玉米逆境脅迫響應基因ZmbZIP84的克隆與功能驗證

曹麗茹 龐蕓蕓 葉飛宇 馬晨晨 張 新王振華 魯曉民，*

（1河南省農業科學院糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2神農種業實驗室，河南 鄭州 450002；3鄭州大學農學院，河南 鄭州 450002）

玉米（ZeamaysL.）在我國廣泛種植，是重要的糧食作物和飼料作物，同時也是食品、化工業中不可缺少的原材料。在玉米生長周期內，所需降水量至少為250 cm［1］，但我國有50%以上的玉米種植在干旱、半干旱地區，尤其在北方和西南地區經常受到干旱和高溫天氣的危害［2］。在植物生長發育過程中遭遇高溫、干旱等非生物脅迫時，體內一系列復雜的抗逆機制會被激活，其中，轉錄調控在植物抵御外界非生物脅迫、影響作物正常生長發育及產量方面發揮重要作用［3-4］。

堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper，bZIP）轉錄因子是高等植物中家族成員數量較多且功能較為復雜的轉錄因子家族之一［5］。據報道，bZIP 轉錄因子在植物抵抗生物和非生物脅迫的應激反應中發揮重要作用［6］。Li 等［7］發現玉米轉錄因子bZIP68 通過抑制DREB1 轉錄因子的冷誘導表達從而提高玉米的耐寒性。蘋果（Maluspumila）轉錄因子MdbZIP44 通過增強MdMYB1與下游靶基因啟動子的結合，促進花青素積累響應脫落酸（abscisic acid，ABA）［8］。水稻（Oryza sativa）OsbZIP52 在寒冷和干旱脅迫中起負調節作用，OsbZIP52 過表達后提高了植株對寒冷和干旱脅迫的敏感性［9］；Kang 等［10］發現NaCl、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-6000 和ABA 等能夠強烈誘導甘薯（Dioscoreaesculenta）轉錄因子IbbZIP1表達，IbbZIP1過表達后能顯著提高擬南芥（ArabidopsisthalianaL.）的耐鹽性和耐旱性；Ma等［11］發現玉米轉錄因子ZmbZIP4參與玉米根系發育，增加側根數量、促進初生根生長，ZmbZIP4 過表達后提高植物抵抗非生物脅迫的能力；玉米ZmbZIP72 過表達后能夠提高轉基因擬南芥的抗旱和耐鹽性，同時增強ABA誘導基因如RD29B、RAB18和HIS1-3的表達［12］。大量研究表明，bZIP轉錄因子廣泛參與植物的生長發育并提高植物在生物及非生物脅迫下的耐受力，因此，挖掘bZIP轉錄因子家族中能夠響應相關脅迫的基因對提高植物在逆境中的耐受性具有重要的意義。

鑒于此，本研究對三葉期玉米幼苗進行正常灌溉、干旱脅迫及復水處理，分別取處理下的葉片和根系送轉錄組測序；分析轉錄組數據，篩選核心節點基因，克隆ZmbZIP84并進行生物信息學分析，探究其不同組織及逆境脅迫下的表達模式，利用CRISPR/Cas9 技術獲得擬南芥純合突變體植株bzip84-1、bzip84-2、bzip84-3，分析在高溫、干旱脅迫下野生型（Columbia，Col）和bzip84-1、bzip84-2、bzip84-3植株的表型，初步探究該基因的功能。本研究旨在探究bZIP轉錄因子在玉米逆境脅迫和生長發育中的作用，為培育抗逆玉米品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料處理及試驗設計

選取大小一致、顆粒飽滿的玉米自交系鄭8713 為試驗材料，人工氣候長日照培養箱（28 ℃、16 h光照/8 h黑暗）進行培養。待幼苗生長兩周后，選擇生長整齊一致的三葉期幼苗進行干旱-復水脅迫處理。利用SYSWSD 土壤溫濕度測定儀（遼寧賽亞斯科技有限公司）測量土壤水分含量，干旱處理時土壤含水量為45%～50%，復水處理時土壤含水量＞95%。取玉米脅迫處理前、干旱5 d、復水3 d 的葉片和根，分別命名為T0Y、T5dY、TR3dY 和T0G、T5dG、TR3dG，并提取RNA，于-80 ℃保存。5 株混為一個樣品，每個樣品各3 個生物學重復。

