解磷細菌活化水稻土中低品位磷礦粉的效果與機制

宋雅榮，常單娜，周國朋，高嵩涓，段廷玉?，曹衛東?

1 蘭州大學草種創新與草地農業生態系統全國重點實驗室/蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室/蘭州大學草地農業科技學院，蘭州 730020；2 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/北方干旱半干旱耕地高效利用全國重點實驗室，北京 100081；3 安徽農業大學資源與環境學院，合肥 230036；4 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095

0 引言

【研究意義】磷是植物生長必需的營養元素，農業生產上主要通過持續增加磷肥的施入量，以保持作物高產穩產[1]。磷礦屬于不可再生的礦產資源，我國已探明的磷礦主要以中低品位礦為主（全磷P2O5＜28%，90%），高品位磷礦少（全磷P2O5＞30%，10%）[2]。磷礦粉主要成分是氟磷酸鈣，常伴有碳酸鹽的物質，主要以磷酸三鈣（非水溶性）的形態存在[3-4]。在生產上，高品位磷礦主要用于制作磷肥，按照目前磷肥生產速度，大約 23 年后，我國高品位磷礦資源將會逐漸枯竭[5-6]。將低品位磷礦資源直接應用于農業，可顯著降低能耗，并延長高品位磷礦使用年限[7]。但低品位磷礦粉中的有效磷含量低，磷生物利用率低。因此，最大程度活化磷礦粉中的難溶性磷，是提高其農業應用效率的核心?！厩叭搜芯窟M展】磷礦粉的活化方法主要包括物理、化學和生物活化。物理活化可以直接機械破碎改變磷礦粉的粒徑及晶格結構，粒徑越小，比表面積越大，與土壤的接觸面積越多，越有利于磷礦粉中難溶性磷的溶解與釋放，常適用于南方酸性土壤及根際過程較強的豆科植物[8]。王晨等[9]發現機械活化磷礦粉，磷礦粉的晶格尺寸減小，許多官能團發生置換反應，使磷礦粉的可溶性磷含量提高61.6%?；瘜W活化主要通過使用酸分解磷礦粉，或者與合成酸活化劑等反應，顯著增強難溶性磷酸鹽溶解，但存在一定的環境風險[10]。生物活化主要包括根系活化、解磷微生物以及二者的相互作用等，綠色環保，有助于推動我國農業的可持續發展[11]。解磷細菌解磷機制較復雜，主要通過產生胞外無機酸、有機酸和磷酸酶介導的礦化作用引起難溶性磷酸鹽的溶解[12]，提高磷的有效性從而提高作物產量[13]。因菌株特性及培養環境條件等因素，解磷微生物分泌的有機酸、磷酸酶存在差異[14]。目前報道的解磷微生物主要是細菌，種類繁多，有芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等[15]。解磷細菌能夠活化紅壤或磷礦粉中的難溶性磷，提高有效磷含量[16-17]。林啟美等[18]以磷礦粉為唯一磷源培養解磷細菌，5 d 后培養液磷增加量最高可達10.91 mg·L-1。王苗[19]的研究表明，單獨添加機械活化磷礦粉土壤速效磷隨培養時間的延長緩慢波動增加，同時添加機械活化磷礦粉和接種解磷菌，土壤速效磷在培養過程中持續保持較高幅度的增加，但兩者之間是否存在協同作用并不清楚。一方面，磷礦粉經過機械活化后粒徑變小，比表面積變大，與土壤及解磷菌接觸的機會增加，有利于解磷菌活化其中的難溶性磷。另一方面，經過機械活化后晶體表面的缺陷越多，更多不穩定的磷在活化過程中被釋放出來，剩余殘渣態磷難以被解磷菌活化?！颈狙芯壳腥朦c】關于物理機械活化及解磷細菌對磷礦粉的溶磷作用已有相關研究，但鮮見解磷細菌對不同粒徑磷礦粉的活化效果及機制的研究?！緮M解決的關鍵問題】通過土壤培養試驗，分析測定不同形態磷、有機酸、磷酸酶、phoD等指標，探討解磷細菌對不同粒徑磷礦粉在紅壤上施用效果的影響，分析解磷細菌活化低品位磷礦粉（不同粒徑）中難溶性磷的效應與機制，為紅壤稻田高效利用低品位磷礦粉提供技術和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試磷礦粉屬于低品位磷礦粉，全磷（P2O5）含量18.0%，磷礦粉粒徑分別為0.18、0.10 和0.05 mm，其有效磷（P2O5）含量分別為2.1%、3.1%、4.5%，pH分別為9.41、9.55、9.58。供試菌株由北方民族大學楊國平老師提供，分別為乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）和皮特不動桿菌（Acinetobacterpittii），平板溶磷試驗發現兩株菌均具有良好的解磷能力。供試土壤采自湖南省赫山區稻田，土壤pH 6.4，有機質38.6 g·kg-1，全磷0.40 g·kg-1，全氮1.7 g·kg-1，有效磷6.8 mg·kg-1，速效鉀122.0 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

