極端高溫對截形葉螨體內海藻糖含量及海藻糖轉運蛋白基因的影響

羅麗丹，陳嘉明，安琪，劉磊，孫勤哲，劉歡，王森山，宋麗雯

甘肅農業大學植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070

0 引言

【研究意義】截形葉螨（Tetranychustruncatus）屬蛛形綱（Arachnida）、蜱螨目（Arachnoidea）、葉螨科（Tetranyehidea）、葉螨屬（Tetranychus）[1]，其寄主廣泛，在玉米、棉花、蔬菜等重要作物上危害嚴重，是我國北方大部分地區的一種重要害螨[2-4]。葉螨個體小、繁殖快、適應性強，且其在高溫干旱環境下危害程度加重，給農業生產造成了巨大的經濟損失。因此，尋求新的綠色防控策略迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M展】隨著全球氣候變暖，夏季極端氣溫發生頻次增加，田間溫度持續升高，尤其在午時瞬時增溫通常能達50 ℃[5]，這對昆蟲（或螨）適應高溫環境提出了新的挑戰。當昆蟲遭遇高溫時，通常會通過調節行為或生理生化活動來躲避或降低高溫的傷害[6-7]。例如，它們會調節體內抗逆物質以減少高溫脅迫產生的危害[8-10]。海藻糖是昆蟲體內的主要血糖，占血淋巴中糖分的80%—90%[11]。其不僅在昆蟲的生長發育過程中提供能量，也在抵御各種逆境中發揮著重要作用[12-13]。當外界環境或昆蟲的營養狀況發生變化時，昆蟲可通過調節體內血淋巴中的海藻糖濃度來穩定蛋白質構象，保護自身免受逆境影響[14]。海藻糖主要合成部位在脂肪體中[15-16]，其不能直接穿過細胞膜，主要依靠特定的海藻糖轉運蛋白（trehalose transporter，Tret）在細胞間進行轉運。而在較多研究中發現海藻糖轉運蛋白Tret1 在海藻糖轉運過程中起重要作用[17-19]。Tret1 通過調整昆蟲體內海藻糖的分布來抵抗各種逆境，亦直接參與各種抗逆活動，其在昆蟲響應環境脅迫中起著重要作用。例如低溫能顯著提高橢圓食粉螨（Aleuroglyphus ovatus）海藻糖轉運蛋白含量，積累海藻糖，且在低溫脅迫下，其兩個AoTret1顯著上調[20]；在岡比亞按蚊（Anophelesgambiae）中，AgTret1的表達受干燥和高溫的誘導，沉默AgTret1后可降低岡比亞按蚊血淋巴海藻糖水平，使其在干燥或炎熱的環境中更易死亡[21]。同樣，在高溫脅迫下，小菜蛾（Plutella xylostella）體內的PxTret-1表達升高，PxTret-1被敲除后，其脂肪體中海藻糖難以運輸至血淋巴中，因此在高溫脅迫下，小菜蛾成蟲的存活率降低[22]?？梢奣ret在調節機體應對各種逆境活動中具有重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于蛛形綱中Tret的報道較少，Tret1是否在截形葉螨耐受高溫環境的脅迫中發揮重要作用尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】探究截形葉螨TtTret1-like和TtTret1編碼蛋白的理化性質及其在抵抗高溫中的功能，為尋找新型殺蟲（螨）劑靶點和開發綠色農藥提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2023年2—10月在甘肅農業大學植物保護學院完成。

1.1 TtTret1-like 和TtTret1 蛋白序列和系統發育分析

基于截形葉螨三代全長轉錄組測序數據（已上傳至NCBI Sequence Read Archive （SRA）數據庫，登錄號：SRR21659835—SRR21659850），獲取兩個海藻糖轉運蛋白基因TtTret1-like和TtTret1的編碼序列。

采用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預測TtTret1-like 和TtTret1 的理化性質；ProScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析TtTret1-like 和TtTret1 的疏水性/親水性；Conserved Domain Database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和TMHMM2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測TtTret1-like 和TtTret1 的跨膜結構域和保守結構域；利用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）預測TtTret1-like 和TtTret1 的二級和三級結構。選取不同物種Tret1 的氨基酸序列，采用MEGA11.0 軟件中的鄰接法構建 TtTret1-like 和TtTret1 的系統發育樹。

