RRM2在結直腸癌的放射增敏中的作用及研究

王俊 李亮 李建剛

收稿日期：2023-05-06；修回日期：2023-06-27。

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金項目（2021D01C377）。

作者簡介：王俊，主治醫師，主要從事胃腸道腫瘤方面的研究工作。

* 通信作者：李建剛，主治醫師，主要從事胃腸道腫瘤方面的研究工作。E-mail： lijiangang810311@163.com。

摘 要：大多數結直腸癌患者治療失敗的原因是對放射治療的抵抗。本研究采用生物信息學方法，篩選放療處理后癌組織中的差異基因（DEGs），尋找與放射敏感性相關的治療靶點。通過細胞周期調節基因核糖核苷酸還原酶調節亞基M2（RRM2）的表達篩選后，分別采用Lipofectamine 2000和3 Gy放射劑量對細胞進行轉染及放療處理，應用實時熒光定量PCR和蛋白質印跡檢測RRM2蛋白在結直腸癌中的表達，采用噻唑蘭（MTT）方法測量細胞活力，用流式細胞術測定細胞周期和細胞凋亡。本研究共鑒定出4 269個DEGs，其中RRM2基因差異最顯著。與腸上皮細胞FHC比較，RRM2在腫瘤細胞中的表達顯著升高（P<0.05）。與對照（NC）組比較，過表達RRM2可促進細胞活力。與3 Gy組比較，過表達RRM2能夠延緩放療對細胞的殺傷作用。與NC組比較，過表達RRM2會導致細胞凋亡率降低，而抑制RRM2表達則導致細胞凋亡率升高。與單獨使用si-RRM2或輻照相比，si-RRM2和輻照的組合顯示出了更好的效果。在細胞周期的分析中，RRM2的過表達導致S期細胞聚集，而RRM2的敲低導致G1期細胞聚集。此外，輻照可導致顯著的G1相停滯，而RRM2的敲低與輻照一起可導致更顯著的G1相停滯。這表明，RRM2介導了結直腸癌細胞的細胞周期調節，并通過細胞周期影響結直腸癌的放射敏感性。本研究為結直腸癌聯合療法的開展提供了重要的數據支持。

關鍵詞：RRM2；結直腸癌；細胞周期；放射敏感性；治療靶點

中圖分類號：R735.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.01.008

Mechanism of RRM2 in Radiosensitization of Colorectal Cancer

WANG Jun， LI Liang， LI Jiangang*

（Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830063， China）

Abstract： Resistance to radiotherapy is the reason for treatment failure in most patients with colorectal cancer. In this study， bioinformatics methods were used to screen differential genes （DEGs） in cancer tissues after radiotherapy， and to find therapeutic targets related to radiosensitivity. After screening the cells by cell cycle mediator ribonucleotide reductase regulatory subunit M2 （RRM2） expression， the cells were transfected with lipofectamine 2000 and irradiated with 3 Gy. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot were used to detect the expression of RRM2 in colorectal cancer. Cell viability was measured by MTT assay. Flow cytometry was used to determine cell cycle and apoptosis. A total of 4 269 DEGs were identified， and RRM2 was found to be the most significant difference. Compared with intestinal epithelial FHC cells， RRM2 expression level significantly increased in tumor cells （P<0.05）. Compared with NC group， RRM2 overexpression promoted cell viability. Compared with the 3 Gy group， RRM2 overexpression could delay the killing effect of radiotherapy on the cells. Compared with NC group， overexpression of RRM2 reduced the apoptosis rate， while inhibition of RRM2 increased the apoptosis rate. The combination of si-RRM2 and irradiation showed better results compared to that with si-RRM2 or irradiation alone. Overexpression of RRM2 caused cell aggregation in S phase， while knockdown of RRM2 caused cell aggregation in G1 phase. In addition， irradiation caused a significant G1 phase arrest， while RRM2 knockdown together with irradiation caused a more significant G1 phase arrest. This suggests that RRM2 mediates cell cycle of CRC cells and affects the radiosensitivity of CRC through cell cycle. This study provides important data support for the development of combined therapy for colorectal cancer.