1.2 ZmbZIP84基因的克隆

將玉米自交系B73播種于河南省農業科學院原陽基地，每行種植16株，行長4 m，行距60 cm，株距25 cm，共種植6行，且最大田間持水量一直保持在80%以上。以B73 幼苗的cDNA 為模板，用基因特異性引物（ZmbZIP84-F：5′-ATGGCTTCCTCCAGCGGGA-3′ ；ZmbZIP84-R：5′-CGAGTACCAGCTCTGCTAG-3′）和高保真P505 酶進行基因擴增。反應體系共50 μL：高保真P505 酶1 μL、10 μmol·L-1正反引物各2 μL、dNTP Mix 1 μL、2×Phanta Max Buffer 25 μL、100 ng·μL-1cDNA 1 μL、ddH2O 18 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，35個循環；72 ℃終延伸5 min。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的條帶。目的產物連接PMD18-T載體，將陽性菌落進行菌液PCR 檢測，把檢測到目的片段的菌液送到北京六合華大基因科技有限公司（青島）測序。

1.3 ZmbZIP84基因的生物信息分析

使用Cytoscape3.8.2 軟件構建基因共表達網絡圖。利用ExPasy ProtParam 網站（https：//web.expasy.org/protparam/protparam-doc.html）對ZmbZIP84基因編碼的蛋白質的分子質量、疏水性及蛋白穩定性等進行預測；利用MEGA11軟件構建ZmbZIP84蛋白與不同物種中的同源蛋白進行進化樹分析；利用MEME 在線工具（http：//meme-suite.org/tools/meme）對蛋白的保守基序（motif）進行分析，把基序的最大數值設置為6。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g 玉米組織樣品，液氮中磨碎，用TRIzol 法提取試劑盒（Invitrogen，北京）提取總RNA。用NANODROP 2000 濃度測定儀（Thermo，北京）檢測濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的質量。取1 μg 的總RNA 用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，北京）反轉錄成cDNA，稀釋至終濃度100 μg·μL-1作為基因擴增和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）模板。

1.5 qRT-PCR樣品及試驗處理

以田間正常生長（生長條件同1.2）的玉米自交系B73 為材料，取三葉期的幼根、幼莖、幼葉以及成熟期的根、莖、葉、雄穗、雌穗等不同組織的樣品進行表達模式分析。取0.1 g 組織樣品于液氮中磨碎，TRIzol 法提取試劑盒提取總RNA。濃度測定儀檢測其濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的質量，取1 μg的總RNA 用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄成cDNA，稀釋至終濃度100 μg·μL-1。根據目的基因的保守性，利用NCBI網站設計特異性引物（ZmbZIP84-F：5′-AGAAAGGGCGGTTCTTGCG-3′；ZmbZIP84-R：5′-AAGCGGATGCTGTCGAACC-3′）。以稀釋后的cDNA為模板，利用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司）進行qRTPCR 擴增，反應體系共20 μL： Hieff qPCR SYBR Green Master Mix10 μL、正反引物各引物0.4 μL、100 ng·μL-1cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL。以玉米18S（18S-F：5′-C CTGCGGCTTAATT GACTC-3′；18S-R：5′-CCAGACCT CAGCCTGCTAAC-3′）為內參，反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環。采用2-△△CT法計算基因的相對表達量［13］，每個處理3 個重復。