1.2 供試螨源

截形葉螨飼養于甘肅農業大學植物保護學院昆蟲生態養蟲室（溫度24—26 ℃，相對濕度55%—65%，光周期16 h∶8 h（L∶D））的盆栽豇豆植株上。采用雌雄單系（一雌一雄）進行擴繁后，挑取齡期一致的卵（2 000 粒）、幼螨（1 000 頭）、若螨（500 頭）和雌成螨（200 頭）于1.5 mL 無酶離心管中，液氮冷凍后，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 高溫脅迫試驗

高溫脅迫試驗在智能人工氣候箱（QRGN-400-3，杭州琦勝電子科技有限公司，中國）內進行，挑取2—3 日齡截形葉螨雌成螨200 頭于葉碟上[23]，分別置于38、42、46、50 ℃下處理2 h，以25 ℃為對照，每處理設置4 個生物學重復。挑取高溫脅迫后的成螨200頭于1.5 mL 無酶離心管中，液氮冷凍后，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 海藻糖含量測定

采用勻漿法提取截形葉螨的血淋巴[24]，參照微量法海藻糖含量試劑盒說明書（上海液質檢測技術有限公司）進行海藻糖含量檢測。

1.5 截形葉螨總RNA 的提取及cDNA 的合成

用Trizol 法提取不同發育階段和不同處理下截形葉螨的總RNA，用微量分光光度計測定總RNA 的濃度，選取1.8＜ODA260/A280＜2.2 的樣品，按照寶生物反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。轉錄后的cDNA 保存于-20 ℃冰箱中。

1.6 引物設計

用Primer 6.0 軟件設計TtTret1-like和TtTret1的qRT-PCR 引物和dsRNA 引物，選用Actin和RPS18作為截形葉螨qRT-PCR 的內參基因，以dsGFP為對照，具體引物序列見表1。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7 TtTret1-like 和TtTret1 的表達分析

采用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒（Novoprotein Scientific Inc，中國上海）進行檢測，qRT-PCR 反應體系10 μL：0.5 μL cDNA 模板，5 μL 2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus，0.5 μL 10 μmol·L-1Sense-Primer ， 0.5 μL 10 μmol·L-1AntiSense-Primer，0.2 μL ROX Ⅱ，3.3 μL RNase Free Water。qRT-PCR 程序：（1）95 ℃ 2 min，接著（2）95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s 和95 ℃ 15 s 循環40 次，（3）60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。每處理4 個模板。具體qRT-PCR 引物序列見表1。

1.8 RNAi

使用dsRNA 引物（表1），PCR 擴增TtTret1-like和TtTret1的目的片段，其在正義鏈和反義鏈中均含有T7 啟動子區域。以回收的PCR 產物為模板進行連接轉化，對轉化成功的菌液進行質?；厥?。然后使用TranscriptAid T7 高產轉錄試劑盒制備dsRNA 并純化。最終的dsRNA 溶解在無酶水中，短暫離心后，使用分光光度計對dsRNA 進行濃度的測定，dsRNA 濃度稀釋為1 400 ng·μL-1。

喂食截形葉螨目的基因的dsRNA[25]，具體步驟如下：將豇豆葉片切成邊長為1.5 cm 的正方形，60 ℃烘箱干燥脫水3 min 后，分別用50 μL 濃度為1 400 ng·μL-1的dsGFP、dsTtTret1-like和dsTtTret1處理葉片1—2 h。完全吸收后，將葉片放在制備好的葉碟上。挑取饑餓處理24 h 的3—5 日齡的70 頭雌成螨至處理過的葉片上，每處理3 個重復。飼喂dsRNA 48 h 后，挑取存活的截形葉螨用于qRT-PCR 檢測和海藻糖含量測定。并挑取存活的50 頭葉螨于新鮮葉碟中，置于50 ℃下處理2 h，進行耐熱性測試，每處理3 個重復。以dsGFP作為對照。處理后置于常溫進行恢復，每隔12 h 觀察并統計其死亡率。

