橙皮苷通過抗炎和抗氧化對骨質疏松大鼠模型的影響＊

義明東，唐新橋，張 強

（南華大學附屬湘潭市中心醫院 湘潭 411100）

骨質疏松癥（Osteoporosis）是一種消耗性的疾病，主要機制是破壞骨質及骨骼的微結構功能[1-2]；骨折是其主要并發癥，常因一些無關緊要的小損傷引發骨折，嚴重降低了骨質疏松癥骨折患者的生活質量；有文獻表明，目前世界上因骨質疏松癥引起的骨折患者超過890 萬例/年[3]。但是，單純的骨質疏松癥極易被忽視，導致診斷及治療不及時。骨質疏松癥受到各種危險因素的影響，包括家族史、性別、酗酒和濫用藥物、飲食和鍛煉以及女性的雌激素水平。絕經后骨質疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PO）是骨質疏松癥的一種特殊類型，指由絕經引起的相關雌激素戒斷所引發的骨質疏松癥；其主要特征是伴隨著雌性激素的進行性下降，導致骨量降低和骨微結構破壞，最終使得骨脆性增加，其發病率逐年上升，已經成為全世界絕經后老年女性的主要健康問題之一[4-5]；給全世界絕經后女性患者及家庭帶來了極大的困擾。據估計，2010 年在美國，有多達1020 萬65 歲及以上的成年人患有骨質疏松癥，預計每年都會增加[6]。毫不奇怪，年度骨質疏松癥總體發病率上升后，絕經后骨質疏松癥患病率也會有一定程度的增加[7]。因為這些事件每年的死亡率為20%[7]。根據流行病學研究，2010 年生活在歐洲聯盟的2200 萬婦女和550 萬男子患有骨質疏松癥[8-9]，有超過350 萬的新殘疾婦女得以維持[10]。特別值得一提的是，預計在印度這個國家里，50 歲以上人口總數增幅最高，從2013 年的1.2 億增加到2050 年的6.2 億[11]。在埃及，有報告表明，絕經后婦女中存在骨質疏松癥（28.4%）和骨量減少（53.9%），并且全球范圍內其發病率也呈上升趨勢[4]。

及早預防及治療骨質疏松癥是降低絕經后婦女骨折并發癥的風險的最佳治療方案[3]；當今臨床上用于治療骨質疏松的藥物種類繁多，如降鈣素、二膦酸鹽類、甲狀旁腺激素及雌激素替代療法等藥物，包括阿侖膦酸鈉（Alendronate，AN）在內的二膦酸鹽是目前臨床上治療絕經后骨質疏松癥的一線藥物。但骨質疏松癥是一種長期的病理過程，常常需要進行長期的治療[3]，導致藥物不良反應的發生率及嚴重程度大大的增加，例如增加心腦血管意外發生的風險、胃腸道反應、神經系統疾病，并易引發各類癌癥的擴散或發展[3]。在21 世紀后，世界各國對骨質疏松癥治療的醫學研究越來越多，但是各國的藥理學家發現，目前臨床上治療骨質疏松癥的藥物基本上都比二膦酸鹽類藥物有著更多的副作用和器官毒性。有充分的證據證明雌激素替代療法（Estrogen replacement therapy，ERT）對老年和絕經后婦女的骨質疏松癥發揮抗骨質疏松的作用[1]，不幸的是，連續的使用ERT 具有嚴重的副作用，例如乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌的發生或進展加速[1]。因此，需要新的藥物來預防或治療絕經后骨質疏松，或者減輕副作用。故進入21 世紀后，各國的藥理學家深入的探索了骨質疏松癥的治療及預防新方法。