1.6 非生物脅迫試驗處理

以飽滿的玉米自交系B73 為材料，于人工氣候長日照培養箱（28 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗）進行培養。待幼苗生長2 周后，選擇長勢一致的玉米三葉期幼苗進行脅迫處理。干旱脅迫：利用20% PEG-6000（Holland營養液+20% PEG）進行處理［14］；高溫脅迫：將溫度升高至42 ℃進行處理［15］；鹽脅迫：利用200 mmol·L-1濃度的NaCl 進行處理［14］；氮脅迫：利用缺乏銨態氮的Holland營養液進行處理［14］。

1.7 CRISPR/Cas9 構建擬南芥敲除載體、陽性植株的獲得及抗旱性檢測

查找ZmbZIP84在擬南芥中的同源基因（AT4G345 90），參照Tsutsui 等［16］的方法構建CRISPR/Cas9載體。首先登錄CRISPRdirect網站（http：//crispr.dbcls.jp/）設計靶點，分析gRNA結構，在Cas-OFFinder網站（http：//www.rgenome.net/cas-offinder/）評估脫靶情況，篩選靶點，設計引物（F： 5′-ATTGGATTCAAACGTCGTCAGGAT-3′，R：5′- GATT CAAACGTCGTCAGGATGTTT-3′）。將引物濃度稀釋至100 μmol·L-1，取正反引物各10 μL于200 μL PCR 管中混合均勻，100 ℃加熱5 min，自然冷卻至室溫，使引物聚合為二聚體形式。利用限制性內切酶AarI（Thermo，北京）酶切PKI1.1R 載體，體系為20 μL：10×Buffer AarI 2 μL、DNA 1.5 μL、50×oligonucleotide 0.4 μL、AarI 0.6 μL、Nuclease-free water 15.5 μL。37 ℃孵育8 h，65 ℃孵育20 min，用DNA回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收線性化載體。利用T4 ligase（TaKaRa，北京）連接靶點和PKI1.1R 載體，體系為15 μL：靶點引物二聚體5.8 μL、T4 連接Buffer 1.5 μL、線性化載體1 μL、T4連接酶0.7 μL、Nucleasefree water 6 μL，22 ℃孵育30 min。將上一步連接產物轉化DH5α 感受態細胞，用壯觀霉素（spectinomycin，Spec）平板進行陽性克隆的篩選。用引物U6.26：5′-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3′和靶點反向引物進行PCR鑒定，目標條帶大小約260 bp，用引物U6.26對陽性單克隆菌液測序驗證。將測序驗證后的陽性質粒轉化農桿菌。陽性菌落經PCR 驗證后利用花序浸染法浸染野生型（Col）擬南芥，成熟后收獲的種子為T0代。T0代種子消毒后，涂在含有潮霉素的1/2 MS 培養基（Murashige and Skoog medium）上進行陽性苗的篩選，PCR驗證為陽性的幼苗進行種植，成熟后單株收獲，即T1代種子。T1代種子消毒后，涂在不含抗生素的1/2 MS 培養基上，篩選分離比符合3∶1 的分離單株，PCR驗證為陽性的幼苗進行種植并收獲，即T2代種子。相同的培養基再種植一代，選擇不發生分離的T2代單株進行種植并收獲，為純合的T3代種子。

利用野生型擬南芥Col 和穩定純合的T3代種子，經消毒后分別涂在無抗1/2 MS 培養基上。生長5 d后，選擇長勢一致的幼苗移至營養土中培養，待生長到5 片葉，進行干旱和高溫脅迫（土壤含水量45%）處理一周，觀察表型差異并測定生理生化指標。