1.9 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2016 統計數據，整理后的數據使用SPSS 23.0 軟件進行單因素ANOVA 檢驗和獨立樣本t檢驗。Origin 2018 軟件繪圖。

2 結果

2.1 TtTret1-like 和TtTret1 生物信息學分析

TtTret1-like和TtTret1的CDS 全長分別為1 389和1 569 bp，分別編碼463 和523 個氨基酸，預測蛋白分子量分別為50 189.03 和57 358.10 Da，等電點分別為8.87 和8.70。TtTret1-like 和TtTret1 均為堿性氨基酸和疏水性氨基酸且同屬于不穩定蛋白。TtTret1- like 和TtTret1 蛋白均具有12 個跨膜區（圖1-A），均具有MFS 超家族的典型結構域（圖1-B）。此外，TtTret1-like 和TtTret1 蛋白的二級結構（圖1-C）及三級結構（1-D）以螺旋和卷曲為主。

圖1 TtTret1-like 和TtTret1 生物信息學分析Fig. 1 Bioinformatics analysis of TtTret1-like and TtTret1

2.2 TtTret1-like 和TtTret1 進化樹分析

系統發育分析表明，截形葉螨TtTret1-like 和TtTret1 分別與同屬于葉螨屬的二斑葉螨TuTret1-like和TuTret1 親緣關系較近（圖2）。

圖2 TtTret1-like 和TtTret1 系統發育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of TtTret1-like and TtTret1

2.3 截形葉螨不同發育階段TtTret1-like 和TtTret1的表達模式

利用qRT-PCR 檢測截形葉螨各發育階段TtTret1-like和TtTret1的相對表達量（圖3）。TtTret1-like和TtTret1在截形葉螨各發育階段均有表達。在卵、幼螨和成螨期，TtTret1-like的表達量無顯著差異，但均顯著高于若螨期的表達量。TtTret1在幼螨期的表達量最高，其次是成螨期；卵期和若螨期的表達量無顯著差異。

圖3 TtTret1-like 和TtTret1 在截形葉螨不同發育階段的相對表達量Fig. 3 Relative expression level of TtTret1-like and TtTret1 at different developmental stages of T. truncatus

2.4 高溫對TtTret1-like 和TtTret1 表達的影響

由圖4 可見，各處理組TtTret1-like的表達量均顯著高于對照組（25 ℃），且隨著溫度升高呈上升趨勢，在50 ℃表達量最高，為對照組的5.65 倍；TtTret1的表達量隨溫度的升高先上升后下降，直至趨于對照組水平，其在42 ℃達到最大值，為對照組的5.01 倍。該結果表明高溫誘導了截形葉螨TtTret1-like和TtTret1的表達。

圖4 不同高溫下TtTret1-like 和TtTret1 的相對表達量Fig. 4 Relative expression level of TtTret1-like and TtTret1 at different high temperatures

2.5 高溫對截形葉螨海藻糖含量的影響

海藻糖含量測定結果顯示，各高溫處理組的截形葉螨體內海藻糖含量均顯著高于對照組（圖5），其中38、46、50 ℃海藻糖含量最高，表明截形葉螨在應對高溫脅迫時可能通過調控海藻糖含量來提高自身耐熱性。

圖5 不同高溫下截形葉螨的海藻糖含量Fig. 5 Trehalose content of T. truncatus at different high temperatures

2.6 沉默TtTret1-like 和TtTret1 對截形葉螨海藻糖含量的影響

采用qRT-PCR 方法檢測飼喂dsRNA 48 h 后TtTret1-like和TtTret1的相對表達量。與對照組dsGFP相比，TtTret1-like和TtTret1的相對表達量均極顯著下調（P＜0.01），沉默效率分別為78.2%、70.3%（圖6-A、6-B），飼喂dsRNA 可有效降低截形葉螨靶標基因的表達。進一步檢測了飼喂dsTtTret1-like和dsTtTret148 h 后截形葉螨成螨體內的海藻糖含量。與對照組dsGFP相比，干擾TtTret1-like和TtTret1后截形葉螨體內的海藻糖含量顯著增加（圖6-C），血淋巴的海藻糖含量顯著降低（圖6-D）。

