達，這兩種蛋白質可促進細胞周期蛋白依賴性激酶活性，使細胞周期G1期到S期順利進行，維持T細胞的有絲分裂［10］。

1.5 其他正性共刺激信號 4-1BB分子能與配體結合后形成復合物并聚集于T細胞的胞質尾區，招募TRAF相關因子激活NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等多種遠端信號分子，調節細胞周期蛋白和細胞周期性蛋白激酶促進細胞周期循環［11］；死亡受體3（death receptor 3，DR3）在與配體結合后其內部的死亡結構域構象會發生改變，從六螺旋束結構變為松散折疊的開放結構［12］。從而更好地與TNFR死亡結構域（TNFR-associated death domain，TRADD）的N末端相互結合，募集TRAF2-受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）復合物并激活MARK和NF-κB信號通路促進T細胞的增殖活化［13］。

2 負性共刺激信號

2.1 細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）介導的共刺激信號 CTLA-4具有高度內吞性，主要以二聚體的形式存在于細胞內囊泡中，因此在CD28與配體CD80/86結合后，囊泡內的CTLA-4會以胞外分泌的方式向TCR結合位點定向移動，而位于其胞質域內YVKM基序會和網格蛋白相關的銜接蛋白復合物AP-2中的m2亞基相結合將CTLA-4保留在細胞表面。同時初始化T細胞分泌溶酶體使CTLA-4表達上調并與配體CD80/86結合，而胞質尾區的YVKM基序便與含有SH2結構域的酪氨酸磷酸酶2（SH2 domain-containing tyrosine phosphatase 2，SHP2）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）相互作用使TCR-CD3ζ復合物去磷酸化，減弱TCR信號傳遞［14］。CTLA-4信號還可中斷T細胞中70 KDaζ鏈相關蛋白（70 kD zeta-chain associated protein，ZAP-70）的形成，使細胞內鈣釋放機制受到影響抑制細胞周期的進展和相關因子的產生［15］。

2.2 PD-1介導的共刺激信號 程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）胞質尾區的N端與C端氨基酸殘基有兩個磷酸化位點，分別是免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibition motif，ITIM）和免疫受體酪氨酸開關基序（immunoreceptors tyrosine-based switch motif，ITSM），而PD-1的抑制功能主要依賴于ITSM［16］。PD-1信號激活后會磷酸化T細胞內酪氨酸并將SHP2募集到其C末端的ITSM中，結合SHP2的ITSM基序去磷酸化CD3ζ和ZAP-70并使其失活，導致PI3K-AKT信號傳導受到抑制，TCR相關的下游信號如RAS-MEK-細胞外信號調節酶途徑也因此減弱，從而下調抗凋亡因子BCL-XL的表達促進T淋巴細胞的凋亡［17］。同時PD-1增強堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子ATF樣蛋白（basic leucine zipper transcription factor ATF-like，BATF）表達，BATF能與Jun蛋白結合形成BATF/Jun異二聚體，抑制轉錄因子信號，負性調控AP-1介導的免疫反應，抑制T細胞功能［18］。

2.3 T細胞免疫球蛋白3（T cell immunoglobulin-3，TIM3）介導的共刺激信號 TIM3的胞外域由膜遠端N末端免疫球蛋白結構域組成，但TIM-3的胞質尾區沒有ITIM和ITSM基序。因此在與對應配體結合后，TIM-3的兩個酪氨酸殘基Y256和Y263會被磷酸化致使轉錄因子Bat3從TIM3胞質尾區釋放并與含有SH2結構域的Src激酶（如Fyn蛋白）結合并募集到TIM3上，Fyn蛋白能夠激活鞘糖脂微結構域相關磷酸化蛋白（phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains，PAG）的關鍵激酶，抑制LCK活性使TCR信號受阻［19］。

2.4 B和T淋巴細胞衰減因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）介導的共刺激信號 BTLA的胞質尾區擁有Grb2識別基序YDND、ITIM和ITSM 3個保守基序，其中ITIM基序在BTLA結合配體后能夠激活酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2，使酪氨酸脫磷酸化從而抑制PI3K信號途徑，阻礙T細胞活化；另外BTLA被激活后還能募集蛋白酪氨酸激酶Sky使其磷酸化從而弱化B細胞接頭蛋白表達，減弱BCR信號強度抑制B細胞增殖和細胞因子的釋放［20］。近期研究發現YDND基序可通過結合Grb2蛋白與PI3K亞基p85相互作用來增強PI3K信號，促進T細胞存活，這說明BTLA可能具有雙向信號調節作用［21］。

