青花菜轉錄因子基因BoiWRKY8及其與抗病性的關系

蔣 明 何佳薇 方宇潔 尹龍飛 張慧娟

（臺州學院生命科學學院，浙江 椒江 318000）

青花菜（Brassicaoleraceavar.italica）又名西蘭花、木立花椰菜和綠菜花等，為十字花科（Cruciferae）蕓薹屬一、二年生蔬菜，以花球和花莖為主要食用部位，富含維生素A、維生素C、維生素K、蘿卜硫苷（sulforaphane glucosinolate）、抗氧化物質和膳食纖維等，是一種深受消費者喜愛的保健蔬菜［1-4］。青花菜原產地中海中部地區，目前很多國家都有栽培，我國已成為世界最大的青花菜種植國和出口國之一，年栽培面積超過8.6 萬公頃，年產量約400 萬噸，年出口量約13 萬噸［5-6］。菌核病和灰霉病是青花菜的兩種重要病害，分別由核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）和灰霉菌（Botrytiscinerea）引起，它們危害葉片、莖和花球，導致青花菜產量和品質下降，每年造成的經濟損失十分巨大［7-8］。青花菜引入我國的時間較短，雖然引進或育成的品種數量眾多，但主栽品種之間的親緣關系較近，遺傳多樣性程度較低，優質種質資源十分匱乏［6］；青花菜抗病材料更為稀缺，通過挖掘抗病相關基因開展分子育種，是解決這一問題的重要手段。

轉錄因子在調控基因表達方面起著重要作用，其不僅參與細胞分化、生長、發育等生物學過程，還參與生物脅迫和非生物脅迫響應［9-12］。AP2/EREBP、MYB、WRKY、NAC、bHLH 和bZIP 等是植物的重要轉錄因子，能夠參與多種脅迫反應，明確上述轉錄因子的生物學功能，可為后續的抗逆分子育種提供優良的靶標基因［13-14］。WRKY 轉錄因子廣泛參與干旱、鹽堿、重金屬、蟲害等逆境響應，近年來有不少研究和報道［15-16］。WRKY 在抗病反應中的研究也有相關報道，擬南芥（Arabidopsisthaliana）AtWRKY33的過量表達，可顯著增強植株對灰霉菌和甘藍鏈格孢菌（Alternariabrassicicola）的抗性［17］。將來自葡萄（Vitisvinifera）的VvWRKY1基因轉入煙草（Nicotianatabacum），轉基因植株對煙草霜霉菌（Peronosporatabacina）和二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）的抗性增加［18］。小麥（Triticumaestivum）TaWRKY62的表達受條銹菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）的誘導，該基因的過量表達增強了對條銹病的抗病能力［19］。目前，有關WRKY 在青花菜抗病反應中的研究較少，因此本研究在克隆BoiWRKY8基因的基礎上，開展序列分析和表達分析，以期初步明確該基因在菌核病和灰霉病抗病反應中的功能，為后續開展抗病機理研究和分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青花菜純合材料Bo0113 由臺州學院分子生物學創新實驗室構建，栽植于人工氣候箱，培養條件為16 h光照/8 h黑暗。核盤菌菌株HP-22和灰霉菌菌株HM-18 均采自臨海青花菜基地，經分離、純化、鑒定后備用。大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α 菌株和根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株LBA4404 均由實驗室保藏。病原菌的接種在三葉一心期進行，分別于0、12、24、48 和72 h 時收集葉片，用液氮速凍后置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA與RNA的提取、cDNA 的合成 葉片用液氮冷凍，再用研棒磨成粉末，DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltriethylammnonium bromide，CTAB）法。分別以對照及病原菌處理的葉片為材料，經液氮冷凍后研成粉末，RNA 提取采用TRIzol 法，操作在超凈工作臺上進行；cDNA 的合成采用cDNA 合成試劑盒（TaKaRa，日本），根據其提供的說明書進行。

1.2.2 基因的克隆 根據NCBI 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）野甘藍（B.oleraceavar.oleracea）（登錄號：XP_013596685.1）WRKY8基因序列設計引物，上游/下游引物分別引入SmaI 和BamH I 酶切位點，引物序列分別為5′-CATCCCGGGATGTCTAATG AAACCAAAGATCTT-3′和5′-TACGGATCCTCAAGGT TCTTGCTTGAGGA-3′。以葉片DNA 和cDNA 為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，反應體系共20 μL：2 μL 10×緩沖液，20 μmol·L-1引物各0.35 μL，基因組DNA 或cDNA 30 ng，10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL，2 U·μL-1TaqDNA 聚合酶1.2 U，加ddH2O 至終體積。反應程序為：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸2.5 min，33個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR 產物經回收、純化，與T-easy 載體（Promega，美國）連接，反應參考說明書進行。陽性克隆經PCR 檢測后測序，PCR 反應體系、程序與基因克隆相同，模板改為菌液。