圖6 干擾TtTret1-like 和TtTret1 對截形葉螨體內基因表達及海藻糖含量的影響Fig. 6 Effects of interference with TtTret1-like and TtTret1 on gene expression and trehalose content in T. truncatus

2.7 RNAi 對截形葉螨耐熱性的影響

由圖7 可知，將飼喂dsTtTret1-like和dsTtTret148 h 后的截形葉螨進行高溫50 ℃暴露處理2 h，再置于室溫，12 h 后，存活率分別為44%和78%，顯著低于對照組dsGFP，96 h 后存活率分別為11%和46.67%。表明TtTret1-like和TtTret1在截形葉螨抵御高溫脅迫中發揮了重要調節作用。

圖7 50 ℃極端溫度對沉默TtTret1-like 和TtTret1 后截形葉螨成螨生存的影響Fig. 7 Effects of 50 ℃ extreme temperature on the survival of T. truncatus adults after silencing TtTret1-like and TtTret1

3 討論

3.1 TtTret1-like 和TtTret1 生物信息學分析

海藻糖轉運蛋白是一種海藻糖特異性轉運蛋白，在維持昆蟲體內平衡和溫度脅迫耐受方面發揮重要作用[26-27]，其具有與大多數糖轉運蛋白相似的理化性質。本研究通過生物信息學方法預測的TtTret1-like 和TtTret1 均屬于MFS 超家族，它們的二級結構及三級結構主要為卷曲和螺旋結構[28]。同時，TtTret1-like 和TtTret1 具有12 個跨膜結構域，而大多數糖轉運蛋白的典型結構具有12 個跨膜結構域。SAIER 研究發現，MFS 超家族成員蛋白多數具有12 個跨膜結構域，少數具有14 或24 個跨膜區[29]；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）中的大多數糖轉運體有10—12 個跨膜結構域[30]。這說明TtTret1-like 和TtTret1 與大多數糖轉運蛋白結構相似。KIKAWADA 等研究也發現，Tret1 與葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，Glut）家族之間保守氨基酸序列總體相似，推測Tret1 可能具有轉運葡萄糖的功能。對嗜眠搖蚊（Polypedilumvanderplanki）的研究發現，PvTret1 不僅可以運輸海藻糖，還可以運輸葡萄糖類似物，因此推測Tret1 可能是Glut 超家族的新成員；但也有研究表明Tret 在底物選擇和運輸動力學方面與Glut 不同，Tret1 是否為Glut 超家族新成員還有待進一步研究[19,31]。

3.2 TtTret1-like 和TtTret1 在不同發育階段的表達模式

海藻糖是昆蟲體內一種主要的循環糖，在發育轉變和應激恢復期間維持能量和葡萄糖穩態中發揮重要作用，其在昆蟲體內的分布主要由海藻糖轉運蛋白Tret 調節，是飛行肌肉、卵巢和睪丸等生殖組織的即時能量來源[16]。本研究發現，在截形葉螨不同發育階段中均能檢測到TtTret1-like和TtTret1的表達，說明TtTret1-like和Tret1在截形葉螨的生長發育及生殖中不可或缺。TtTret1-like和TtTret1在截形葉螨幼螨和成螨期均高表達，在若螨期低表達，推測活動性較差的幼螨及成螨更需要海藻糖作為能源來完成生長發育及生殖活動，因此作為重要中介的海藻糖轉運蛋白基因表現出較高的表達量。與此類似的有，橢圓食粉螨AoTret1-1和AoTret1-2在卵期和成螨期高表達，在幼螨和若螨期低表達[20]。因此，對于能量需求較大的螨態，會通過調整自身的一系列行為來適應逆境，進而完成其生命活動[32]。此外，果蠅（Drosophila）的Tret1-1和Tret1-2在脂肪體和外周組織中表達，Tret1-1在大腦中高度表達，這對于果蠅在血腦屏障處輸入富含能量的糖類至關重要[33-34]。在家蠶（Bombyxmori）中，Tret1在脂肪體、睪丸和肌肉中高度表達[31]。本試驗僅研究了截形葉螨Tret1在不同發育階段的表達模式，尚未對該螨各組織中Tret1的表達水平進行研究，后續有待于進一步開展。