本試驗為雙因素試驗，因素一為磷礦粉粒徑，因素二為解磷細菌。磷礦粉粒徑分別為0.18 mm（L1）、0.10 mm（L2）、0.05 mm（L3），解磷細菌分別為A.calcoaceticus（P1）和A.pittii（P2），同時設置不接種對照（P0），共9 個處理，各處理32 次重復（用于8 次破壞性取樣），共288 個培養瓶。將磷礦粉與土壤（風干土）按1:100 重量比準確稱取到培養瓶中，攪拌混合均勻[20]，菌液按6.0%的接種率（菌液∶土重=v（mL）∶w（g））接種[21]，接種處理添加含有解磷菌的溶菌肉湯（LB）培養基，對照不接菌處理添加等量無菌的LB 培養基。用透氣的封口膜密封，所有培養瓶均在25 ℃黑暗培養箱中培養，定期稱重補充LB 培養基至最大持水量的65.0%。

1.3 解磷細菌的培養

將4 ℃保存的菌種，接種到營養瓊脂（NA）平板上。2 d 后將長好的解磷細菌接種于150 mL LB 液體培養基中，28 ℃、150 r/min 搖床中振蕩培養24 h（血球板計數，菌液濃度108cfu/mL）。

NA 培養基（g·L-1）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。LB 培養基（g·L-1）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.4 樣品采集與指標測定

分別在培養1、3、5、10、15、30、45、60 d 動態取樣，取30 g 鮮土于-20 ℃冰箱保存，用于測定微生物量磷、磷酸酶、有機酸（OA）及堿性磷酸酶功能基因phoD定量分析。剩余土樣風干過篩用于測定土壤基礎理化性質與磷分級。

磷礦粉中有效磷采用檸檬酸提取-釩鉬黃比色法測定，磷礦粉中全磷采用1∶1 HNO3提取-釩鉬黃比色法測定，有效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定，pH 采用水土比2.5∶1、電位法測定，微生物量磷采用氯仿熏蒸-NaHCO3浸提法[22]測定。磷分級參照Tiessen 磷分級法[23]測定（取培養1、30、60 d）。磷酸酶活性采用分光光度法測定[24]。有機酸測定儀器為高效液相色譜質譜聯用儀（Waters Acquity UPLC，AB SCIEX 5500 Qtrap-MS），吸取樣液過0.22 μm 水相濾膜進樣，利用MultiQuant 軟件進行積分，利用標準曲線進行含量計算[25]。

1.5 土壤總DNA 提取和熒光定量PCR 測定

土壤樣品DNA 采用FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）試劑盒提取。NanoDrop?ND-2000微量紫外分光光度計（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）檢測DNA 濃度和質量。使用QuantStudio? 6 Flex Real-Time PCR 儀（ThermoFisher，USA）測定phoD基因豐度。phoD基因正向引物和反向引物分別為（phoD-F733：5′-TGGGAYGATCAYGARGT-3′和phoD-R1083：5′-CTGSGCSAKSACRTTCCA-3′）。實時熒光定量PCR 的反應體系為10 μL，包括5 μL Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，0.2 μL 上、下游引物，1 μL DNA 模板，補充ddH2O 至10 μL。循環條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環40次[26]。將含有目的基因的質粒連續10 倍稀釋度作為qPCR 標準品，構建標準曲線（R2＞0.99），擴增效率達到90.0%—110.0%。通過擴增曲線及熔解曲線分析驗證qPCR 擴增的質量。