Key words： RRM2; colorectal cancer; cell cycle; radiosensitivity; therapeutic target

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（1）： 065-072）

結直腸癌是最常見的癌癥之一。目前的研究顯示，結直腸癌是癌癥死亡的第三大病因［1］，其5年和10年的相對生存率分別為65%和58%［2］。結直腸癌最有效的治療方法是早期直腸結腸切除術，可聯合放射治療、化學治療和免疫治療［2-3］。應用放射治療可能會在手術前縮小腫瘤的體積，并在手術后殺死剩余的腫瘤細胞。然而，放射治療耐受是影響結直腸癌患者預后的主要因素之一，因此，迫切需要探索新的治療方法來提高結直腸癌的放射敏感性［4］。目前研究發現，紫杉醇、曲妥珠單抗、西妥昔單抗等靶向治療聯合放射治療可提高抗腫瘤的療效［5-6］，且介導成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）抑制劑（JNJ-42756493）［7］、X-射線修復交叉互補蛋白2 （X-ray repair cross complementing protein 2，XRCC2）［4，8］有效地增強結直腸腫瘤細胞的敏感性，因此，探討更多的治療靶點對結直腸癌的放射增敏具有重要的價值。本研究旨在篩選能夠應用到聯合治療結直腸癌的潛在靶點。

核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RNR）是DNA復制和增強細胞活力必不可少的酶，可催化從核苷二磷酸（nucleoside diphosphate，NDP）（RNA構件）到脫氧核糖核苷二磷酸（deoxy-nucleoside diphosphate，dNDP）（DNA構件）的轉化。核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RR）包含兩個大亞基細胞周期調節基因核糖核苷酸還原酶調節亞基 M1（ribonucleotide reductase regulatory subunit M1，RRM1）和兩個小亞基細胞周期調節基因核糖核苷酸還原酶調節亞基 M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2）［7］。目前研究發現，RRM1的水平在整個細胞周期中是穩定表達的，而RRM2的水平在細胞周期的調節中扮演了重要的角色［8-9］。據報道，RRM2能夠促進腫瘤進展［10］，且有研究將其作為預測結直腸癌存活率的預后生物標志物［11］。然而，目前尚不清楚RRM2是否介導結直腸癌的放射敏感性。因此，本研究旨在通過生物信息學的方法，探討影響結直腸癌的放射敏感性的靶點及機制，為結直腸癌治療及靶向藥的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 臨床材料

GSE15781數據從GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載。10例可切除的直腸腺癌患者均接受了術前放射治療，該GSE15781樣本的基因組用于微陣列分析。

1.1.2 試驗細胞

正常人結腸直腸黏膜FHC細胞系、人結腸直腸癌細胞系HT-29、T84、SW480和Caco2均購自BeNa Culture Collection（中國北京）。

1.1.3 主要試劑與儀器

試劑：RPMI-1640基礎培養基、胎牛血清（fatal bovine serun，FBS）（Gibco，美國）；Trizol 試劑（Invitrogen，美國）；Revert Aid First Strand cDNA合成試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）；SYBR-Green聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix試劑盒（Takara，日本）；抗RRM2（ab57653）（Abcam，USA）；pcDNA 3.0載體（Realgene，中國上海）；Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒（Sigma，St. Louis，MO，USA）。

儀器：直線加速器（NMSR600，東軟醫療）；FACScan儀器（Becton Dickinson，Mountain View，CA）；細胞培養箱（GNP1473，上海一恒）；實時熒光定量PCR儀（7500 Fast，ABI，美國）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

收集放射治療前后的腫瘤組織用于基因組微陣列。使用“limma”R軟件包分析差異表達基因（differential expressed genes，DEGs）。通過StarBase平臺（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）比較RRM2在結直腸癌樣本與正常樣本中的差異表達。

1.2.2 細胞培養

所有細胞培養在90% RPMI-1640 + 10% FBS的培養液中，置于37℃、5% CO2的潮濕培養箱中培養。

1.2.3 實時熒光定量PCR

根據制造商的方案，使用TRIzol試劑提取培養細胞的所有RNA。利用Revert Aid First Strand cDNA合成試劑，通過隨機引物逆轉錄1 μg總RNA。使用 SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒檢測RRM2 mRNA的水平。

試驗使用的引物為：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGC-3'（GAPDH的上游引物），5'-GGATGATGTTCTGGAGAGCC-3'（GAPDH的下游引物），5'-GCAGCAAGCG ATGGCATAGT-3'（RRM2的上游引物），5'-GGGCTTCTGTAATCTGAACTTC-3'（RRM2的下游引物）。采用2-ΔΔCT方法測量mRNA的相對水平。

1.2.4 蛋白質印跡

細胞總蛋白在放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）緩沖液中裂解，用8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離后轉移至硝酸纖維素膜上。轉移后，膜在室溫下用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffer solution tween，PBST）中的2%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉1 h。然后，將膜與一抗放置在含有1% BSA的PBST中，在4℃下孵育過夜。最后，將膜與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗孵育1 h后，使用增強型化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）蛋白質印跡檢測試劑觀察條帶。