大量文獻表明炎癥反應和氧化應激反應過度是絕經后婦女易患骨質疏松癥重要的發病機制[2,5,12]。絕經婦女的共同特征是體內抗氧化劑水平的降低及氧化應激反應過度，并且機體發生氧化應激后，可以使體內的炎癥因子水平升高；氧化應激反應一般是因自由基的過量產生、機體內源性抗氧化機制表達水平降低或體內炎性分子水平的增加而增加[12]。骨代謝指標及骨周轉換標志物指標可體現骨轉換速度的水平，顯示骨質疏松的程度。橙皮苷（Hesperidin，HP）是陳皮、柑橘等柑橘屬植物果實中的主要化合物，同時也是主要的藥效成分[13]；具有多種多樣的藥理活性，例如抗炎、抗氧化、改善微循環、抗高膽固醇血癥、抗癌的作用。橙皮苷的抗炎、抗氧化和改善微循環的作用已通過各種研究報告，使用各類分析系統進行了報道[13-15]。橙皮苷在動物模型及動物實驗中已被證明可通過降低炎性細胞因子水平和抗氧化作用來減輕炎癥反應及其所導致的疼痛反應[16]。同時，橙皮苷在紫外線B輻射引起的皮膚損傷的小鼠模型中，被證明有著抗氧化應激和抗炎的作用[17]，這是通過下調機體所分泌的炎性細胞因子包括腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6[18]來發揮作用。其可通過多途徑對絕經后骨質疏松癥產生影響，且暫未有文獻或實驗證明橙皮苷具有明顯的副作用，臨床上目前越來越多的把橙皮苷用于絕經后骨質疏松癥的輔助治療，是預防和治療絕經后骨質疏松的潛在藥物；但橙皮苷的作用機制仍未探索完善，近年來，各國的藥理學家對橙皮苷治療絕經后骨質疏松的作用機制的研究越來越多。橙皮苷可以抑制破骨細胞的分化[19]；但針對于抗炎及抗氧化機制所發表文獻及實驗較少。本實驗通過建立摘除雙側卵巢誘導骨質疏松的大鼠模型并用各種濃度橙皮苷來干預，設立正常及OVX 對照組及AN 的干預作為對照，觀察橙皮苷對OVX大鼠模型的炎癥因子及超氧化物指標變化，探討橙皮苷通過抗氧化和抗炎機制在絕經后骨質疏松癥的抗骨質疏松作用。

1 材料與思路

1.1 實驗材料

本實驗中使用的主要實驗材料見表1。

表1 實驗材料

1.2 研究思路

具體實驗研究思路見圖1。

圖1 實驗研究思路

2 方法

2.1 實驗方案

2.1.1 模型的建立

手術之前將SD 大鼠在正常條件下飼養4周，在進行手術前，讓SD 雌性大鼠適應代謝籠環境7 天，自由進食和水；然后，將大鼠隨機分為假手術組（Sham 組）和OVX 組；所有的實驗性手術均在戊巴比妥（50 mg·kg-1）麻醉狀態下進行。隨后將OVX 組大鼠進行雙側去卵巢手術，將Sham 組大鼠進行假手術；并在標準實驗條件下繼續飼養4 周，以成功建立OVX 大鼠模型；4周后隨機選擇12 只OVX 及假手術組大鼠（各6 只大鼠），通過使用骨密度儀統一測定其距髁間窩約4 mm附近干骺端的骨密度（Bone mineral density，BMD，g·cm-2）來驗證OVX大鼠模型建立成功。

2.1.2 實驗方案

將30只OVX 大鼠隨機分為5組，用來驗證模型建立成功的正常雌性大鼠6 只為正常對照組，共6 組；具體分組及處理如下：Sham組：Sham大鼠+1% CMC混懸液；模型組：OVX 大鼠+1% CMC 混懸液；HP1 組：OVX大鼠+5 mg·kg-1HP；HP2 組：OVX 大鼠+10 mg·kg-1HP；HP3 組：OVX 大鼠+20 mg·kg-1HP；AN 組：OVX 大鼠+2.5 mg·kg-1AN。

各組大鼠均使用1% CMC 混懸液作為溶媒劑，通過上述的藥物及濃度，保證每只大鼠每日入量一致，在每日早晨經口灌胃給所有大鼠，均在手術后第4 周開始給藥，共持續10周。每只大鼠在被處死前均置于在代謝籠中24 h；從所有大鼠的腹主動脈中收集血液樣品，并離心分離血清，將血清樣品保存在-20℃的標本柜中；用來測定不同的生化參數。立即將各組大鼠稱重；處死后，去除所有大鼠的左股骨，包裹股骨，將股骨儲存在-20℃的標本柜中；用來測定骨密度和進行生物力學分析。

