參仙升脈口服液化學成分的UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS快速分析＊

宗時宇，狄志彪，劉琪琪，黃壯壯，張 紅，李 曄，劉 峰，劉 洋＊＊

（1.陜西省中醫藥研究院中藥研究所 西安 710003；2.陜西中醫藥大學藥學院 咸陽 712046；3.陜西步長制藥有限公司 西安 710075）

參仙升脈口服液是我國第一個專門治療緩慢性心律失常的專利中成藥，具有溫補心腎、活血化瘀的作用[1]?，F代臨床上常用于治療輕、中度竇房結心動過緩（心率>50次）和輕度病態竇房結綜合征不合并有室上性快速心律失常的心腎陽虛，寒凝血脈證。全方由紅參、淫羊藿、補骨脂（鹽炙）、枸杞子、麻黃、細辛、丹參、水蛭等八味中藥組成。經查閱文獻，僅發現參仙升脈口服液中單味藥材的化學成分研究報道[2-5]。其中，紅參是經人參蒸制干燥而成，主要有效成分為人參皂苷[6]，其特有成分為人參皂苷Rg3[2]；淫羊藿有效成分主要為淫羊藿總黃酮和淫羊藿多糖[7]；補骨脂主要成分為補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂二氫黃酮等[8]；枸杞子活性成分主要為多糖類[9]；麻黃主要成分為生物堿，含有麻黃堿、偽麻黃堿等[10]；細辛、丹參、水蛭的主要成分分別為木脂素類、丹參酮類、水蛭素[11-13]。

中藥復方藥味多，化學成分復雜，其療效是藥物中多種成分協同作用的結果[14]，單一中藥成分的分析并不能夠體現中藥復方的整體性和化學成分的復雜多樣性。盡管參仙升脈口服液的臨床療效顯著，但缺乏系統的化學成分研究，其發揮藥效的化學物質基礎尚不明晰。且有個案報道服用參仙升脈口服液數天后患者出現肝功異常，而引起這一不良反應的機制也未明確[15-16]。超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS）具有高分辨率、高精度及快速分析等特點，可以提供可靠的化學結構鑒定信息，是目前復雜中藥體系中化學成分快速鑒別的主要技術之一。本研究借助UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 技術，闡明參仙升脈口服液的整體化學組分，為其進一步藥效成分的明確、全面質量控制及安全性評價提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型超高效液相色譜系統和Q Exactive Focus 型質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Mill-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；SQP 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。

1.2 藥物與試劑

參仙升脈口服液（批號181202）由陜西步長制藥有限公司提供；蘆丁對照品（批號100080-201811）購自中國食品藥品檢定研究院，補骨脂苷對照品（批號CHB-B-163）、異補骨脂苷對照品（批號CHB-Y-280）、補骨脂酚對照品（批號CHB-B-099）購自成都克洛瑪生物科技有限公司，補骨脂素（批號110739-200310）、異補骨脂素（批號0738-200108）購自中國藥品生物制品檢定所，所有對照品純度均>98%；甲醇為色譜級，甲酸為質譜級（美國Thermo Fisher Scientific公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

稱取蘆丁、補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂酚、補骨脂素、異補骨脂素對照品約10 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，作為對照品貯備液；再取各對照品貯備液用甲醇稀釋至適宜濃度，即得各對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備

取1 mL 參仙升脈口服液內容物于10 mL 容量瓶內，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2 檢測條件

2.2.1 色譜條件

Thermo Accucore aQ C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相采用甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序為0-13 min，5%-60% A；13-27 min，60%-95% A；27-30 min，95% A。流速0.3 mL?min-1；進樣量2 μL；柱溫30℃。

2.2.2 質譜條件

離子源為加熱電噴霧離子源（H-ESI），噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣（N2）流量40 arb，輔助氣流量10 arb，輔助加熱器溫度350℃，毛細管溫度320℃，S-lens射頻水平50，自動增益控制（AGC）106。離子檢測模式采用正、負離子切換，掃描模式Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率為70000，dd-MS2分辨率為35000；掃描范圍m/z120-1800，碰撞能量30 eV、50 eV、70 eV。

2.3 數據處理

根據質譜精確相對分子量信息，選擇一級準分子離子峰質荷比實測值與理論值誤差小于5 ppm 的分子與自建的參仙升脈口服液化學成分數據庫信息進行匹配，初步推測化合物信息。采用Xcalibur 2.0軟件進一步對目標化合物色譜峰及其二級碎片離子信息進行提取，并結合相關化學成分數據庫和文獻信息對目標化合物進行鑒定和確證。

3 結果

利用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS，通過對不同離子模式下的供試品基峰總離子流圖（圖1）對比可以看出，參仙升脈口服液在正負離子模式下響應均較好，在0-30 min 內均有密集的響應信號，大部分化合物均有出峰，隨著流動相極性的降低，化合物出峰變少，表明參仙升脈口服液中主要以極性化合物為主。從參仙升脈口服液中共檢測到160 種化學成分，其中響應度高，具有二級碎片離子的化學成分有62 種，其他成分因自身含量低或離子化能力弱，從而未發生裂解產生相應的碎片離子，具體化合物信息見表1。

表1 參仙升脈口服液化學成分的UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 鑒定結果

圖1 參仙升脈口服液UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 總離子流圖

續表

3.1 黃酮類

絕大多數植物體內都含有黃酮類化合物，本研究從參仙升脈口服液中鑒定的黃酮類成分共有29種，主要包括淫羊藿苷、寶藿苷Ⅶ、朝藿定A 和大豆苷等。以114 號代表性化合物淫羊藿苷質譜裂解過程為例，在正離子模式下可見準分子離子峰m/z677.24 [M+H]+，擬合其分子式為C33H39O15，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子m/z531.19 [M+H-C6H9O4]+，m/z369.13 [M+H-C6H9O4- C6H10O5]+，相應質譜裂解途徑見圖2。