1.2.5 細胞轉染

將細胞（每孔5×103個）接種到96孔板上。為了過表達RRM2，本研究先將含有RRM2

（ATGGCTTCGGCAGCAGTNTCTCTTGGGGCTAGGCTAATTGGACAGAACGTGCCGAAGTNGCTGTGCGCGGAGTCGTGA，ATGGCTCGTNGAGACTGGCACAAGACGAAGGAAATCATTCTA AAAGGATCTGATTGGATTCTCGGAGAACTCAAAACTTCTGGTCTCCGTGGAAGA和ATGGCGACCATACAAATTGGTGAAGATACGATCACTGTCCTTCAAATTTCCGAACGATGTCTTCTCTTGTTTCACTTGAGCGTTCGCATTCTGGGCTGA）開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列的質?？寺〉降膒cDNA 3.0載體（Realgene）上，再按照制造商的方法指導進行下一步操作。RRM2的siRNA和scramble陰性對照獲自Invitrogen，根據制造商的要求，通過Lipofectamine 2000轉染到細胞中。

siRNA的靶序列為：5'-AAACCCGAGGAGAGAUAUUTT-3'，5'-GGAGCGAUUUAG CCAAGAATT-3'和5'-GCACUCUAAUGAAGCAAUATT-3'。陰性對照的siRNA為5'-UUCUCCGAACGUUGACACGUTT-3'。本研究共設置了3個處理組，分別為轉染陰性對照質粒的對照（normal control，NC）組、RRM2組及si-RRM2組。

1.2.6 細胞放射治療的處理方法

當細胞生長達到80%時，在直線加速器上以2 Gy/min的劑量率在35 cm × 35 cm的視野中進行6 MV X射線照射。不同放射治療劑量（0、2、4、6、8、10 Gy）處理后，采用相關方法對細胞的活力、凋亡及周期進行檢測。通過設置不同的放療劑量，篩選出半數抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50）用于后面的放療處理。之后，本研究設置了6個組別，分別為NC組、si-RRM2組、RRM2組、正常對照3 Gy照射組（3 Gy組）、si-RRM2和3 Gy照射組（si-RRM2+3 Gy組）、RRM2和3 Gy照射組（RRM2+3 Gy組），用于驗證RRM2對細胞及放療處理后的作用

1.2.7 噻唑蘭（MTT）法

將細胞以每孔5 × 103個的量在96孔板中培養24 h，轉染構建好的載體，然后在正常培養液中培養。接下來，將細胞暴露于0、2、5、10 Gy的不同劑量的電離輻射中。板中的每個孔都補充有噻唑蘭（thiazolyl bue，MTT）溶液（5 mg/mL，20 μL）。4 h后，移去培養液，每孔加入100 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。最后，在490 nm處檢測細胞吸光度。所有試驗至少進行3次重復。

1.2.8 細胞凋亡和細胞周期分析

轉染后收集轉染細胞，并將它們接種到6孔板上。用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌細胞，然后用70%乙醇溶液在4℃下固定過夜。將固定的細胞在PBS中洗滌10 min，在RNase A（1 mg/mL）中于37℃下培養30 min，然后進行PI/RNase染色。在FACScan儀器（Becton Dickinson，Mountain View）下分析細胞的凋亡和周期分布。使用流式細胞術和Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞的存在。

1.3 統計學方法

采用SPPS軟件對本研究的數據進行統計分析，所有計量數據以平均值±標準差（x±s）表示。采用獨立樣本t檢驗比較兩組差異的顯著性。采用單因素方差分析檢測兩組以上的組間差異性，進一步采用Tukey法進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 生物信息學篩選基因結果

首先，通過GEO數據庫發現，RRM2在放射治療后的患者組織中顯著升高，且排在首位（圖1a）。進一步通過StarBase平臺分析發現，RRM2表達在結腸癌樣本中升高（圖1b）。預后結果顯示，結直腸癌患者的RRM2高表達也與結直腸癌患者的不良預后有關（圖1c）。因此，本研究選擇RRM2進行后續試驗。

2.2 RRM2調節腫瘤細胞活力的情況

RRM2蛋白在結直腸癌細胞系（T84、SW480、HT-29和Caco2）中的表達顯著高于正常腸上皮細胞系FHC，在T84和HT-29細胞中的表達比其他兩個結直腸癌細胞系更高，差異有統計學意義（F =4.57，P<0.05）（圖2）。這說明，RRM2的過表達會導致HT-29和T84細胞系中RRM2的顯著上調。在處理后的第4天時，3組細胞中RRM2過表達組的細胞活力（3.87±0.25）顯著高于NC組（2.45±0.18）（F=5.74，P<0.05），而si-RRM2組的細胞活力（1.97±0.15）顯著低于NC組（2.45±0.18）（F=5.74，P<0.05），且隨著處理時間驗證，這種趨勢并未改變。因此，以下研究應用了T84和HT-29細胞系。