1.8 ZmbZIP84基因亞細胞定位

根據玉米MaizeGDB（https：//maizegdb.org）公布的ZmbZIP84基因序列，利用NCBI 設計目的基因引物（ZmbZIP84-pMDC83-GFP-SpeI-F：5′-GGACTAGTAT GGCTTCCTCCAGCGGGA-3′；ZmbZIP84-pMDC83-GFPBamHI-R：5′-CGGGATCC CAGATCAGACGTGGCGG TGA-3′）。以測序正確的ZmbZIP84-PMD18 為模板，克隆蛋白編碼區（coding sequence，CDS）序列。原始載體pMDC83-GFP 經SpeI 和BamHI 雙酶切將載體線性化后，利用T4連接酶將目的條帶連接到帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標簽的融合表達載體pMDC83上。將菌液PCR 目的片段正確的陽性菌落送到北京六合華大基因科技有限公司（青島）測序。測序正確的菌液抽取質粒后，使用熱激法將該質粒轉到農桿菌感受態GV3101 中。使用注射法將菌液注射到煙草背面的葉肉細胞中，48～96 h在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光信號。

1.9 生理指標的測定

葉綠素含量采用95%乙醇法測定［17］，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定［18］，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用NBT 法測定［18］，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創木酚法測定［18］。

1.10 統計分析

每組試驗進行3 個生物學重復，每組數據3 個重復。用Excel 2010 進行數據處理并制圖，用SPSS 22 對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 ZmbZIP84的鑒定

對轉錄組數據中基因每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）和功能注釋進行分析，發現有27 個基因參與干旱-復水脅迫響應。選取相關系數大于0.5 的基因構建共表達網絡圖。結果顯示，ZmbZIP84基因與其他基因之間的關聯度較高，表明ZmbZIP84基因是核心節點的關鍵基因（圖1），可知ZmbZIP84基因在干旱-復水處理過程中起著重要的作用。

圖1 差異表達基因的共表達網絡Fig.1 Co-expression network of differentially expressed genes

2.2 ZmbZIP84基因的克隆及生物信息學分析

利用網站MaizeGDB 下載ZmbZIP84基因的cDNA序列，以玉米自交系B73幼苗的cDNA為模板，利用PCR技術對ZmbZIP84基因進行擴增。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果得到約489 bp的條帶（圖2-A），回收目的條帶。將膠回收產物連接PMD18-T載體，陽性菌落送到北京六合華大基因科技公司（青島）進行測序，通過比對測序結果，發現克隆到的基因與參考序列一致。

圖2 ZmbZIP84 基因（A）、編碼蛋白結構（B）、結構域（C）Fig.2 Gene structure of ZmbZIP84（A），coding protein structure （B） and domain （C）

對ZmbZIP84的基因序列進行分析，發現該基因位于玉米的第4 號染色體，編碼區全長489 bp，編碼162 個氨基酸（圖2-B）。對該基因的蛋白保守結構域進行預測，顯示ZmbZIP84具有典型的bZIP 轉錄因子結構域（圖2-C）。

利用Expasy Protpara 網站對ZmbZIP84 的氨基酸序列進行理化性質的預測和分析。結果表明，分子式為C718H1182N226O235S；相對分子量為17.13 kDa，理論等電點（pI）為6.29；帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）為18，帶正電殘基總數（Arg+Lys）為17，為酸性蛋白；親水性系數為-0.107，說明該蛋白是親水性蛋白；不穩定系數為84.75，屬于不穩定蛋白。對其氨基酸組成成分進行分析，其中Ala（A）含量最多，占21.6%；其次為Arg（R），占9.3%；含量最少的是Ile（I），占0.6%。

2.3 ZmbZIP84蛋白進化樹分析及保守基序分析

為了研究ZmbZIP84與其他物種的親緣關系，利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹。由圖3可知，bZIP 轉錄因子具有較高的保守性（圖3-A），與ZmbZIP84 親緣關系最近的物種為柳枝稷和高粱（圖3-B）。對同源物種的6 個保守基序進行分析，結果發現這7 個物種含有相似的保守基序（如：motif 1、motif 2、motif 3、motif 4），說明高粱、哈利谷草、柳枝稷、水稻、玉米、光稃稻、粳稻物種間可能存在某種相似的生物學功能（圖3-C）。

圖3 ZmbZIP84與其他物種的序列（A）分析、蛋白進化樹（B）及保守基序（C）分析Fig.3 Sequence analysis （A） of ZmbZIP84 and other species，protein evolutionary tree （B） and conserved motif analysis（C）