2.5 其他負性共刺激信號 淋巴細胞激活基因3（lymphocyte activation gene-3，Lag-3）胞質尾區的KIEELE基序能抑制TCR誘導的鈣通量，使T細胞功能受損，但目前并未發現與該基序結合的相關蛋白，故其下游信號通路尚不清楚［22］。T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域（T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT）介導的負性信號主要抑制NK細胞功能，TIGIT中ITT樣基序與Grb2蛋白結合募集SHP1，抑制PI3K和MAPK信號通路。另外ITT樣基序還能進一步與β抑制蛋白2結合誘導SHP-1破壞TRAF6自然泛素化與NF-κB活化，使NK細胞無法發揮免疫效應［23］。見圖1。

圖1 主要正負性共刺激信號傳導機制圖Fig.1 Mechanism of main positive and negative co-stimulation signal transduction

3 正負性共刺激信號與心血管疾病

3.1 正負性共刺激信號與EH EH是一種多因素疾病，雖然發病機制復雜，但免疫細胞介導的先天免疫和適應性免疫在EH的發展中起到關鍵作用，共刺激信號能通過調節T細胞功能參與EH的病理過程。TORAL等［24］通過將原發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）的糞便微生物群移植到維斯塔爾大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）中發現，CD28信號受阻會抑制WKY大鼠體內T細胞表面激活物整合素α4（integrin alpha 4，ITGA4）和趨化因子受體CCR9的mRNA轉錄水平，導致T細胞無法活化。同時該大鼠主動脈瓣的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性也會減弱，血管內皮舒張功能改善緩解EH癥狀。錢小寶等［25］也發現在SHR大鼠的腎臟損傷機制中ICOS信號表達與炎癥因子IL-17A、TGF-β分泌呈正相關，這說明ICOS信號可能通過介導Th17細胞在EH中發揮重要作用。CD27信號能促進效應記憶性T細胞在野生型高血壓小鼠腎臟周圍浸潤并釋放IFN-γ使近端小管上皮細胞產生血管緊張素原，增加腎小管對鈉的重吸收［26］。同時該信號還刺激血管產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起血管功能障礙使血壓升高。

相反，負性共刺激信號可遏制EH癥狀的繼續發展。PD-1負性信號能夠增強Treg細胞穩定性并促進Treg細胞分化，研究發現高血壓患者體內的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞逐漸下降，而PD-1信號可以增強Foxp3 mRNA的表達并促進Treg細胞分泌抗炎因子IL-10，改善動脈舒張功能、減少局部炎癥并抑制NADPH氧化酶活性從而降低血壓［27-28］。此外在王億平等［29］研究中也發現參地顆?？稍鰪娔I炎大鼠體內CTLA-4信號，抑制炎癥因子對腎臟的進一步損害，從而防止高血壓的發生。另外在最近一項關于森林浴的健康報告中，冬季森林浴可通過提高TIM-3信號表達來調節免疫平衡機制，從而緩解因針對冬季常見病原體的免疫防御而做出的適應性應答，使血壓降低［30］。

