MicroRNA調節免疫性血小板減少癥CD4+T細胞亞群免疫功能的研究進展

宋輝 郭一慧 許家威 曾清，2 程緯民，2

（1.廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530222； 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院血液內科，南寧 530023）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是因血小板免疫性破壞增加與生成受阻，導致血小板減少的出血性疾病，以皮膚、黏膜及內臟出血等為特征，是一種自身免疫性疾?。?］。ITP在成人中通常是慢性過程，而在兒童中，大多數患者呈急性發展，但病程較短，自然緩解發生在6個月內。糖皮質激素是ITP的一線治療用藥，部分對激素治療敏感性低的ITP患者，存在IL-10的相對減少和致病性IL-17的持續性表達，這與CD4+T細胞亞群的免疫功能異常有關［2］。隨著對ITP發病機制研究的不斷深入，LIN等［3］發現趨化因子誘導輔助性T細胞（helper T cells，Th）的免疫失衡和調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）的免疫功能缺陷，可能參與ITP的發病機制。微小RNA（microRNA，miRNA）是由20～24個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，通過識別同源mRNA序列和干擾轉錄、翻譯過程來調節靶基因的表達［4］。研究表明，miRNA可能是ITP中CD4+T細胞亞群免疫耐受失常的重要調節因子［5］。因此，本文重點討論ITP中miRNA調節輔助性T細胞1（Th1）/輔助性T細胞2（Th2）失衡、輔助性T細胞17（Th17）/Treg失衡和濾泡輔助性T細胞（thymusdependent lymphocyte，TFH）的作用機制，探索miRNA參與ITP發生發展的相關免疫機制，為ITP免疫靶向治療提供新的啟發。

1 miRNA的調控機制

miRNA轉錄后調控基因的表達，廣泛參與多種生物學過程，如細胞分化、發育、應激反應和生存等［6］。miRNA的轉錄是一個復雜的過程，在細胞核中miRNA基因片段由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，Pol Ⅱ）轉錄后產生初級轉錄本（pri-miRNA），經過Drosha酶切割形成60～70 nt的莖環結構，即miRNA前體（pre-miRNA）。然后，pre-miRNA通過轉運蛋白（Exportin-5）進入細胞質中，經Dicer酶切割莖環產生雙鏈小RNA，隨后雙鏈RNA解體，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA與argonaute-2蛋白結合，裝配形成miRNA誘導沉默復合體（miRNAinduced silencing complex，miRISC）。此時，激活的miRISC通過堿基互補配對原則識別mRNA的3'-UTR（3'-untranslated region，3'-UTR），促進mRNA的翻譯抑制或降解［7］。miRNA特有的調節形式，已經被證明與CD4+T細胞亞群免疫功能的正常執行有關，并且ITP患者存在miRNA的異常表達，提示miRNA可能是ITP發病的關鍵調節因子［8-9］。

2 miRNA調節CD4+T細胞亞群

CD4+T細胞識別主要組織相容性復合體Ⅱ類抗原（major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC Ⅱ）后被激活，在特定的細胞因子（IL-12、IL-25、IL-33、IL-6、TGF-β、ICOS）驅動下，分化為Th1、Th2、Th17、Treg和TFH等亞群，參與ITP的免疫功能調節［10-11］。CD4+T細胞分化過程中阻斷miRNA的轉錄程序，可直接導致CD4+T細胞亞群分化障礙和細胞因子產生異常：①Dicer酶缺失的Th細胞受到T細胞受體信號的刺激減弱，增殖功能降低，并且表現為干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）的優先表達；②Argonaute 2蛋白缺乏時Th細胞產生的細胞因子增多，表明部分miRNA下調后，減弱了抑制Th分化基因的表達；③miRNA的調控機制對Treg及其轉錄因子Foxp3發育具有重要作用，如Dicer酶或Drosha酶特異性缺失的條件下，Treg的免疫抑制功能會受損；④miRNA對TFH發育成熟的關鍵因子B細胞淋巴瘤-6（B cell lymphoma 6，BCL-6）和C-X-C型趨化因子受體-5（C-X-C chemokine receptor 5，CXCR5）具有靶向調節作用［12］。miRNA調控ITP中CD4+T細胞亞群的免疫機制復雜多樣，基于現有研究基礎總結如下：

2.1 miRNA調節 Th1/Th2失衡 Th1/Th2免疫功能失衡是ITP發病的重要因素，Th1介導的免疫應答異常占主導地位，通過分泌不同的細胞因子發揮免疫調節作用［13］。Th1由轉錄因子T-bet特異性調控，主要產生IL-2、TNF-α和IFN-γ，而Th2由GATA結合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）特異性調控，主要產生IL-4、IL-5和IL-10，這些細胞因子的異常表達與ITP免疫調節紊亂密切相關［14］。