2.4 ZmbZIP84的啟動子順式元件分析

啟動子順式作用元件在基因表達的調控過程中起著重要作用。為了進一步探究ZmbZIP84的功能，利用PlantCARE在線軟件對ZmbZIP84基因ATG上游2 kb啟動子的順式元件進行預測（表1）。發現ZmbZIP84基因啟動子區含有多種功能元件，除了在啟動子中最常見的TATA-box、CAAT-box 元件外，還包括ABRE、G-Box、Sp1、GT1-motif、CGTCA-motif、RY-element、Abox和TCCC-motif 等其他元件。其中，ABRE 參與響應ABA 的信號轉導過程，能夠響應干旱脅迫；TGACGmotif 和CGTCA-motif 是茉莉酸甲酯（metyl jasmonate，MeJA）的結合元件，通過參與茉莉酸甲酯的傳導從而來調節茉莉酸相關基因的表達；O2-site 是參與調控玉米蛋白代謝的順式作用元件；TGA-element 是生長素響應元件，能夠提高生長素相關基因的表達。此外，還發現Box Ⅱ、Sp1、TCT-motif 等一些光刺激應答元件。結果表明，ZmbZIP84基因的表達可能被識別這些元件的轉錄因子所調控，從而在植物生長發育、響應激素信號刺激及逆境脅迫過程中發揮重要作用。

表1 ZmbZIP84基因啟動子順式元件分析Table 1 Cis-element analysis of ZmbZIP84 gene promoter

2.5 ZmbZIP84基因組織表達模式分析

分析ZmbZIP84基因在玉米不同時期不同組織中的表達情況。結果顯示，該基因在所有檢測的組織中均表達，但表達模式存在明顯的差異。其中，成熟根中的表達量最高，幼根、雌穗及幼葉中的表達量次之，幼莖中表達量最低（圖4）。

圖4 ZmbZIP84基因在玉米不同組織中的表達Fig.4 The expression of ZmbZIP84 gene in different tissues of maize

2.6 ZmbZIP84 基因在非生物脅迫誘導表達模式分析

通過對ZmbZIP84基因在干旱、NaCl、高溫及缺氮處理下的表達量進行分析，發現該基因在逆境脅迫下能夠參與響應。結果表明，在高溫、干旱及氮處理下ZmbZIP84基因的表達量顯著或極顯著上調，而在鹽脅迫處理下該基因的表達量顯著或極顯著下調（圖5）。在高溫處理條件下（圖5-A），ZmbZIP84基因的表達量顯著或極顯著上調，且上升趨勢一直持續到48 h，此時表達量達到處理前水平的12.5 倍；之后表達量緩慢下調；恢復正常培養36 h 時，表達量降至最低，但表達量仍比脅迫前高。在干旱處理條件下（圖5-B），ZmbZIP84基因的表達量變化趨勢與高溫處理相似；干旱處理8 h時，表達量已上調至13.7 倍；隨著干旱脅迫時間的增加，ZmbZIP84基因的表達量出現緩慢下降的趨勢，在脅迫52 h時，表達量又出現緩慢上調趨勢；之后表達量緩慢下調至84 h；在復水處理后，隨著時間的增加，表達量變化趨于穩定。在鹽處理條件下（圖5-C），ZmbZIP84基因的表達量呈下調趨勢；鹽處理36 h時，表達量為處理前水平的0.3 倍，為最低水平；解除脅迫12～36 h，表達量逐漸下調。在缺氮條件下（圖5-D），ZmbZIP84基因的表達量也呈顯著或極顯著上調趨勢；缺氮處理48 h時，表達量上調至4.52 倍；而解除脅迫后，表達量恢復至處理前水平。以上結果表明，干旱、高溫、鹽、缺氮處理均可誘導ZmbZIP84基因的表達。