1.2.3 序列分析 BoiWRKY8 的同源序列下載自NCBI，分別為野甘藍、蕪菁（B.rapa）（XP_009101520.1）、甘藍型油菜（B.napus）（XP_013698158.1）、蘿卜（Raphanussativus）（XP_018456683.1）、鹽芥（Eutrema salsugineum）（ESQ39783.1）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）（OAO90538.1）、琴葉擬南芥（A.lyratasubsp.lyrata）（EFH39665.1）、亞麻薺（Camelinasativa）（XP_010441593.1）、薺菜（Capsellarubella）（EOA13673.1）和高山南芥（Arabisalpina）（KFK31474.1）。利用在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預測分子量和等電點；SMART在線工具（http：//smart.emblheidelberg.de）用于預測編碼蛋白的結構域；Clustal X 1.81 軟件用于BoiWRKY8 及同源蛋白序列的多重比對；采用Mega 3.1 構建系統發育樹，建樹方法為鄰接法（Neighbor-Joining），自舉檢測值為1 000。

1.2.4 表達分析 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）在LightCycler?96 熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）上進行，引物序列根據測序結果設計，上下游引物分別為5′-CATCGTATGATCATTACA ACAGCATCAAC-3′和5′-GACACGAGTGTAGATCAGAA CCG-3′；內標為肌動蛋白基因，引物分別為5′-ACGTG GACATCAGGAAGGAC-3′和5′-GAACCACCGATCCAG ACACT-3′。反應體系為20 μL：Master Mix 10 μL，20 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 5.6 μL。反應程序為：95 ℃ 預變性10 min；95 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，40 個循環。所有試驗重復3 次，相對表達量的計算采用2-△△Ct方法［20］。

1.2.5 遺傳轉化 PCR 產物、pBI121 載體用SmaI 和BamH I 雙酶切，經純化后用T4連接酶連接，經測序驗證后獲得重組載體pBI121-BoiWRKY8。利用熱激法將pBI121-BoiWRKY8轉入根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens），菌株為LBA4404，遺傳轉化植株的創制采用Jiang等［21］的方法。篩選至T3代，其中的WK02-07-24和WK22-21-04用于后續試驗。轉基因植株的驗證采用PCR法，以重組質粒、對照植株、2個株系的DNA為模板，引物分別為5′-CTCCTCGGATTCCATTGCCCAG-3′和5′-TACGGCGACTGGTCGGGATC-3′，程序和體系同1.2.2。標志基因的表達采用qRT-PCR 法，PR1引物為5′-AAAGCTACGCCGACCGACTACGAG-3′和5′-CC AGAAAAGTCGGCGCTACTCCA-3′，而PDF1.2引物為5′-TCCATCATCACCCTTCTCTTCGC-3′和5′-CCATGTT GTGCTCCTTCAAGTCG-3′，程序與反應體系同1.2.4。

1.2.6 抗病性鑒定及統計分析 核盤菌和灰霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基，培養溫度為（22±2） ℃。待菌絲長至培養基邊緣時，用打孔器切割菌餅，把長有菌絲的一側貼于葉片背面，培養3 d 時測量病斑直徑，試驗重復3 次。數據處理采用DPS 9.01 軟件，多重比對利用鄧肯氏新復極差測驗法。

2 結果與分析

2.1 BoiWRKY8的序列特征

分別以基因組DNA 和cDNA 為模板，擴增到各自的全長序列。測序結果表明，BoiWRKY8的基因組全長為3 170 bp，具2個內含子，長度分別為776和1 422 bp，內含子遵循GU-AG 規則，3 個外顯子的長度分別為455、144 和373 bp（圖1）。BoiWRKY8的編碼區全長為972 bp，編碼323個氨基酸，蛋白質的分子量為36 kDa，等電點為6.70。蛋白質二級結構預測結果表明，在+179 和+238 之間含1 個長度為60 個氨基酸的WRKY結構域，該結構域具1 個WRKYGQK 和1 個C2H2鋅指結構，C2H2可用通式C-X4-C-X23-H-X1-H 表示，其中的X指任何氨基酸（圖2）。

圖1 BoiWRKY8的基因結構Fig.1 Gene structure of BoiWRKY8

圖2 BoiWRKY8的編碼區及推導的氨基酸序列Fig.2 Complete coding sequence of BoiWRKY8 and its deduced amino acids