1.6 數據處理及統計方法

采用Microsoft Excel2016 軟件進行數據處理，用IBM SPSS Statistics23.0 軟件進行方差分析與因子降維分析，使用IBM SPSS Amos26.0 構建結構方程模型和Origin2021 軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 土壤有效磷的變化

圖1 顯示，各處理土壤有效磷含量在培養前期迅速增加，于第5 天到達最高水平后至培養結束（60 d）期間維持波動高位。培養期間，3 個粒徑（0.18、0.10和0.05 mm）接種P1 菌株的土壤有效磷含量為9.8—17.4 mg·kg-1，平均分別為13.8、14.2、14.7 mg·kg-1，接種P2 菌株的土壤有效磷含量為8.3—18.0 mg·kg-1，平均分別為13.4、13.5 和14.2 mg·kg-1，均高于不接種對照（P0）處理（為6.7—11.7 mg·kg-1，平均分別為9.7、10.3 和9.6 mg·kg-1），分別提高42.3%、37.9%、53.1%和38.1%、31.1%、47.9%（P＜0.05）。不同粒徑相比，接種解磷細菌后粒徑0.05 mm 磷礦粉處理的有效磷含量增幅最大，但兩株解磷細菌之間的解磷效果差異不顯著（圖1-a、1-b、1-c）。培養第10天時，粒徑0.05 mm 磷礦粉的土壤有效磷含量均顯著高于粒徑0.18、0.10 mm 磷礦粉的，分別提高19.2%、11.0%（P1）和11.3%、9.0%（P2）（P＜0.05）（圖1-d、1-e、1-f）。

圖1 接種解磷細菌培養過程中土壤有效磷含量動態變化（a-L1；b-L2；c-L3；d-P0；e-P1；f-P2）Fig. 1 Dynamic changes of soil available phosphorus content during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1;b-L2; c-L3; d-P0; e-P1; f-P2)

2.2 土壤微生物量磷的變化

圖2 顯示，各處理微生物量磷在培養前期迅速增加，于第3 天到達最高水平后逐漸降低，在培養末期趨于平穩（45—60 d）。在3—45 d，3 個粒徑（0.18、0.10、0.05 mm）磷礦粉接種P1 菌株后土壤微生物量磷含量為8.7—26.6 mg·kg-1，平均含量分別為19.6、20.0、21.4 mg·kg-1，接種P2 菌株的土壤微生物量磷含量為8.5—28.3 mg·kg-1，平均分別為18.7、19.0 和21.2 mg·kg-1，均高于P0 處理（為7.8—15.9 mg·kg-1，平均含量分別為10.6、11.8 和12.7 mg·kg-1），分別提高84.9%、69.5%、68.5%和76.4%、61.0%、66.9%（P＜0.05）。培養第10 天時，粒徑0.05 mm 磷礦粉處理的土壤微生物量磷含量顯著高于粒徑0.18 mm 磷礦粉處理，P0、P1 和P2 處理分別高31.7%、18.7%、24.6%（P＜0.05）（圖2-d、2-e、2-f）。

圖2 接種解磷菌后培養過程中土壤微生物量磷含量的動態變化（a-L1；b-L2；c-L3；d-P0；e-P1；f-P2）Fig. 2 Dynamic changes of soil microbial biomass phosphorus content during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3; d-P0; e-P1; f-P2)