3.2 正負性共刺激信號與AS AS是一種血管壁慢性炎癥疾病，主要特征是炎癥反應和脂質代謝失衡［31］。研究表明OX40信號可在TRAF2的介導下激活NF-κB通路釋放ROS，刺激淋巴細胞產生細胞周期蛋白A（cell growth and Cyclophilin A，CyPA）并使血管平滑肌細胞遷移引起血管重塑形成AS斑塊；阻斷OX40信號可抑制T細胞分泌IL-5，造成OXLDL特異性IgM抗體減少并誘導ldlr-/-小鼠AS退化［32］。4-1BB也可作用于T細胞并促使CD8+T細胞在AS早期血管內膜浸潤并長期滯留血管中，其產生IFN-γ而引發慢性炎癥［33］。CD27信號在AS中則起抑制作用，這主要因為CD27信號能提高巨噬細胞代謝功能，加強巨噬細胞攝取膽固醇的能力，此外CD27信號還能促進促炎癥LY6Chi單核細胞凋亡來減輕AS癥狀［34］。對于ICOS信號，GOTSMAN等［35］發現在給ICOS缺陷型小鼠高膽固醇喂食數周后，該小鼠體內平滑肌蛋白和膠原蛋白沉積，CD4+T細胞增殖并分泌大量炎癥因子引發炎癥反應。ZHONG等［36］在體外實驗也證實ICOS信號能減少人主動脈平滑肌細胞吞噬作用，具有抗AS效應。但CLEMENT等［37］發現CD8+Treg細胞可調控Tfh細胞釋放炎癥因子，而在載脂蛋白E缺乏（Apoe-/-）小鼠體內CD8+Treg功能受損會導致AS進一步惡化，阻斷ICOS信號能恢復CD8+Treg細胞對Tfh-GC-B細胞軸的控制，使AS發展減緩。這表明ICOS信號在AS中或許具有雙向調控功能。

負性信號在AS中同樣發揮重要作用，研究表明在高膽固醇血癥CTLA-4轉基因小鼠體內CTLA-4信號能夠降低T細胞增殖能力，抑制促炎因子釋放，預防主動脈部粥樣硬化；阻斷CTLA4信號會使細胞間黏附因子1（cell adhesion factor-1，ICAM-1）過表達，使得免疫細胞向血管炎癥部位募集加速AS斑塊形成［38］。PD-1信號與TIM-3信號具有聯動作用，QIU等［39］在AS患者血液中發現PD-1與TIM3能在CD8+T細胞共同表達，而呈現雙陽性的CD8+T細胞能分泌更多的抗AS細胞因子如IL-10等，并且PD-1與TIM3信號受阻會進一步提升促炎癥Th1細胞免疫反應在AS的主導地位。此外TIM3信號還能抑制NF-κB通路減少血小板衍生因子誘導的IL-6和TNF-α的釋放［40］。BTLA負性信號也具有抗AS效應，DOUNA等［41］發現刺激ldlr-/-小鼠中BTLA信號能減緩AS早期的發展，這也許是BTLA信號加速了小鼠血液中濾泡B2細胞的凋亡，同時脾臟B細胞群體會富集大量抗AS的邊緣區B細胞和調節性B細胞釋放IL-10。綜上所述，正負共刺激信號在AS中作用復雜，因此需要更多的研究來確定刺激或抑制共刺激信號在AS中的聯合療法。

3.3 正負性共刺激信號與AM AM是誘發心力衰竭的重要因素，該疾病的特征是炎癥細胞浸潤到心肌中致使心臟部分功能受損［42］。國外學者利用實驗性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）模型研究人類免疫性心肌炎的過程中發現，與正常大鼠相比EAM大鼠脾臟與心臟中ICOS/ICOSL分子表達增強，阻斷ICOS信號后一方面能遏制炎癥細胞浸潤心肌組織；另一方面還會抑制T細胞活化，其分泌的相關炎癥因子IFN-γ、TNFα等也相應減少。而且在免疫應答階段ICOS信號受阻可減緩EAM的發展，但在抗原引發階段阻斷ICOS信號不會產生此效果，說明ICOS信號可能會引起免疫失衡從而促進AM發展［43］。類似作用還包括4-1BB信號，該信號能夠同時激活MAPK和 NFκB信號通路分別促進NF-κB和AP-1蛋白介導的轉錄，其轉錄的基因能促進Th1型細胞增殖分化及炎癥的發生［44］。

負性信號能夠阻滯AM病理過程中心肌細胞損傷。例如PD-1信號可防止心臟抗原反應性CD4+T細胞擴增造成的炎癥，而纖維蛋白原樣蛋白2（fibrinogen-like protein 2，Fgl-2）過表達會中斷PD-1信號并在轉錄水平上影響Th17細胞分化促進IL-17的分泌，破壞Treg細胞免疫抑制功能導致心肌功能惡化［45］。最新研究也顯示配體PD-L2缺乏會加速心肌肌球蛋白肽誘導的心肌炎癥并促進CD4+T細胞增殖，這說明PD-1信號在限制心臟T細胞反應中起重要作用［46］。同樣對Th17細胞產生抑制效應的還包括CTLA-4信號。采用抗CTLA-4抗體治療野生型小鼠會誘發嚴重的AM，其心臟遭到大量CD3+T細胞浸潤，而大部分細胞均呈IL-17陽性，用中和性抗IL-17抗體處理CD28-/-小鼠可顯著減緩EAM發展，這表示CTLA-4信號可控制Th17細胞應答調節CD28-/-小鼠對EAM的敏感性［47］。正負性共刺激信號對免疫性心肌炎的調控可能通過Th細胞的應答機制而發揮作用。