2.2 骨鈣磷平衡指標的測定

2.2.1 血清鈣離子測定

采用甲基麝香草酚藍（Methyl thymol blue complexon， MTB）法測得Ca2+水平；用儲存的血清測定鈣水平，按生化試劑盒說明書操作，通過在酶標儀儀器上測定520 nm的吸光度來計算游離鈣濃度。

2.2.2 血清磷離子測定

采用鉬酸銨分光光度法測得血清磷離子（P5+）的水平；同樣用儲存的血清測定磷水平，按生化試劑盒說明書操作，通過在酶標儀儀器上測定660 nm 的吸光度來計算血清中磷的含量。

2.3 血清炎性分子水平的測定

使用ELISA 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）的水平；使用儲存的血清，嚴格按照ELISA 試劑盒的說明書來操作，并且通過酶標儀測定450 nm 處的吸光度值測定血清IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。

2.4 骨氧化應激因子的測定

取出儲存的股骨，在冷0.9%生理鹽水中勻漿，達到勻漿（10%），然后在離心機中以15000 r-min 離心，獲得澄清的上清液。

2.4.1 TBARS的測定

采用TBAR 法估計骨氧化應激酶硫代巴比妥酸反應物質（Thiobarbiturates，TBARS）；在生化試劑盒中，加入不飽和脂肪酸的氧化產物醛類和實驗標本，生成有色物，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記，通過酶標儀測定最大吸收峰于450 nm 處的吸光度，計算大鼠左股骨中TBARS的水平。

2.4.2 GSH、GPx的測定

使用DTNB 法測得谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化氫酶（Glutathione peroxide，GPx）的水平；嚴格按照生化試劑盒說明書操作，加入一定量的DTNB 試劑和實驗標本，生成的復合物，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記，在412 nm處有特征吸收峰；并且吸光度與GSH含量成正比，與GPx含量呈反比；412 nm處吸光度的上升即可反應GSH 的活性。412 nm 處吸光度的下降即可反應GPx 的活性；可測得大鼠左股骨中GSH和GPx的水平。

2.4.3 GR、GST和CAT的測定

采用紫外吸收法測定谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）、谷胱甘肽-S-轉移酶（Glutathione-S-transferase，GST）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）的水平；將實驗標本分別與GR 測定液、GST 測定液、CAT 測定液混勻；通過酶標儀測定240 nm 波長的初始吸光度和1 min 后的吸光度。計算兩者間的差值，即可測得大鼠左股骨中GR、GST、CAT的水平。

2.5 骨周轉換指標的測定

在骨轉換指標試劑盒中采用ELISA 法測得大鼠血清中骨特異性堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、β 膠聯降解產物（β-Crosslaps，β-CTX）和酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）的水平和血清骨鈣素（Osteocalcin，OC）的活性；分別將預先包被人骨特異性堿性磷酸酶（B-ALP）捕獲抗體、人骨特異性堿性磷酸酶（B-ACP）捕獲抗體、人骨特異性堿性磷酸酶（β-CTX）、人骨特異性骨鈣素（OC）捕獲抗體加入96孔板中，設置樣本孔和標本孔，分別加入標準品和實驗標本，再加入HRP 標記的檢測抗體，通過酶標儀檢測在450 nm 波長的吸光度，就可以計算出血清中ALP、ACP、β-CTX和OC的水平。

2.6 骨密度測量

骨密度分為面積骨密度和體積骨密度；面積骨密度是指所測單位面積所含有的骨礦物質。使用儲存的股骨以1 mm·s-1的速度在數字DR 雙能X 線骨密度測試儀上測得大鼠左股骨的面積骨密度，用g·cm-2來表示大鼠的BMD。

2.7 生物力學的評估

通過進行三點彎曲實驗測定大鼠左股骨的生物力學參數。在三點彎曲實驗儀器上的測試件中間及兩端位置分別測量測試件的長、短外徑，然后將制備好的大鼠左股骨放置于儀器的支座上，以測試件與支座的接觸為點接觸，其橫截面短軸的方向與載荷方向一致，記錄位移（mm）和中心載荷；直至骨折發生在骨中?？捎么朔椒y定楊氏模量（Young’s mod）、最大應力（Maximum load）、最大載荷（Maximum load）和能量吸收（Engergy）的水平。

