超高效液相色譜- 串聯質譜法快速定性和定量篩查貼敷類醫療器械產品非法添加的水楊酸甲酯

劉路，皮璟漁，余永紅，劉小輝，胡紅剛，梁國東

江西省醫療器械檢測中心 （江西南昌 330000）

現代生活強度高、節奏快，許多人或因長期體 力勞動，或因長期對著電腦及手機，身體處于亞健康狀態，并伴肩頸、腰椎、關節等疼痛。為緩解此類癥狀，一般選擇貼膏劑藥物和貼敷類醫療器械產品。此兩類產品省時、方便、見效快，市場前景廣闊。其中貼敷類醫療器械產品包括醫用冷敷貼、遠紅外貼、穴位刺激貼、降溫貼、熱療貼、熱灸貼等，屬于第一類醫療器械。國家藥品監督管理局于2021 年12 月組織修訂的《第一類醫療器械產品目錄》[1]中明確強調，該類醫療器械產品中不能含有中藥（薄荷、麝香、肉桂、艾葉等）、化學藥物（水楊酸、水楊酸甲酯、布洛芬、鹽酸利多卡因等）、生物制品（血清白蛋白、細胞因子、酶、干擾素等）、消毒和抗菌成分（次氯酸、鹽酸奧替尼啶、苯扎溴銨等）、天然植物（洋甘菊、百里香、薄荷腦、薄荷醇等）及其提取物等發揮藥理學、免疫學、代謝作用的成分或者可被人體吸收的成分?；颊呷魧Ξa品成分潛在風險不了解，長期大量使用、錯誤使用可能會產生許多不良反應，嚴重損傷機體的生命系統，威脅患者的生命安全[2-5]。

液相色譜-串聯質譜法快速測定其非法添加化學成分（如雙氯酚酸鈉、潑尼松、萘普生、布洛芬、吲哚美辛、保泰松、氫化可的松、酮洛芬、醋酸潑尼松、對乙酰氨基酚等）的報道較多[6-10]，但對水楊酸甲酯含量測定的報道較少。查詢相關文獻，水楊酸甲酯的檢測方法主要有液相色譜法[11，15-16]和氣相色譜法[12-13]，且多針對藥品，包括橡膠膏劑[11-12]、藥油[13]、軟膏[14-15]、片劑、膠囊劑等[16-18]，但關于高分辨液相色譜-質譜聯用法的報道較少。

目前針對腰腿疼痛有活血化瘀、消腫止痛的貼膏劑和貼敷類醫療器械。而貼敷類醫療器械基質復雜，多含有粘貼層，膠狀物成分不明，一般包括醫用壓敏膠和遠紅外陶瓷粉，氣相、液相色譜法檢測易出現假陽性。本研究以貼敷類醫療器械為對象，采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定，利用色譜的分離能力和串聯質譜的高選擇性，實現對目標物的分離、確認和定量分析，旨在為敷貼類醫療器械的市場監督管理提供技術支持與參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-XEVO-TQD 高效液相色譜串聯質譜儀（美國Waters 公司，配置電噴霧離子源ESI）、ME5 超微量電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]， BT25S 電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，CLXXUVFM2 超純水器（威立雅集團上海公司），HH-8 恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）。

水楊酸甲酯對照品（純度100.0%，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（質譜純，Honeywell公司）；甲醇（色譜純，Honeywell公司）；氨水（質譜純，Aladdin 公司），實驗用水為符合GB/T 6682-2008 的二級水。

供試樣品為各大藥房和網絡購買所得貼敷類醫療器械。

1.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品0.01 g（精確至0.01 mg），置于10 ml 棕色容量瓶中，加色譜純甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為1 mg/ml 的對照儲備溶液。分別取適量對照儲備溶液于10 ml 棕色容量瓶中，用色譜純甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得1～100 μg/ml 水楊酸甲酯對照系列溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取樣品1 貼，撕開粘貼層，貼在定量濾紙上，用剪刀裁去多余濾紙，然后將樣品剪成0.5 cm×0.5 cm的小片，置于150 ml 燒瓶中，加入色譜純甲醇40 ml，置于恒溫水浴鍋內70℃連續回流2 次，每次2 h；合并浸提液并用色譜純甲醇分3 次沖洗燒瓶，再用色譜純甲醇定容至100 ml 容量瓶，經0.22 μm 微孔濾膜過濾后進樣分析，同法制備空白溶液進行比較。