圖2 淫羊藿苷可能裂解途徑

3.2 有機酸類

從參仙升脈口服液中鑒定的有機酸類成分有24 種，主要包括丹參素、咖啡酸、異亮氨酸、煙酸和琥珀酸等。以44 號代表性化合物丹參素質譜裂解過程為例，在負離子模式下可見準分子離子峰m/z197.05[M-H]-，擬合其分子式為C9H10O5，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子m/z135.05 [M-H-H2OCO2]-，m/z123.05 [M-H-C2H2O3]-，相應質譜裂解途徑見圖3。

圖3 丹參素可能裂解途徑

3.3 生物堿類

從參仙升脈口服液中鑒定的生物堿類成分有21種，主要包括麻黃堿、甲基麻黃堿、木蘭花堿、肌苷和腺苷等。以47 號代表性化合物麻黃堿質譜裂解過程為例，在正離子模式下可見準分子離子峰m/z166.12[M+H]+，擬合其分子式為C10H15NO，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子m/z121.06 [M+HC2H7N]+，m/z103.05 [M+H-C2H7N-H2O]+，相應質譜裂解途徑見圖4。

圖4 麻黃堿可能裂解途徑

3.4 萜類

從參仙升脈口服液中鑒定的萜類成分有19種，主要包括丹參酮IIA、表丹參隱螺內酯和α-蒎烯等。以147號代表性化合物丹參酮IIA 質譜裂解過程為例，在正離子模式下可見準分子離子峰m/z317.11 [M+Na]+，擬合其分子式為C19H18O3，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子m/z69.07 [M+Na-C14H9O3Na]+，m/z67.05 [M+Na-C14H9O3Na-H2]+，相應質譜裂解途徑見圖5。

圖5 丹參酮ⅡA可能裂解途徑

3.5 苯丙素類

從參仙升脈口服液中鑒定的苯丙素類成分有15種，主要包括補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素和異補骨脂素等。以65 號代表性化合物補骨脂苷質譜裂解過程為例，在正離子模式下可見準分子離子峰m/z389.08 [M+Na]+，擬合其分子式為C17H18O9，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子m/z227.03 [M+Na-C6H10O5]+，m/z185.04 [M+Na-C11H8O4]+，相應質譜裂解途徑見圖6。

圖6 補骨脂苷可能裂解途徑

3.6 皂苷類

從參仙升脈口服液中鑒定的皂苷類成分有12種，主要包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 和人參皂苷Rb1等。以105 號代表性化合物人參皂苷Rg1 質譜裂解過程為例，在正離子模式下可見準分子離子峰m/z823.48 [M+Na]+，擬合其分子式為C42H72O14，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子m/z643.42 [M+Na-C6H12O6]+，m/z203.05 [M+Na-C36H60O8]+，相應質譜裂解途徑見圖7。

圖7 人參皂苷Rg1可能裂解途徑

3.7 其他類

此外，本研究還從參仙升脈口服液中鑒定出了多種其他類化合物，包括10 種酯類、9 種糖類、8 種揮發油類、7種酚類和6種酮類，具體結果見表1。

4 討論

參仙升脈口服液由八味中藥組成，化學組分十分復雜，其藥效與不良反應物質基礎均不明晰。本研究采用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 技術，正負離子切換掃描，較為全面地對參仙升脈口服液中的化學成分進行了快速、系統的分析，首次從中鑒定出160個化學成分。參仙升脈口服液的化學成分結構類型主要包括黃酮類、皂苷類、生物堿類、有機酸類、苯丙素類、萜類等。其中，黃酮類、皂苷類、生物堿類和萜類化合物主要歸屬于藥材淫羊藿、紅參、麻黃和丹參。

現代藥理學研究表明，黃酮[38]、生物堿和皂苷類化合物[39]對心血管疾病具有顯著的藥理活性；某些苯丙素[40]和有機酸類成分如咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸等能抑制血小板聚集、抗血栓[41]；萜類化合物可能具有一定的強心作用[42]。已有研究表明紅參、淫羊藿和丹參具有保護心血管、抗心律失常作用，景雅婷等[43]研究發現人參皂苷Rb1可通過抑制TGF-β通路和Periostin蛋白表達，有效防治心力衰竭；劉守義等[44]研究發現淫羊藿總黃酮苷可以阻滯β 受體，減少Na+、Ca2+內流，從而降低自律性；Maione 等[45]研究表明丹參酮ⅡA 是潛在的改善血液微循環，預防腦血管疾病的有效藥物，丹參酮ⅡA 能升高心型脂肪酸結合蛋白水平，降低心肌組織缺血修飾白蛋白水平，對心肌缺血再灌注損傷及心律失常具有良好的防治作用[46]。補骨脂中香豆素類成分也具有保護心血管系統作用，補骨脂素能夠減少TNF-α 誘導人臍靜脈內皮細胞的組織因子釋放，降低血栓形成風險[47]。此外，研究表明，組方藥材細辛的主要化學成分黃樟醚，可致肝臟毒性[48]。以上提示參仙升脈口服液發揮治療緩慢性心律失常的作用和引發不良反應與這些成分有著密切的聯系。本研究初步闡明了參仙升脈口服液的化學物質結構，為其進一步藥效物質的明確及全面的質量控制提供了實驗研究基礎。