2.8 SIRT1基因檢測

2.8.1 逆轉錄PCR

采用cDNA 分離試劑盒，以大鼠股骨作為標本常規提取RNA，使用逆轉錄PCR 法進行1 步PCR：37℃15 min，最后85℃ 5 s，使酶變性失活，最后4℃保存10 min。沉默調節蛋白1（Recombinant Sirtuin 1，SIRT1）基因上游引物：5’-CCAGATCCTCAAGCCATG-3’，下游引物：5’-TTGGATTCCTGCAACCTG-3’。

2.8.2 PCR檢測

PCR 檢測按照試劑盒說明書進行，PCR 反應條件：第一步95℃預變性30 s；第二步95℃變性5 s，第三步60℃退火40 個循環，每個循環31 s，最后進行溶解階段。所有結果經GAPDH 內參校正后，ΔΔCt 法計算最終結果并采用2-ΔΔCt表示。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 橙皮苷對大鼠體質量的影響

在各組大鼠治療期間，Sham 組、OVX 各組大鼠均顯示體質量增加；而經過HP 或AN 治療后顯著降低了大鼠的體質量增加量（P<0.001）（圖2），且HP 的影響呈濃度依賴性（圖2）；這些結果提示經過去卵巢手術后，雌性大鼠的體質量增加幅度較前顯著增加，經過HP 及AN 處理后可有效的抑制大鼠體質量的增加幅度。

圖2 HP對大鼠體質量增加水平的影響（±s）

3.2 橙皮苷對Ca2+和P5+的影響

在骨質疏松期間，測得Ca2+和P5+水平升高。實驗結束后，與Sham 組大鼠相比，OVX 組大鼠均表現出增加的Ca2+和P5+（圖3），HP 顯著降低了Ca2+和P5+的水平（圖3）（P<0.001）。同時，HP的影響呈濃度依賴性，AN組表現為類似的結果，差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖3 HP對大鼠的血清Ca2+和P5+水平的影響（±s）

3.3 橙皮苷對炎性分子的影響

機體內炎癥反應在骨質疏松發生進展和中起著重要的作用。與Sham 組相比，OVX 組大鼠均表現出炎性分子水平的升高：IL-1β、TNF-α 和IL-6（圖4），HP 治療組顯著降低了OVX 大鼠IL-1β、TNF-α 和IL-6 的水平，且呈濃度依賴性影響（圖4）。AN 組表現為類似的結果。差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖4 HP對大鼠的血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影響（±s）

3.4 抗氧化酶和氧化應激參數分析

OVX 組大鼠與Sham 組大鼠相比，氧化應激參數在骨質疏松期間表現為TBARS升高和GSH、GST、GR、GPx 和CAT 下降（圖5）。HP 和AN 給藥處理后均顯著降低了OVX 大鼠的TBARS 水平和升高了OVX 大鼠GSH、GST、GR、GPx 和CAT 的水平，且呈濃度依賴性（圖5），差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖5 HP對大鼠股骨TBARS、GSH、GST、GR、GPx和CAT水平的影響（±s）

3.5 骨周轉換指標參數分析

下列各圖表清晰的顯示了各組大鼠在給藥后骨轉換指標參數的影響。OVX 組大鼠相比于Sham 組來說，表現為ALP、ACP、β-CTX 和OC 指標的升高（圖6）。HP 顯著降低了OVX 大鼠ALP、ACP、β-CTX和OC 的水平，且影響呈濃度依賴性（圖6）。AN 組表現為類似的結果，差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖6 HP對大鼠血清ALP、ACP、β-CTX和OC水平的影響（±s）

3.6 橙皮苷對骨密度的影響

各組大鼠之間BMD 的實驗數據結果如圖7 所示。與Sham 組大鼠相比，OVX 組表現出BMD 水平的下降（圖7）。經過HP 給藥處理后的各組大鼠顯示了OVX大鼠BMD 水平的上調（圖7），且影響呈濃度依賴性。AN 組跟HP 處理后結果類似，差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖7 HP對大鼠股骨BMD水平的影響（±s）