3.4 正負性共刺激信號與MI及心臟重塑 冠狀動脈閉塞是引起MI的主要因素，脂質動脈粥樣硬化斑塊破裂會形成血栓造成心肌區域缺血并導致心肌細胞壞死，隨后引發炎癥和心臟重塑機制［48］。共刺激信號通過與免疫細胞的相互作用在MI及心臟重塑中發揮不同的功能。KUBOTA等［49］將小鼠左冠狀動脈永久結扎并將其CD28基因敲除發現與對照組小鼠相比，CD28-/-小鼠MI后心肌破裂概率增加，并且該小鼠左心室收縮功能降低，體內α-SMA陽性肌成纖維細胞減少，MMP-9和IL-1β的mRNA表達顯著增加，說明CD28信號丟失后會導致心室重塑并造成心臟破裂。但最近研究顯示用E18mAb阻斷CD28信號會減少心臟梗死區單核細胞/巨噬細胞以及心肌中T細胞的浸潤，并且增加精氨酸酶活性促進膠原合成加快心肌愈合［50］。因此關于CD28信號在MI中具體作用還需進一步實驗證實。CD27信號在MI中起到抗炎作用，因為該信號受阻后不僅會誘導心肌細胞凋亡，還會募集中性粒細胞和巨噬細胞對心肌組織的浸潤并抑制Treg功能，使炎癥加?。?1］。另外阻斷CD27信號會進一步抑制血管和細胞外基質的生成，導致MI病理過程加重并引發隨后的心臟重塑。

PD-1信號、CTLA-4信號和Lag-3信號等負性信號均在MI中起到保護抑制作用。在一項關于高密度脂蛋白與心血管疾病相關的評估中指出，有高脂蛋白血癥的患者其血漿Lag-3蛋白質表達水平低會增加MI的風險，可能是因為缺乏Lag-3信號會減少脂筏形成與磷酸信號傳導導致炎癥因子異常分泌，引起免疫失衡，這也是MI患者的特征之一［52］。GANG等［53］在研究急性MI患者的外周血時，發現患者血液中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B等炎癥因子異常增高，進一步研究推測CD4+T細胞分泌的IL-9下調了CTLA-4信號導致CD8+T細胞的細胞毒性增強從而加速MI進程。而在對MI患者進行冠狀動脈再灌注治療中發現PD-1信號在治療前幾小時內升高，之后急劇下降，CTLA-4則在整個過程維持低水平，qRT-PCR結果顯示大面積梗死患者PD-1與CTLA-4的mRNA表達顯著低于梗死面積小的患者［54］，由此推斷這兩個負性信號在MI患者梗死面積和免疫調節中具有潛在保護作用。

4 總結與展望

目前全球CVD患者的數量不斷增加，但關于該疾病的療法仍舊是世界難題。共刺激信號作為人體維持免疫穩態的重要調節機制，已經成為調節免疫系統產生促炎或抗炎的靶位。大量實驗數據也表明共刺激分子可以作為生物標志物并在CVD的發病機制中發揮重要作用，阻斷正性共刺激信號可能會緩解CVD的進展，相反刺激正性信號或抑制負性信號會引起免疫過激反應惡化CVD病理過程。因此研究新型正性共刺激信號阻滯劑可能是未來治療CVD的新靶點。但正性信號的阻斷也會引起人體免疫功能減弱容易遭受病菌感染，由此而引發的免疫相關的副作用也為這種免疫治療帶來巨大的挑戰。所以還需持續關注共刺激分子家族的信號傳導以及該信號如何介導特定的分子與細胞免疫成分來影響心血管相關疾病，為治療此類疾病提供新的思路與依據。