1.3.2 儀器條件

液相色譜條件：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A 為0.05%氨水，B 為質譜純甲醇，按表1 進行梯度洗脫；流速為0.2 ml/min，進樣量為10 μl；柱溫為40 ℃。 質譜條件：電離方式為電噴霧電離負離子模式、質譜掃描方式為多反應離子監測、毛細管電壓為2.50 kV、脫溶劑溫度為500 ℃、脫溶劑氣流為1000 L/h，其他參數見表2。

表1 UPLC 流動相梯度洗脫程序

表2 水楊酸甲酯的回收率實驗結果（n=6）

2 結果與分析

2.1 質譜參數的優化

將質量濃度為10 μg/ml 的水楊酸甲酯對照溶液進行一級質譜全掃描和二級質譜轟擊，以目標物的分子離子和豐度較強、干擾較小的子離子組成離子對進行監測。同時對特征離子及離子間的豐度比作定性分析、豐度最高的特征離子作定量分析，以提高方法的準確性和專屬性。質譜的錐孔電壓和碰撞對目標物的裂解起著重要作用，因此重點優化毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞能，以進一步提高該方法的靈敏度。實測水楊酸甲酯在8.12 min處出現色譜峰，響應的MRM 母離子為151 m/z，子離子為91 m/z、121 m/z，選取91 m/z 為定量離子、121 m/z為定性離子，碰撞電壓為18 eV，錐孔電壓為26 eV。

2.2 色譜參數的優化

本實驗從靈敏度、分離效果、分析時間、峰形方面綜合考慮BEH C8 柱、 C18 柱，最終選擇BEH C18 柱。流動相的選擇中，觀察乙酸銨（2 mmol/L、10 mmol/L）-甲醇、乙酸銨（2 mmol/L、10 mmol/L）-乙腈、甲酸水（0.05%、0.10%）-甲醇、氨水（0.05%、0.1%、0.2%）-甲醇等多個系統，發現在酸性環境下，對水楊酸甲酯的電離具有抑制作用，導致質譜沒有響應，需使用堿性試劑提高離子化效率、增加信號強度，故采用氨水-甲醇系統。通過考察不同濃度的氨水（0.05%、0.1%、0.2%）發現氨水濃度為0.05%時，水楊酸甲酯的峰形、響應值均較好，選擇0.05%氨水-甲醇作為流動相。鑒于堿性流動性對儀器的損傷較大，分析0.20、0.25、0.30 ml/min 的流速后，采用0.2 ml/min 的流速。

2.3 方法驗證

2.3.1 專屬性試驗

取“1.2 項下的對照品溶液的制備”的溶液，按“1.3.2”項下條件進樣測定，水楊酸甲酯定性和定量離子對的MRM 圖見圖1。取陽性樣品、空白樣品分別按照“1.3.1”項下方法制備，按“1.3.2”項下條件進樣測定，陽性樣品、空白樣品的定性和定量離子對的MRM 圖分別見圖2～3。從圖1、圖2 中可以看出，對照品和陽性樣品的峰型對稱、尖銳，分離度良好，基線較為平穩，且陽性樣品中的定性離子、定量離子的保留時間及離子豐度比均與對照品的保留時間、離子豐度比一致，則予以確認含有同一物質。從圖3 中可看出，空白樣品的定性和定量離子出峰時間、離子豐度比均不一致，則不予確認，表明該方法專屬性較強。

圖1 對照品定性和定量離子對的MRM 圖

圖2 陽性供試品定性和定量離子對的MRM 圖

2.3.2 線性關系考察

配制質量濃度為1 、2、4、6、8、10、20、50、80、100 μg/ml 水楊酸甲酯標準系列溶液，按“1.3.2”測定，以定量離子的峰面積值對濃度進行線性回歸，線性方程為y=0.50307x+191.14（r=0.9997），結果表明，相關系數r>0.999，水楊酸甲酯 1～100 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.3.3 檢出限