3.7 生物力學參數分析

OVX 組大鼠表現為骨生物力學參數楊氏模量、最大應力、最大載荷和能量吸收減少，相對于Sham 組來說（圖8）。OVX 誘導的大鼠用HP 給藥處理后顯著增加了楊氏模量、最大應力、最大載荷和能量吸收的水平（圖8），而且影響呈濃度依賴性，AN 組表現為類似的結果，差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖8 HP對大鼠股骨楊氏模量、最大應力、最大載荷和能量吸收水平的影響（±s）

3.8 PCR分析

與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠表現出SIRT1的表達增加（圖9）。HP 給藥后大鼠顯著以濃度依賴性的方式減少了OVX 大鼠SIRT1 的表達（圖9）。AN 組表現為類似的結果，差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖9 HP對大鼠股骨SIRT1表達水平的影響（±s）

4 討論

大量文獻及研究證明，絕經后老年婦女因為機體的雌激素水平逐步下降，會導致骨形成的減少，從而破壞骨平衡，容易在組織的層面繼發骨質疏松癥，在機體內的發生發展通常需要長期的演變過程[5]。絕經后骨質疏松癥的發生發展機理可以進行多方面的研究[3]，其治療方案的研究也越來越多。絕經后骨質疏松癥的直觀病理機制是機體內雌激素水平下降和機體的衰老，主要在于增加了炎性因子的產生，發揮破骨細胞的特性；機體內的炎性因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）增加，放大了RANKL 的表達，通過這一機制表達的增加，促進體內破骨細胞的形成[20]。局部和全身性骨丟失也是炎癥性風濕性疾病的標志，反映了骨和機體炎癥反應發生之間相互作用的密切聯系，導致破骨細胞過度激活，從而導致骨形成和骨吸收的解偶聯。機體骨吸收作用的信號通路主要是核因子-κB（NF-κB）配體受體激活劑（RANKL）系統，其主要是由成骨細胞表達；它與破骨細胞前體和成熟破骨細胞上的受體RANKL 結合，誘導破骨細胞生成和骨吸收。SIRT1 基因的表達與NF-κB 配體受體激活劑（RANKL）系統的表達息息相關；此前研究表明，絕經后雌二醇水平的降低會導致血管內皮細胞功能障礙和促紅細胞生成素水平降低[3]；而機體血流量與BMD呈正向相關關系并近乎同時發生[4]，說明體內雌激素水平的下降，可以引起血流量水平的變化，是骨質疏松癥發生發展的一大危險因素。通過這一發病機制，表明增加骨骼內血液供應的有效植物成分及藥物可能對治療骨質疏松癥有效；血清中的骨代謝（Ca2+、P5+、ALP、ACP、β-CTX 和OC）的水平變化情況可以反映機體骨轉換的狀態，體現機體的骨質疏松程度；血清中的炎性細胞因子指標及股骨的氧化應激因子及抗氧化酶指標可反映機體的炎性反應及氧化應激反應水平；骨密度和骨微細結構變化可以反映出骨量的變化，楊氏模量、最大應力、最大載荷和能量吸收的測定可以評估骨骼的骨質水平，SIRT1 基因的表達變化可以反映NF-kB 配體受體激活劑（RANKL）系統在機體內的表達水平。本實驗以SD 雌性大鼠的骨密度、血清骨代謝指標、炎性因子、氧化應激因子、骨微觀結果變化及SIRT1基因的表達為主要變化指標研究橙皮苷通過抗炎及抗氧化作用于去卵巢大鼠所起得的治療效果。