2.2 序列比對和系統發育分析

利用Clustal X 1.81 對BoiWRKY8 及10 條十字花科同源蛋白序列進行多重比對，結果表明，BoiWRKY8與野甘藍的同源序列最為相似，僅有2 個氨基酸殘基的差異，分別位于+279 和+283 位；與高山南芥的相似性最低，為81%。11 條蛋白序列的WRKY 結構域十分保守，除高山南芥外，其余10 個結構域的序列完全一致，高山南芥與其他WRKY 結構域之間存在1 個氨基酸殘基的差異（圖3）。

圖3 BoiWRKY8及同源序列的多重比對Fig.3 Multiple alignments of BoiWRKY8 and its homologous sequences

利用鄰接法構建系統發育樹，結果如圖4 所示。11條WRKY序列在系統發育樹上可分為5組，用Ⅰ～Ⅴ表示。4種蕓薹屬植物聚于組I，支持率為100%，該組分為2個亞組，BoiWRKY8與野甘藍聚于一個亞組，蕪菁與甘藍型油菜聚于另一個亞組，支持率分別為94%和99%。蘿卜、鹽芥和高山南芥各自單獨成組，即組Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，亞麻薺、薺菜、擬南芥和琴葉南芥聚于組Ⅳ，支持率達99%（圖4）。

圖4 基于鄰接法構建的BoiWRKY8及同源序列的系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of BoiWRKY8 and its homologous sequences using Neighbor-Joining method

2.3 BoiWRKY8的表達

利用qRT-PCR檢測BoiWRKY8在核盤菌和灰霉菌侵染下的表達，結果表明，該基因的表達受這兩種病原真菌的誘導，表達量隨侵染時間呈先上升后下降的趨勢（圖5）。在核盤菌誘導下，BoiWRKY8的表達量在6和12 h 時達到最大值，分別為對照的3.18 和3.22 倍，之后逐漸下降，48 和72 h 時仍顯著高于對照，表達量分別為對照的1.49 和1.35 倍。在灰霉菌誘導下的表達量變化與核盤菌相似，BoiWRKY8的表達量在6 和12 h 達到最大值，分別為對照的2.68 和2.90 倍，之后逐漸下降，48 h 時的表達量為對照的1.46 倍，差異達顯著標準，但72 h時的表達量與對照沒有顯著差異。

圖5 BoiWRKY8在核盤菌和灰霉菌侵染下的表達Fig.5 Expression of BoiWRKY8 in response to Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea

2.4 遺傳轉化結果

以T3 株系WK02-07-24 和WK22-21-04 為試驗材料，利用PCR進行檢測，結果均為陽性植株（圖6-A）。利用qRT-PCR檢測BoiWRKY8的表達量，結果顯示，在35S啟動子的驅動下，該基因的表達量在兩個過表達轉基因株系中顯著提高，分別為對照的8.77和13.84倍（圖6-B）。

圖6 PCR檢測及BoiWRKY8在過量表達株系中的表達Fig.6 PCR detection and expression analysis of BoiWRKY8 over-expressing lines

2.5 抗病性鑒定

對照植株、過量表達株系WK02-07-24 和WK22-21-04 接種病原菌后，均出現病斑，但大小存在一定的差異（圖7-A、B）。在核盤菌侵染下，對照病斑的平均直徑為2.03 cm，而兩個過量表達株系的病斑大小分別為1.50和1.10 cm，均顯著小于對照（圖7-C）；在灰霉菌侵染下，對照植株的病斑直徑為2.20 cm，而兩個過量表達株系的病斑大小分別為1.60和1.37 cm，均顯著小于對照（圖7-D）?？共⌒澡b定結果表明，BoiWRKY8的過量表達可顯著增加青花菜對核盤菌和灰霉菌的抗性。

圖7 BoiWRKY8過量表達對抗病性的影響Fig.7 BoiWRKY8 overexpression on resistance to diseases

利用qRT-PCR 檢測水楊酸（salicylic acid，SA）途徑標志基因PR1和茉莉酸/乙烯（jasmonic acid/ethylene，JA/ET）途徑標志基因PDF1.2的表達，結果表明，PR1基因表達量在對照和兩個過量表達株系間沒有顯著差異，但PDF1.2的表達量在3 個株系間存在顯著差異（圖8）。在核盤菌侵染下，PDF1.2在WK02-07-24 和WK22-21-04 的表達量顯著提高，分別為對照的2.30和3.59 倍；在灰霉菌誘導下，WK02-07-24 和WK22-21-04 的表達量分別為對照的2.11 與2.96 倍，均達到顯著水平。