2.3 土壤磷庫的變化

培養第1、30、60 天的磷形態變化如表1 所示。在整個培養過程中，隨培養時間的延長，與P0 相比，P1 與P2 處理的樹脂磷（Resin-Pi）逐漸增加。對于不接種解磷細菌（P0）粒徑0.05 和0.10 mm 磷礦粉的Resin-Pi 含量顯著高于粒徑0.18 mm 磷礦粉的處理，分別為9.3、11.3 和11.8 mg·kg-1；P1 處理3 個粒徑（0.18、0.10、0.05 mm）磷礦粉的Resin-Pi 平均含量分別為16.6、16.1、16.5 mg·kg-1，P2 處理下各粒徑磷礦粉的Resin-Pi 平均含量分別為13.9、16.4、16.1 mg·kg-1，較P0 處理分別提高78.5%、42.5%、39.8%和49.5%、45.1%、36.4%（P＜0.05）。接種解磷細菌后，粒徑0.18 mm 磷礦粉Resin- Pi 平均含量增幅最明顯。3 個粒徑（0.18、0.10、0.05 mm）下P1 菌株的碳酸氫鈉提取無機磷（NaHCO3-Pi）平均含量分別為15.6、16.2、16.5 mg·kg-1，P2 菌株的NaHCO3-Pi 平均含量分別為14.9、15.1、15.5 mg·kg-1，均高于P0 處理（分別為13.1、13.2 和13.2 mg·kg-1），分別提高19.1%、22.7%、25.0%和13.7%、14.4%、17.4%（P＜0.05）。粒徑0.18、0.10 mm 磷礦粉接種P2 菌株氫氧化鈉提取有機磷（NaOH-Po）平均含量分別為73.5、72.0 mg·kg-1，均高于P0 處理（分別為63.0、64.1 mg·kg-1），提高了16.7%、12.3%（P＜0.05）。粒徑0.18 mm 磷礦粉接種P1 菌株稀鹽酸提取無機磷（Dil.HCl-Pi）平均含量為339.9 mg·kg-1，高于P0 處理（為302.3 mg·kg-1），提高10.5%（P＜0.05）。

表1 接種解磷菌后培養過程中土壤不同磷形態含量的變化Table 1 Changes of phosphorus pool content during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated

粒徑0.10 和0.05 mm 的磷礦粉接種P1 菌株濃鹽酸提取有機磷（Conc.HCl-Po）平均含量分別為82.0、82.2 mg·kg-1，接種P2 菌株的Conc.HCl-Po 平均含量分別為75.4、74.6 mg·kg-1，均低于P0 處理（分別為103.5、92.6 mg·kg-1），分別降低20.8%、11.2%和27.2%、19.4%（P＜0.05）。

根據有效性的不同，Resin-Pi 和碳酸氫鈉提取無機磷（NaHCO3-Pi）、碳酸氫鈉提取有機磷（NaHCO3-Po）劃分為活性磷（Labile-P）；氫氧化鈉提取無機磷（NaOH-Pi）、氫氧化鈉提取有機磷（NaOH-Po）和稀鹽酸提取無機磷（Dil.HCl-Pi）劃分為中等活性磷（Mod.labile-P）；濃鹽酸提取無機磷（Conc.HCl-Pi）、Conc.HCl-Po 和殘渣態磷（Residual-P）劃分為穩定性磷（Non.labile-P）。本研究中各處理的磷形態主要以Non.labile-P 為主，其次是Mod.labile-P、Labile-P，分別占全磷的47.0%—57.0%、38.0%—48.0%和3.0%—6.0%（圖3）。與P0 相比，接種解磷細菌后粒徑0.18、0.10和0.05 mm 磷礦粉處理的Labile-P 分別增加28.4%—46.7%、15.0%—39.5%和19.1%—29.5%，Non.labile-P分別降低2.1%—8.0%、1.2%—12.2%和1.5%—10.6%（圖4），表明接種解磷細菌后，粒徑0.18 mm 磷礦粉的活性磷增幅最大。

圖3 接種解磷細菌后培養過程中磷庫占比（a-L1；b-L2；c-L3）Fig. 3 Proportion of phosphorus pool during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3)

圖4 接種解磷細菌后培養過程中磷庫相對變化比例（a-L1；b-L2；c-L3）Fig. 4 Relative change ratio of phosphorus pool during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3)