骨質疏松癥在骨折發生之前很難明確診斷，影像學表現也不明顯，所以被稱為是一種沉默的疾病[21]。從中醫的角度分析，在數千年以前，各種各類的中草藥就已被用于治療各方面的疾病，特別是對慢性疾病，中草藥不僅能促進骨折的愈合，而且安全性及性價比均比化學藥品更高[22-24]，隨著人們對骨質疏松癥的新療法的迫切需要，從中藥里面發現潛在的骨活性化合物已經成為一個熱門的研究領域；并且由于目前用于長期治療骨質疏松癥的臨床藥物所帶來的的副作用，導致在世界范圍內，中草藥用于治療絕經后骨質疏松已經成為21 世紀的研究熱點之一。很多藥理學家已經在開展中草藥生物活性因子的作用及相關機制的研究，并取得一定的成果，HP 是柑橘屬植物果實中的主要活性成分，是大量藥理學家近年來研究出的可用于治療絕經后骨質疏松的一種潛在藥物[4-5,13-14]，是治療絕經后骨質疏松的潛在藥物之一。

多年來的研究已經證明了骨骼作為一個器官的核心作用，與其他幾個組織不斷地交換和調節[25]。普遍認為，骨骼具有運動、物理性的保護內部器官和調節礦物質穩態方面的作用，還可通過成骨細胞分泌骨鈣素影響男性生育能力和認知功能[26-27]。在骨重塑過程中，機體可以通過靶向釋放和摻入骨基質的方式，來維持機體血清內Ca2+和P5+之間的動態平衡[25]。重塑在整個骨穩態中的重要作用體現在有利于骨吸收，而不是有利于骨形成，骨重建受損是導致骨質疏松癥等骨病理的基本病理生理機制[25]。正常人體及正常大鼠機體的骨質吸收和骨質形成是一個動態的平衡，而絕經后婦女容易繼發骨質疏松，其原因是雌激素水平的下降，導致機體內破骨細胞增殖分化過于活躍，導致機體的骨重建失衡，使得機體骨吸收速度大于骨形成速度，抑制機體新骨的形成，最終導致骨質疏松，屬于一種高轉化性骨質疏松癥。在本實驗中，OVX 大鼠血清中的OC水平升高可以表明OVX大鼠新形成的成骨細胞處于活躍狀態，而ALP、ACP 及β-CTX 水平的變化是反映機體骨形成和骨轉換的重要生化指標。實驗結果表明成功建立高轉化性骨質疏松癥模型，與絕經后骨質疏松癥的臨床特征相符，表明成功建立OVX骨質疏松癥大鼠模型，可用來作為絕經后骨質疏松癥的相關研究。

根據先前的研究，機體內的超氧化物主要包括活性氧（Reactive oxygen species，ROS）及活性氮（Reactive nitrogenspecies，RNS），主要是ROS 參與雌激素缺乏誘導的骨質疏松癥[12]；過多的過氧化氫被認為是損傷細胞（包括軟骨細胞）過程中的關鍵介質[28]；活性氧是有氧代謝的副產物，如羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫。通過氧化還原反應產生的，并且是氧的活性衍生物[29]；在生理條件下，ROS作為信號分子參與調節不同的生物過程。H2O2對大鼠軟骨細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，但加入HP 后抑制作用明顯減弱[30]，來自動物研究的證據支持ROS 對骨骼健康的有害影響[31-35]。在該實驗中，發現OVX 大鼠相對于Sham 組大鼠來說，增加了TBARS 的水平并降低了內源性抗氧化酶的水平；證實了雌激素缺乏可在一定程度上增強氧化應激反應。HP 能夠通過激活或增加機體內源性抗氧化酶（GSH、GST、GR、GPx 和CAT）的活性，使得體內的氧化應激反應下降[36]，預防骨質疏松癥。破骨細胞因子IL-6、IL-17、干擾素-γ、TNF-α、巨噬細胞集落刺激因子、單核細胞趨化蛋白-1等促進骨吸收、抑制成骨細胞[37]。IL-6 是多發性骨髓瘤中腫瘤漿細胞產生的重要破骨因子，也是絕經后骨質疏松癥骨質丟失的主要預測因子[38]。TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 等Th1 型促炎細胞因子的過度產生是繼發性和原發性骨質疏松癥的基礎[37]。在實驗中，OVX 組大鼠的促炎細胞因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平顯著上升；HP 治療可顯著降低OVX 組大鼠的促炎細胞因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平；OVX 各組大鼠相對于Sham組大鼠，OVX 大鼠發生了骨質丟失并且機體內的氧化應激因子TBARS堆積升高且抗氧化酶水平下降，導致機體氧化應激水平升高。OVX 組大鼠經過HP 或AN的治療，有效地清除了氧化應激因子TBARS，使抗氧化酶GSH、GST、GR、GPx 和CAT 升高；降低了機體的氧化應激水平，減輕了骨質的丟失并延緩了骨質疏松的發生，表明HP 對去卵巢大鼠骨質和骨量具有保護作用；這一實驗數據與Olalekan 等[39]的數據一致，HP能顯著抑制三氯乙烯誘導的果蠅體內ROS 的過量產生，提示其具有清除ROS的作用[39]，在很大程度上恢復了氧化還原和抗氧化平衡[39]。