ITP患者血液中IL-18與靶細胞表面的IL-18受體（IL-18R）結合，促進T細胞和NK細胞產生IFN-γ，增強Th1的免疫應答，抑制Th2的免疫反應［15-16］。ZHAO等［17］發現ITP患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）來源的miRNA-130a表達下調，能夠增強IL-18的表達，使得Th1免疫應答增強，導致生成IFN-γ和TNF-α超過閾值引起ITP的發生發展。miRNA-130a對IL-18的靶向調節機制，一定程度上解釋了ITP患者IL-18升高和Th1/Th2免疫功能失衡的原因。ITP患兒PBMCs中miRNA-15a的表達明顯下調，并且與IL-2、IFN-γ的含量成反比，與IL-4、IL-10的含量成正比，提示miRNA-15a可能是導致Th1/Th2免疫功能失衡的原因之一［18］。此外，WU等［19］發現miRNA-15a通過靶向調節信號轉導轉錄激活因子-3（signaling transcription activator-3，STAT3），抑制STAT3信號通路的激活，促使Th1分泌的IFN-γ和TNF-α表達水平降低，減輕機體炎癥反應。因此，miRNA-15a可能通過靶向調節STAT3，從而減弱ITP患者Th1的免疫應答，調節Th1/Th2的免疫功能失衡。ITP患者PBMCs中的miRNA-107、miRNA-205-5p、miRNA-138-5p、miRNA-326、miRNA-1827和miRNA-185-5p表達下調，并且能與T-bet和GATA3 mRNA的3'-UTR結合，參與Th1/Th2免疫功能失衡的調節［20］。

2.2 miRNA調節Th17/Treg失衡 Th17/Treg免疫功能失衡是引起ITP的重要機制，Treg通過產生IL-10、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制CD4+T細胞或CD8+T細胞的過度激活和增殖，從而維持機體免疫功能平衡；Th17分泌的IL-17與靶細胞表面的IL-17受體（IL-17R）結合，導致促炎癥細胞因子的釋放增加，二者共同參與ITP的發生與發展［21］。

研究證明，活動期ITP患者CD4+T細胞中的程序性死亡受體-1（programmed cell death 1，PD-1）表達增強，而樹突狀細胞中的細胞程序性死亡配體-1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）表達減弱［22］。此外，ITP患者中分泌型PD-1（sPD-1）表達增加，與PD-L1結合阻斷PD-1/PD-L1通路，導致血小板計數減少，同時在體外實驗中發現了分泌型PD-L1（sPD-L1）激活PD-1/PD-L1通路后PBMCs中IFN-γ、IL-17水平降低，IL-4和TGF-β水平升高，可改善ITP患者Th17/Treg的免疫失衡［23-24］。ITP患者中PD-1/PD-L1通路的激活或抑制對于血小板水平的恢復和Th17/Treg免疫功能的調節具有重要作用。CHANG等［25］發現ITP患者PBMCs中miRNA-155-5p表達上調，并且抑制miRNA-155-5p能激活PD-1/PD-L1通路介導的巨噬細胞M2極化和恢復細胞因子信號轉導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）的表達，從而抑制ITP疾病的發生或進展。此外，GUAN等［26］發現SOCS1通過調節轉錄因子Foxp3和視黃酸受體相關孤兒受體γt（retinoic acid receptor-related orphan receptors γt，RORγt）影響Th17/Treg的免疫平衡。因此，miRNA-155-5p介導PD-1/PD-L1通路和靶向調節SOCS1的作用機制，對于ITP患者Th17/Treg的免疫功能平衡具有重要作用，有可能成為新的治療靶點。

ITP患者CD4+T細胞中的miRNA-99a表達下調，而miRNA-182-5p、miRNA-183-5p表達上調，同時miRNA-99a調節Treg細胞的免疫功能，參與IL-10的表達；miRNA-182-5p、miRNA-183-5p調控Th17細胞的免疫功能，而miRNA-183-5p與血小板計數呈負相關［27］。miRNA-99a通過靶向調節CD4+T細胞中的雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）促進Treg細胞的增殖并抑制Th17的分化［28］。ITP患者miRNA-99a可能通過調節mTOR信號通路影響Th17/Treg的免疫功能失衡，而miRNA-182-5p和miRNA-183-5p參與Th17/Treg免疫失衡機制尚未明確。LI等［29］發現，ITP患者PBMCs中的miRNA-106b-5p表達上調，通過靶向抑制核受體亞家族4-A族成員-3（nuclear receptor subfamily 4 group A member 3，NR4A3）的轉錄活性，引起Foxp3的表達下調，從而減弱Treg的分化，導致Th17/Treg的免疫功能失衡。ITP中抑制miRNA-106b-5p的表達，恢復NR4A3的轉錄活性，促進Foxp3的表達，對于Treg免疫抑制功能的正常執行具有重要意義。