2.4 土壤pH 的變化

各處理下pH 在培養前期迅速增加（1—5 d），隨后緩慢上升至逐漸平穩（5—60 d）。整個培養期間，與P0 相比，接種解磷細菌（P1 和P2）的處理均顯著降低了pH，分別降低了0.20—0.35 個單位和0.18—0.28 個單位（P＜0.05），但不同解磷細菌間差異不顯著（圖5-a，5-b，5-c）。整個培養期間，接種P1，粒徑0.10 和0.05 mm 磷礦粉處理的土壤pH 較粒徑0.18 mm 磷礦粉分別升高0.17—0.36 和0.14—0.25 個單位。接種P2，粒徑0.05 mm 磷礦粉處理的土壤pH 較粒徑0.18 mm 磷礦粉升高0.12—0.39 個單位（P＜0.05）（圖5-d，5-e，5-f）。

圖5 接種解磷細菌后培養過程中土壤pH 動態變化（a-L1；b-L2；c-L3；d-P0；e-P1；f-P2）Fig. 5 Dynamic changes of soil pH during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3; d-P0; e-P1;f-P2)

2.5 土壤有機酸含量的變化

培養第60 天有機酸主要以乙酸（HAC）為主，其次是草酸（OXA）、丁酸（BA）、丙酸（PA）（圖6）。與P0 相比，接種P1 和P2 解磷細菌后不同粒徑磷礦粉處理下的HAC 含量均增加，分別提高5.2%—7.4%和9.1%—13.7%，OXA 含量分別提高3.5%—7.0%和1.5%—2.9%（粒徑0.10 mm 磷礦粉除外），BA 含量顯著提高27.2%—47.0%和17.2%—29.2%（P＜0.05），PA 含量顯著提高45.9%—94.0%和64.8%—127.5%（P＜0.05）。解磷細菌與磷礦粉粒徑對各有機酸含量的交互作用不顯著。

圖6 接種解磷細菌60 d 對土壤乙酸（a）、草酸（b）、丁酸（c）和丙酸（d）含量的影響Fig. 6 Effect of 60 days inoculation of phosphate-solubilizing bacteria on acetic acid (a), oxalic acid (b), butyric acid (c), and propionic acid (d) contents in soil

2.6 土壤磷酸酶活性及phoD 基因豐度的變化

培養第60 天堿性磷酸酶（ALP）活性高于酸性磷酸酶（ACP）活性。與P0 相比，接種P1 顯著提高了不同粒徑磷礦粉處理的ALP 活性，提高6.5%—13.4%（P＜0.05），接種P1 和P2 解磷細菌均顯著提高不同粒徑磷礦粉處理的ACP 活性，分別提高7.6%—10.8%和12.8%—17.2%（P＜0.05）（圖7）。與P0 相比，各不同粒徑磷礦粉接種解磷細菌phoD基因豐度均有增加趨勢，粒徑0.18 和0.05 mm 的磷礦粉接種P1 的phoD基因豐度分別顯著提高98.6%、81.2%，接種P2顯著提高37.1%、20.1%，且接種不同的解磷細菌phoD基因豐度存在顯著差異，接種P1 的phoD基因豐度較P2 顯著提高44.8%、50.8%（P＜0.05）（圖8），表明P1 主要分泌ALP，P2 主要分泌ACP。

圖7 接種解磷細菌60 d 對土壤堿性磷酸酶（a）、酸性磷酸酶（b）活性的影響Fig. 7 Effect of 60 days inoculation of phosphate-solubilizing bacteria on alkaline phosphatase (a) and acid phosphatase (b)activities in soil

圖8 接種解磷細菌對phoD 基因豐度的影響Fig. 8 Effects of phosphate-solubilizing bacteria inoculation on phoD gene abundance