圖8 病程相關蛋白基因的表達Fig.8 Expression of pathogenesis-related protein genes

3 討論

WRKY 轉錄因子參與植物生長和發育，涉及種子萌發、形態發生、根系生長、開花時間等的調控，此外，該類轉錄因子在生物脅迫和非生物脅迫方面有諸多報道［16-17，22］。WRKY 因蛋白質的N 端含保守的WRKYGQK序列而得名，以家族形式存在，在擬南芥和水稻中分別有72 和100 個成員［23］。根據WRKY 結構域的數量及N 端鋅指結構的類型，WRKY 可分為三大類，第一類含2 個WRKY 結構域，鋅指結構類型為C2H2，第二類和第三類均只含1 個WRKY 結構域，鋅指結構分別為C2H2和C2HC［23-24］。本研究以青花菜為材料，克隆到BoiWRKY8基因，推導的氨基酸序列含1 個WRKY 結構域，其N 端的鋅指結構為C2H2，因此BoiWRKY8 屬于第二類。WRKY 結構域通常十分保守，該結構域可特異識別啟動子區域的TTGACC/T 序列并與之結合，從而精確調控基因的表達［25］。本研究中，BoiWRKY8 與9 條同源序列的WRKY 結構域完全一致，而與高山南芥僅存在一個氨基酸殘基的差異，結構域的保守性與功能穩定性密切相關，以確保WRKY結構域與特定的DNA 序列結合，從而實現特定的調控功能。WRKY 轉錄因子參與多種脅迫，在擬南芥中，49 個WRKY成員受丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）或水楊酸的誘導［26］。雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）的12 個WRKY基因受鹽脅迫的誘導，同時，這些基因的表達量在大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）的侵染下顯著提高［27］。陸地棉（G.hirsutum）GhWRKY15的表達受棉刺盤孢菌（Colletotrichumgossypii）、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum）和立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）的誘導［28］。本研究中，BoiWRKY8的表達受核盤菌和灰霉菌的誘導，表達量呈現先上升后下降的趨勢，且兩種病原菌誘導下的表達模式相似，推測該基因在抗病反應中起著一定的作用。

WRKY轉錄因子基因在植物抗病反應中起著重要作用，利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）抑制芍藥（Paeonialactiflora）PlWRKY65基因的表達，結果表明，葉片對極細鏈格孢（Alternaria tenuissima）的感病性增加［29］。陸地棉GhWRKY15的過量表達，顯著增強了煙草對煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、棉刺盤孢菌和寄生疫霉（Phytophthora parasitica）的抵抗能力［28］。水稻OsWRKY4和OsWRKY80受立枯絲核菌的快速誘導，在水稻中過量表達，能顯著增強其對該病原真菌的抗性［30］。本研究中，BoiWRKY8在青花菜中的過量表達，可顯著提高核盤菌和灰霉菌的抵御能力。在抗病反應中，激素物質JA、SA和ET起著十分重要的作用，SA 信號途徑通常與活體寄生的病原菌抗性相關，而JA、ET 途徑則參與死體寄生病原菌的響應［31-33］。PR1和PDF1.2分別為SA 途徑與JA/ET信號途徑的關鍵基因，可作為兩個抗病途徑的標志基因［30］。GhWRKY15在煙草中過量表達，顯著增強了標志基因PR1的表達［28］；擬南芥WRKY33的突變導致植株對灰霉菌和甘藍鏈格孢菌這兩種死體營養型真菌的抗性減弱，同時標志基因PDF1.2的表達量顯著降低［17］。將小麥（Triticumaestivum）TaWRKY142基因導入擬南芥，其對希金斯炭疽菌（C.higginsianum）的抗性增加，同時，標志基因AtPDF1.2的表達量顯著提高［34］。核盤菌和灰霉菌均為死體營養型，本研究中，BoiWRKY8的過量表達對兩種病原真菌的抗性顯著增強，PR1的表達量與對照沒有顯著差異，而PDF1.2的表達量顯著提高。JA/ET 標志基因PDF1.2編碼一種抗菌肽，被廣泛認為是植物對抗病原菌的重要防御因子之一，BoiWRKY8的過量表達引起BoiPDF1.2表達量的顯著提高，使植物產生更多的抗菌肽，從而有效抑制核盤菌和灰霉菌的生長和侵染。

4 結論

本研究以青花菜為材料，在克隆BoiWRKY8基因的基礎上，明確了基因的序列特點和表達特征，并初步明確了該基因在抗病反應中的功能。BoiWRKY8的編碼區全長為972 bp，編碼323 個氨基酸，WRKY 結構域具一個WRKYGQK 序列和一個C2H2鋅指結構，與來自蕓薹屬植物的同源序列聚為一組。BoiWRKY8的表達受核盤菌和灰霉菌的誘導，該基因的過量表達植株對核盤菌、灰霉菌的抗性顯著增強，JA/ET 通路標志基因BoPDF1.2的表達量顯著提高。