ITP患者CD4+T細胞中母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）抑制miRNA-125a-5p的表達，導致Foxp3表達降低和RORγt表達增加，提示miRNA-125a-5p可能通過干擾Th17/Treg的免疫功能參與ITP發?。?0］。因此，進一步探討MEG3對miRNA-125a-5p的調節機制，可能是揭示ITP患者Th17/Treg免疫功能失衡的重要途徑之一。HE等［31］研究發現ITP患者CD4+T細胞中的IL-1R相關激酶-1（IL-1R-associated kinase-1，IRAK1）表達增加，使得Treg細胞比例減少和Th17比例升高，導致Th17/Treg免疫功能異常。此外，該項研究還發現，ITP患者骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來源的miRNA-146a-5p，通過靶向抑制IRAK1的表達，從而恢復Th17/Treg的免疫平衡。miRNA-146a-5p與IRAK1的相互作用，對ITP患者維持Th17/Treg免疫平衡具有重要意義，有可能成為未來治療ITP的新靶點。

2.3 miRNA調節TFH細胞 TFH細胞是生發中心的CD4+T細胞亞群，能夠協助B細胞產生自身抗體，并且在ITP中表達增加，提示TFH可能參與ITP免疫發病機制［32］。XIE等［33］發現，ITP患者中TFH與血小板膜糖蛋白Ibα（glycoprotein Ibα，GPIbα）抗體表達量呈正相關，提示TFH可能通過誘導血小板抗體的產生，參與血小板破壞。已有研究證明，miRNA通過特定的細胞因子或通路，如CXCR5、E3泛素蛋白連接酶1（pellino E3 ubiquitin protein ligase 1，Peli1）、可誘導性共刺激因子（inducible co-stimulator，ICOS）和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白酶B（AKT）信號通路等，調節TFH的分化和功能［34］。

Peli1調節T細胞受體（T cell receptor，TCR）信號促進T細胞的免疫應答，LI等［35］發現miRNA-153-3p能夠調節Peli1的表達，從而減弱臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）介導的TFH細胞減少和Treg細胞增加。此外，Peli1的缺乏促進了C-rel原癌基因介導的ICOS表達，使得PI3K-AKT信號通路被激活，從而抑制了下游的krüppel樣轉錄因子2（krüppel-like factor 2，KLF2）表達，并且KLF2能抑制TFH的分化［36］。TFH的異常表達是ITP血小板破壞增加的因素之一，miRNA-153-3p調節Peli1/C-rel/KLF2軸控制TFH的分化，有可能揭示ITP的發病機制。ITP患者中BCL-6表達增加，從而促進TFH的分化［33］。CXCR5是TFH分化的關鍵調節因子，YU等［37］發現miRNA-17～92簇抑制了CXCR5的表達，然而BCL-6又能夠抑制miRNA-17～92簇的表達，正向引導TFH的分化。因此，BCL-6、miRNA-17～92簇、CXCR5之間的相互調節關系，可能解釋了ITP中TFH表達上調的原因，為ITP的免疫靶向治療提供啟發。

3 結語與展望

ITP的發病機制與CD4+T細胞亞群分泌的細胞因子失衡密切相關，而細胞因子的分泌失衡是ITP中CD4+T細胞亞群免疫功能紊亂的原因之一。近年來，隨著對miRNA研究的不斷深入，發現miRNA通過不同的靶點或信號通路干擾Th1/Th2、Th17/Treg和TFH的免疫功能，導致細胞因子分泌失衡參與ITP的發病機制（圖1）。但miRNA在ITP患者CD4+T細胞亞群中的表達情況與調節CD4+T細胞亞群免疫功能的機制目前尚未完全闡明。因此，探索miRNA對ITP中CD4+T細胞亞群的免疫調節機制，有助于更深入地闡明ITP的免疫發病機制并為開發ITP的免疫靶向藥物提供依據。

圖1 miRNA調節ITP中CD4+T細胞亞群的免疫機制Fig.1 Immune mechanism of miRNA regulating CD4+T cells subsets in ITP