2.7 土壤磷庫組分與各指標的相關性分析

磷庫組分與各指標的相關性分析結果表明，AP、Resin-Pi 均與有機酸（HAC、OXA、PA、BA）、phoD、磷酸酶（ALP、ACP）含量呈顯著正相關，均與pH值呈顯著負相關。NaHCO3-Pi 與有機酸（HAC、PA）、磷酸酶（ACP）呈顯著正相關。Conc.HCl-Pi 與有機酸（HAC、PA）、磷酸酶（ACP）呈顯著負相關。Conc.HCl-Po 與有機酸（HAC）、磷酸酶（ACP）顯著負相關，表明接種解磷細菌主要通過分泌有機酸（HAC、PA）溶解難溶性無機磷，分泌有機酸（HAC、PA），磷酸酶（ALP、ACP）溶解難溶性有機磷（圖9）。

圖9 磷庫組分與有機酸（a）、磷酸酶（b）的相關性分析Fig. 9 Correlation analysis of phosphorus pool components with organic acid (a) and phosphatase (b)

為了進一步揭示難溶性磷的活化機制，將有效磷與各指標的內在關系進行擬合，構建結構方程模型（圖10-a），模型的卡方擬合指數/自由度（χ2/df）= 1.5，P=0.105，擬合優度指數（GFI）=0.890，比較擬合指數（CFI）=0.963。結果顯示，該模型解釋了74.0%的有效磷的變異，其中接種解磷細菌與磷礦粉的粒徑均可直接影響土壤有效磷含量，通徑系數分別為0.32 和0.25。接種解磷細菌后增加有機酸分泌（0.79），提高磷酸酶活性（0.77），有機酸與磷酸酶促進難溶性磷向活性磷轉化（0.44、0.51），對土壤有效磷有直接的正效應（0.36）。有效磷（AP）的標準化總效應通徑系數表明（圖10-b），磷礦粉粒徑（PRP）、解磷細菌（PSB）、有機酸（OA）、磷酸酶（Enzyme）、土壤理化性質（SP）、穩定性磷（Non.labile-P）、中等活性磷（Mod.labile-P）、活性磷（Labile-P）對有效磷的影響分別為0.17、0.77、0.16、0.17、-0.34、0.04、-0.03、0.36。綜上分析，接種解磷細菌與添加不同粒徑磷礦粉均可直接提高有效磷含量，解磷細菌對有效磷的影響更大，通過分泌有機酸、磷酸酶促進磷庫的周轉，增加有效磷含量。

圖10 解磷細菌與磷礦粉粒徑影響有效磷含量的結構方程模型（a）和有效磷的標準化總效應（b）Fig. 10 Structural equation model of phosphate solubilizing bacteria and particle size of phosphate rock powder affecting available phosphorus content (a) and total standardized effect of available phosphorus (b)

3 討論

3.1 解磷細菌對紅壤施用低品位磷礦粉的活化效應及其影響因素

本研究中影響磷有效性的因素主要有磷礦粉粒徑、解磷細菌和土壤環境等。其中粒徑是影響磷礦粉中磷形態的重要因素之一，同時，也影響解磷細菌對磷礦粉的活化效果。本研究表明，粒徑0.05 mm 磷礦粉接種解磷細菌后土壤有效磷含量增幅較高（圖1-a、1-b、1-c），可能磷礦粉粒徑越小，比表面積越大，與土壤及解磷微生物的接觸面積越大，活化效果越好[27]。本研究還發現，不接菌條件下，0.05 mm、0.10 mm 磷礦粉處理中Resin-Pi 含量要顯著高于0.18 mm磷礦粉，說明機械活化磷礦粉產生結構缺陷使磷礦中的磷更多處于不穩定態，更多的活性磷如Resin-Pi 被釋放，提高磷礦粉中磷灰石的反應活性。但粒徑0.18 mm 磷礦粉接種解磷細菌后Resin-Pi 及活性磷含量增幅最大（圖4），可能是粒徑0.18 mm 的磷礦粉比表面積小，機械活化釋放的活性磷較少，接種解磷細菌后更多不穩定性磷被活化，活性磷的增加比例更大，進一步說明接種解磷細菌能夠促進外源添加磷礦粉中難溶性磷的活化[28]。磷礦粉施入土壤后其肥效受土壤pH 影響，pH 越低，磷礦粉在土壤中的溶解性越強，難溶性磷越容易釋放[29]。解磷細菌在生長代謝過程中釋放質子，降低土壤pH。本研究中，與不接種對照對比，接種解磷細菌pH 降低了0.18—0.35 個單位，促進了磷礦粉中難溶性磷的溶解。機械活化磷礦粉可以提高磷礦粉的pH[30]。本研究也表明，在不接菌條件下，整個培養期間，粒徑0.05 和0.10 mm 磷礦粉處理的土壤pH 高于粒徑0.18 mm 磷礦粉，但粒徑0.05 和0.10 mm 磷礦粉接種解磷細菌后，土壤pH 顯著高于粒徑0.18 mm 磷礦粉?？赡芤驗榱椎V粉施入土壤，其分解后釋放H2PO4-、F-、SO42-等陰離子置換了土壤膠體表面的OH-基，使土壤pH 升高[4]，這兩種粒徑磷礦粉的比表面積大，與解磷細菌的接觸面積大，接種解磷細菌后會增強此過程，導致其pH 增幅較大。