UPLC-MS/MS 使目標物的精確質量數提取，基線噪音很低，信噪比一般較大，因此本實驗不選擇S/N 為3∶1 的濃度作為化合物檢出限，S/N 為10∶1 的濃度作為化合物定量限[8]，而是逐級稀釋對照品溶液，以最小響應信號所對應的濃度作為檢出限，然后以檢出限的3 倍確定定量限，實驗測得檢出限為0.1 μg/ml、定量限為0.3 μg/ml。

2.3.4 精密度

取樣品按“1.3.1”方法制備的供試品溶液、質量濃度為50 μg/ml 的對照品溶液，分別連續測定6 次。在MRM 模式下計算提取定量離子峰面積的相對標準偏差（relative standard de-viation，RSD）為0.7%（n=6），結果顯示方法的精密度良好。

2.3.5 回收率

選取陰性樣品分別添加0.1、0.5、2 mg 3 個水平進行加標回收實驗，每個水平各6 份樣品，按照“1.3.1”處理、“1.3.2”測定，結果顯示回收率為90.3%～100.7%，RSD 為0.5%～0.9%，表明回收率良好，見表2。

2.3.6 穩定性

取陽性樣品，按照“1.3.1”處理、“1.3.2”分析，分別在0、12、24、30、36、48 h 測定。在MRM模式下計算提取定量離子峰面積的RSD 為0.6%，RSD<5%（見表3），表明陽性樣品中的目標物48 h內穩定性良好。

表3 水楊酸甲酯的穩定性實驗結果

2.4 樣品制備方法的分析

本研究對貼敷類醫療器械產品進行探討，患者在使用產品時貼于患處，一般以1 貼為1 次用量，貼的大小與患者的部位有關，因此以1 貼為實驗用量。參照相關文獻[6，14]，選擇甲醇為樣品的浸提溶劑并采取冷凝回流的方式，獲得浸提液。供試樣品為各大藥房和網絡購買所得貼敷類醫療器械，部分貼敷類醫療器械產品名稱及宣稱功效舉例見表4。以鐵粉或其他粉末致熱為工作原理的熱療貼、熱灸貼等貼敷類醫療器械一般含有發熱粉劑，且發熱粉劑不接觸皮膚，不適用于此樣品制備方法。

表4 部分貼敷類醫療器械產品名稱及宣稱功效舉例

2.5 貼敷類醫療器械產品中水楊酸甲酯的測定

采用建立的UPLC-MS/MS 方法對市售和網購的貼敷類醫療器械產品（包括醫用冷敷貼、醫用冷敷凝膠、遠紅外鎮痛貼、暈車貼、雞眼貼等）是否添加水楊酸甲酯進行檢測。114 份樣品中，共檢出陽性樣品29 份，檢出率為25.4%，含量為每貼1～47 mg，且陽性樣品多集中在醫用冷敷貼、遠紅外鎮痛貼樣品中。

3 討論

面對日益復雜的貼敷類醫療器械產品質量安全形勢，檢驗、檢測能力亟需高質量發展，以滿足安全監管的需要。氣相、液相色譜法是篩查食品、藥品中非法添加物常用的方法，但由于貼敷類醫療器械基質復雜，成分不明，基質中的其他成分可能與水楊酸甲酯具有相同的保留時間，所以需高分辨的質譜數據提供準確可靠的信息[5]，所以通常利用色譜法進行初篩，再用UPLC-MS/MS 法驗證，試驗過程步驟多且復雜，耗時過長。本研究通過質譜、色譜條件的優化及方法學驗證，證明本研究建立的UPLC-MS/MS 法簡便可靠、快速高效，可有效對貼敷類醫療器械產品中是否添加水楊酸甲酯進行監測。另外，貼敷類醫療器械非法添加成分繁雜，可參考文獻[6-9]與本研究方法同時測定多種成分，省時省力，為批量處理分析樣品提供便捷。本研究對114 份樣品進行測定，發現陽性樣本29 份，滿足對目標物進行精準分析的要求，進一步驗證了該方法可用于大批量樣品檢測的有效性和實用性。