3.3 截形葉螨海藻糖及TtTret1-like 和TtTret1 對高溫的響應

海藻糖在抵抗高溫方面的重要作用已得到廣泛認可，如雙斑長跗螢葉甲（Monoleptahieroglyphica）[35]、白蠟窄吉?。ˋgrilusplanipennis）[36]、西伯利亞蝗（Gomphocerussibiricus）[8]在高溫條件下會通過積累海藻糖來提高耐熱性，以適應高溫環境。Tret在長紅獵蝽（Rhodniusprolixus）吸血后或饑餓狀態下表達增加，表明其可能在血淋巴直接吸收或釋放海藻糖中發揮作用[37]；此外，該基因在嗜眠搖蚊需要能量時高表達，比如交配和環境壓力（脫水、冷、熱、濕或鹽脅迫）下[19,31,38]。本研究中發現高溫處理下截形葉螨體內TtTret1-like和TtTret1表達上調，推測截形葉螨需要足夠的海藻糖來抵御外界高溫，進而海藻糖轉運蛋白基因也協同上調表達，表明TtTret1-like和TtTret1參與了應對高溫脅迫的過程。

為了進一步研究TtTret1-like和TtTret1對極端高溫的響應，本研究通過RNAi 技術沉默TtTret1-like和TtTret1后發現，截形葉螨體內的海藻糖含量顯著上升，但血淋巴的海藻糖含量顯著降低，截形葉螨對高溫的耐受性降低，在高溫中更易死亡。海藻糖的跨膜運輸主要依賴于海藻糖轉運蛋白，推測沉默TtTret1-like和TtTret1后海藻糖轉運蛋白減少，導致在脂肪體中合成的海藻糖轉運到血淋巴的過程受阻，進而降低了截形葉螨對高溫的適應性。這與許多研究結果一致。沉默AgTret1后，岡比亞按蚊血淋巴中的海藻糖含量降低，在高溫低濕環境中更易死亡[19]。敲除PxTret-1的突變體小菜蛾，其海藻糖含量整體升高，但血淋巴海藻糖含量降低，導致小菜蛾對溫度的適應性降低[22]。此外，在大猿葉甲（Colaphellusbowringi）中，沉默CbTret1a提高了脂肪體中海藻糖含量，降低了一些應激相關基因的表達[39]。在褐飛虱（Nilaparvata lugens）中，沉默NlTret1-likeX1后，降低了褐飛虱體內所有海藻糖合成酶和海藻糖酶基因的表達，同時降低了海藻糖酶活性，從而引起褐飛虱體內海藻糖含量升高[40]。這些研究表明特異性轉運海藻糖蛋白在昆蟲的能量供應中具有重要作用，增強了昆蟲對不利環境的適應能力。究其原因，可能是昆蟲在不斷取食的過程中，蔗糖可在腸道內水解成果糖和葡萄糖[41]，隨即葡萄糖通過葡萄糖轉運體Glut 轉運到脂肪體，并通過TPS/TPP 迅速合成海藻糖[15-16]，而脂肪體合成的海藻糖需要依靠海藻糖轉運蛋白轉運到血淋巴和其他需要能量的組織中。這說明海藻糖轉運蛋白Tret 在昆蟲或螨應對高溫環境中具有重要作用。

4 結論

TtTret1-like 和TtTret1 結構簡單，二級結構以螺旋和卷曲為主，且均屬于MFS 超家族，具有12 個跨膜結構域。TtTret1-like 和TtTret1 分別與同為葉螨屬的二斑葉螨TuTret1-like 和TuTret1 的親緣關系較近。高溫使截形葉螨體內的海藻糖含量顯著上升，誘導TtTret1-like和TtTret1上調表達，且當這兩個基因的表達被抑制后，可明顯降低截形葉螨的耐熱性。研究結果可為研發新型殺螨劑的防控靶標提供理論依據。