磷在土壤中以不同形態存在，因Tiessen 磷分級法同時適用于酸性、堿性土壤，將土壤磷形態劃分為6 種類型，分別為樹脂交換態磷、NaHCO3浸提態磷、NaOH 浸提態磷、Dil.HCl 浸提態磷、Conc.HCl 浸提態磷和殘留態磷，較為全面地評價土壤無機磷和有機磷有效性，是目前廣泛應用的測定土壤各磷形態的方法[31]。各磷形態的生物學意義不同，其中樹脂交換態磷和NaHCO3浸提態磷，為易解離、易礦化成能被植物利用吸收的磷，NaOH 浸提態磷屬于土壤黏?；蜩F鋁化合物表面化學吸附的磷組分，Dil.HCl 浸提態磷和Conc.HCl 浸提態磷為磷灰石型磷和閉蓄態磷，與土壤中的Ca 有關，殘留態磷是土壤中最穩定的磷，植物較難吸收利用[32]。接種解磷細菌可以改變磷形態，加速土壤中磷組分循環，提高磷素有效性。LIU 等[21]研究表明，解磷細菌會使難溶性磷HCl-P 和Residual-P含量降低，將其轉化成活性磷H2O-Pi、NaHCO3-Pi、NaOH-Pi，促進土壤磷素活化。LIU 等[33]發現，接種解磷細菌使活性磷H2O-Pi 含量提高46.6%，穩定性磷Residual-P 含量降低20.0%。本研究結構方程模型結果顯示，接種解磷細菌對有效磷的標準化總效應通徑系數為0.77，是提高有效磷的主要因素（圖10）。在整個培養過程中，接種解磷細菌土壤有效磷含量增加31.1%—53.1%（圖1），土壤活性磷庫增加15.0%—46.7%，穩定性磷庫降低1.2%—12.2%（圖3），表明兩株解磷細菌均能夠分解難溶性磷，且隨培養時間延長，接種解磷細菌處理的Resin-Pi 含量逐漸增加，說明培養期間解磷細菌能保持解磷活性，分解難溶性磷，使活性磷含量持續增加[34]。解磷細菌生長過程中利用一部分分解的磷組建其細胞成分，提高微生物量磷含量（圖2），隨時間延長，一部分微生物量磷又可轉化成無機磷，使有效磷含量又升高[35]。