在此實驗中，OVX 大鼠由于雌激素缺乏可導致血鈣及血磷水平升高，而經過HP 及AN 治療后大鼠的血Ca2+和P5+水平有所下降，可以有效的治療骨質疏松癥。此前的文獻顯示，血Ca2+水平的增加可能是由于改變了腸道內源性抗氧化劑狀態，促進了腸道對Ca2+的吸收[3]。骨周轉換物的指標可反映骨形成功能，在此實驗中，顯然，OVX 大鼠的骨周轉換物質水平上升，相對于Sham 組來說，HP 可以有效的通過降低骨周轉換物來治療骨質疏松癥。BMD 是指單位組織或器官內礦物質的含量，BMD 是反映骨量的主要指標，也是決定骨強度的主要因素，骨骼骨密度水平的變化可以反應出骨量的細微變化。OVX 組大鼠的BMD 水平相對于Sham 組大鼠明顯降低，HP 及AN 治療后OVX 大鼠BMD 顯著升高，表明了HP 能有效地增加OVX 大鼠的骨量。三點彎曲實驗可以精準的反映骨骼的彎曲功能，而相關生物力學參數（楊氏模量、最大應力、最大載荷和能量吸收）均可通過三點彎曲實驗測得，在此實驗中，OVX 組大鼠的生物力學參數有著顯著的下降，而經過HP 及AN 治療后，OVX 大鼠的生物力學參數有著明顯的提升。進一步表明了HP 具有抗骨質疏松作用。以前的研究表明[41]SIRT1 在骨代謝和質量中起到重要的作用。植物相關成分對骨質疏松癥具有潛在的影響[40]，并且使得SIRT1 也增加了增殖和分化。當前研究表明，SIRT1表達的減少，可增加嚙齒動物中的BMD[41]。在目前的實驗方案中，OVX 組大鼠SIRT1基因的表達顯著上升，經過HP 及AN 治療后顯著降低。故間接的反映了橙皮苷的抗骨質疏松作用。

在當前對HP 的相關研究中，在HP 通過抗炎和抗氧化作用在絕經后骨質疏松癥這一領域研究相對較少，相反，研究其他的作用機制相對較多。但此前大量文獻表明橙皮苷具有抗炎及抗氧化的作用[13-15]，而炎癥反應及氧化應激是PO 的主要發病機制之一[2,5,12]，通過此次實驗研究發現，HP 可呈濃度依賴性的方式通過維持Ca2+和P5+水平的平衡、降低促炎細胞因子、增強抗氧化能力、降低骨周轉換物質水平、增強BMD和降低SIRT1 基因的表達來在OVX 誘導形成的骨質疏松癥大鼠中發揮抗骨質疏松作用；表明橙皮苷可通過抗炎及抗氧化作用機制在一定程度上預防或治療絕經后骨質疏松癥。

但本實驗仍有不足之處，OVX 大鼠的研究模型有一定的局限性且未涉及細胞實驗，因此需要進一步的細胞研究或其他體外研究驗證其作用機制。同時，HP的濃度選取是否覆蓋橙皮苷對OVX 大鼠的各項生化指標、骨生物力學及基因的影響濃度峰值尚不可知，需要更多的體外研究驗證HP 其濃度依賴性?？傊?，HP 可以作為治療絕經后骨質疏松癥的潛在藥物，但具體治療效果需進一步進行相關實驗甚至臨床相關研究。