2.3 不同放射劑量對細胞活力的影響

在不同劑量照射下，HT-29細胞和T84細胞的存活率顯著下降。在兩種細胞系中，經計算，輻射的IC50約為3 Gy。試驗使用3 Gy劑量來照射細胞，分組為NC組、si-RRM2組、RRM2組、3 Gy組、si-RRM2+3 Gy組及RRM2+3 Gy組。3 Gy劑量照射HT-29和T84細胞后，RRM2的表達顯著下調（P<0.05）。用MTT法測定細胞活性，結果如圖3所示，與NC組比較，過表達RRM2可顯著促進細胞活力，而抑制RRM2后，細胞活力被抑制。隨后，在放療處理的同時施加RRM2干擾，發現與3 Gy組比較，過表達RRM2能夠延緩放療對細胞的殺傷作用，而抑制RRM2后這種殺傷作用被顯著促進。這些結果說明，抑制RRM2的表達與3 Gy輻射后效果相同，都顯著抑制了細胞活力，而與NC 組相比，RRM2的過表達和輻照后的細胞活力沒有顯著差異

（表1、2）。

2.4 細胞的放射敏感性變化

與NC組的細胞凋亡率［（8.53±1.04）%和（8.73±0.95）%］相比，過表達RRM2的腫瘤細胞的細胞凋亡率降低［（5.54±0.87）%和（5.80±0.47）%］，而抑制RRM2的表達則會導致細胞凋亡率［（17.58±3.48）和16.70±2.13）%］升高。與單獨使用si-RRM2或單獨輻照相比，si-RRM2和輻照的組合顯示出了更好的效果。在細胞周期分析中，RRM2的過表達會導致S期細胞聚集，而RRM2的敲低會導致G1期細胞聚集［（47.30±6.27）%和46.70±5.14）%］。此外，輻照可導致顯著的G1相停滯［（46.48±6.17）%和47.95±7.15）%］，而RRM2的敲低與輻照一起可導致更顯著的G1相停滯［（71.05±6.04）%和70.98±5.08）%］（圖4，表3、4）。

3 討論

放射抗性是接受根治性放射治療的結直腸癌患者治療失敗和死亡的主要原因。然而，目前對放射治療耐受的機制尚不明確。本研究應用生物信息學的方式尋找可能在介導結直腸癌放射敏感性中起重要作用的樞紐基因。選擇放射治療前后收集結直腸腫瘤組織的GEO基因組微陣列，鑒定出4 269個DEGs。通過差異倍數及統計學意義的聚類分析后發現，RRM2排在差異首位，可能介導結直腸癌的放射敏感性。

目前研究發現，RRM2是一種預后生物標志物，可促進結直腸癌的侵襲性，并預測較差的存活率［12-13］。本研究發現，與正常結腸直腸細胞系相比，RRM2在結腸直腸癌細胞系中具有顯著的高表達。通過對4種結直腸癌細胞的RRM2的表達進行分析，并篩選RRM2高表達的細胞系，進行后續功能學驗證，結果發現：RRM2的過表達會導致細胞活力增強，并導致細胞在S期積累；相反，RRM2的敲低會導致細胞活力降低，并導致癌細胞停留在G1期。本研究數據證實，抑制RRM2的表達能夠抑制結直腸癌的進展，這一作用可能是由RRM2靶向細胞周期進程所參與調控的。目前已研究了多種調節細胞周期的策略來提高癌細胞的放射敏感性。據報道，金雀異黃素［2］、miR-15家族［14］均能通過靶向細胞周期來提高腫瘤的放射敏感性。本文對輻射與RRM2的調節相結合進行了研究，以了解潛在的聯合治療機制。與僅抑制RRM2或單獨放射治療輻照處理相比，通過輻射抑制RRM2可對G1期細胞活力和細胞周期聚集的抑制產生更顯著的影響。由于細胞在G2/M期對輻射最敏感，且G1期比S期更敏感［15-19］，可以推斷，RRM2對結直腸癌細胞的放射增敏作用是由于細胞停留在G1期而不是S期引起的，RRM2可能是結直腸癌放射增敏的潛在治療靶點。此外，本研究發現，抑制RRM2和輻照聯合處理能夠顯著增強這一作用。這一結果說明，RRM2可能是其發揮作用的核心分子，這也進一步驗證了我們的猜想。然而，雖然本研究在體外試驗中驗證了RRM2的作用，但仍缺少必要的體內及臨床樣本數據，這將是未來深入研究的主要方向之一。

本研究證實了RRM2在結直腸癌細胞中的高表達并參與了癌細胞對輻射的反應，發現RRM2介導了結直腸癌細胞的細胞周期調節，結合放射可產生更顯著的作用?？傊?，該研究發現了一種用于結直腸癌放射治療的新型潛在靶標RRM2，并鼓勵進一步研究以了解其調控機制。

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