3.2 解磷細菌對紅壤施用低品位磷礦粉的活化機制

3.2.1 有機酸對難溶性無機磷與有機磷的影響 堿性土壤中有機酸可以促進土壤磷酸鈣鹽向有效性較高的磷形態轉化[36]，酸性土壤中低分子量有機酸作為金屬螯合劑，與土壤中的鐵鋁離子發生螯合[37]，促進難溶性的土壤磷酸鐵/鋁鹽的轉化，提高可溶性磷酸鹽含量。王樹起等[38]研究發現添加檸檬酸、草酸使難溶性磷Ca10-P、Al-P 和Fe-P 含量均顯著降低，可溶態磷的Ca8-P 含量顯著增加，表明低分子量有機酸能與難溶性礦物中的Ca2+、Fe3+和Al3+產生螯合，促進土壤難溶態磷向可溶態磷轉化。因解磷細菌種類[39]以及接種土壤環境條件（如pH、養分）等因素[40]，解磷細菌分泌的有機酸種類存在差異，一般有葡萄糖酸、蘋果酸、乙酸、草酸、丙酸、丁二酸等。據報道，不動桿菌屬的解磷細菌通過分泌乙酸、草酸、葡萄糖酸等有機酸[41]，減少磷的固定，促進土壤中植物難以利用無機磷的形態向有效性較高的無機磷形態轉化[42]。本研究結果表明，接種解磷細菌增加乙酸、草酸、丙酸、丁酸的含量，降低了pH，從而促進穩定性磷酸鈣鹽（Conc.HCl-Pi）、磷酸鐵/鋁鹽（NaOH-Pi）向活性較高的無機磷形態轉化（Resin-Pi、NaHCO3-Pi）。相關性分析發現乙酸與難溶性有機磷Conc.HCl-Po呈顯著負相關，乙酸、丙酸與難溶性無機磷Conc.HCl-Pi 呈顯著負相關，與活性無機磷Resin-Pi、NaHCO3-Pi 顯著正相關（圖9-a），表明這兩種酸在促進難溶性無機磷的轉化中占主導地位，且對難溶性有機磷具有很好的溶解效果，說明這兩株菌株能夠溶解難溶性無機磷和有機磷。

3.2.2 磷酸酶對難溶性有機磷的影響 解磷細菌產生的磷酸酶可水解C–O–P 酯鍵從有機磷中釋放出無機磷[43]，促進難溶性有機磷的分解，轉化成利于被植物吸收利用的可溶性無機磷。本研究中接種2 株解磷細菌均增加了酸性和堿性磷酸酶活性（圖7），但可能因菌株自身遺傳特性等因素[44]，兩株解磷細菌主要分泌的磷酸酶種類亦不同。結構方程模型顯示接種解磷細菌可以促進磷酸酶分泌（0.51），且磷酸酶對活性磷庫有顯著的正向直接效應（0.56），對難溶性磷庫有顯著的負向直接效應（-0.43），磷酸酶對有效磷的標準化總效應通徑系數為0.17（圖10），表明磷酸酶的分泌會影響磷庫組分，促進磷庫周轉，其中酸性磷酸酶與難溶性有機磷Conc.HCl-Po 顯著負相關，與活性無機磷Resin-Pi、NaHCO3-Pi 顯著正相關（圖9-b），堿性磷酸酶與AP、Resin-Pi 含量顯著正相關，表明磷酸酶可以促進難溶性有機磷溶解，從而提高無機磷含量。研究發現，酸性土壤主要以酸性磷酸酶為主[45]，但在本研究中的堿性磷酸酶活性高，主要是接種解磷細菌顯著增加了phoD基因豐度（圖8），接種解磷細菌導致phoD編碼的微生物群落組成發生變化，富集了phoD基因豐度，進而釋放出更多的堿性磷酸酶[46]。HE 等[47]研究發現，接種不動桿菌屬解磷細菌增加了與有機磷轉化相關的phoD功能基因豐度，提高磷的有效性，這與本研究結果一致。

4 結論

接種解磷細菌能促進磷礦粉中難溶性磷的活化，增加土壤有效磷含量及活性磷的占比，粒徑0.05 mm的磷礦粉有效磷增幅最大，但粒徑0.18 mm 磷礦粉中活性磷的占比增幅最大，活化效果最好。兩株解磷細菌主要通過分泌乙酸、丙酸溶解難溶性有機磷（Conc.HCl-Po）與無機磷（Conc.HCl-Pi、NaOH-Pi），分泌酸性磷酸酶與堿性磷酸酶溶解難溶性有機磷（Conc.HCl-Po），向活性較高的Resin-Pi、NaHCO3-Pi轉化，促進磷庫的周轉，提高磷礦粉在紅壤性水稻土中的施用效果。