圖5 ZmbZIP84基因在高溫（A）、干旱（B）、鹽（C）、缺氮（D）脅迫下的表達Fig.5 Expression of ZmbZIP84 gene under drought （A），high temperature （B），NaCl （C） and nitrogen deficiency（D） stress

2.7 干旱、高溫脅迫下ZmbZIP84 敲除擬南芥植株的表型分析

ZmbZIP84基因與擬南芥AT4G34590的同源性最高，序列相似性達61.54%。將玉米與擬南芥同源度最高的片段利用CRISPR/Cas9 技術獲得bZIP84缺失型擬南芥突變體（圖6-A）。將野生型Col 和突變體T3 代的純合株系bZIP84-1、bZIP84-2和bZIP84-3進行干旱和高溫脅迫處理。在正常處理下，Col和突變體植株的長勢一致且良好（圖6-B、C）。干旱脅迫處理5 d后，發現突變體植株生長受到嚴重抑制，葉片萎蔫，甚至干死；而Col 植株影響較小，但弱于同時期正常處理的Col 植株。高溫處理5 d 時，各株系均出現了較為嚴重的萎蔫、干枯現象；但相對于突變體植株，Col植株的萎蔫程度相對較輕。以上結果說明，在干旱、高溫脅迫處理下，缺失bZIP84基因導致擬南芥抗旱性和耐高溫能力明顯下降。

圖6 玉米ZmbZIP84基因與擬南芥AT4G34590序列分析（A）、干旱及高溫脅迫下bZIP84突變體和野生型的幼苗表型（B、C）Fig.6 Sequence analysis of maize ZmbZIP84 gene and Arabidopsis AT4G34590 gene （A），seedling phenotypes of bZIP84 mutants and wild types under high temperature and drought stress （B，C）

2.8 ZmbZIP84 敲除會降低擬南芥植株對干旱和高溫的耐受性

測定干旱和高溫脅迫下擬南芥突變體植株bzip84-1、bzip84-2、bzip84-3中葉綠素含量、脯氨酸含量、SOD 和POD 活性均發生變化（圖7），發現脅迫處理前，擬南芥植株正常生長，各指標在野生型Col和突變體植株中無顯著差異。在干旱和高溫脅迫后，葉綠素含量均明顯下降，且突變體擬南芥植株的葉綠素含量顯著低于野生型（圖7-A）。

圖7 干旱、高溫脅迫下bZIP84突變體和野生型擬南芥生理指標測定Fig.7 Physiological indices of bZIP84 mutant and wild Arabidopsis thaliana under drought and high temperature stress

植物體內脯氨酸的含量在一定程度上能夠反映植物的抗逆能力。脅迫前各株系間脯氨酸含量無明顯差異；在干旱脅迫處理后，Col 株系中的脯氨酸含量是突變體株系中脯氨酸含量的1.63～1.87 倍；在高溫脅迫處理后，Col株系中的脯氨酸含量是突變體株系中脯氨酸含量的1.89～2.06倍（圖7-B）。

當植株遭受到脅迫時，體內的SOD 含量出現明顯增加的趨勢，干旱脅迫后，Col 株系中的SOD 含量比突變體株系中SOD含量分別高了29.8%、33.7%、32.5%；高溫脅迫后，Col 株系中的SOD 含量比突變體株系中SOD含量分別高36.8%、38.9%、34.1%（圖7-C）。在脅迫處理前，Col株系和突變體株系中的POD含量無明顯差異，在脅迫后植株體內的POD 含量明顯升高。干旱脅迫后，Col 株系中POD 含量比突變體株系中分別高34.7%、37.3%、41.6%；高溫脅迫后，Col 株系中POD含量比突變體株系中分別高了31.7%、23.8%、29.3%（圖7-D）。

通過測定生理指標，可以發現在高溫和干旱脅迫后，擬南芥體內葉綠素含量下降，而脯氨酸、SOD和POD的含量上升，且Col 株系中脯氨酸、SOD 和POD 的含量高于突變體株系，說明擬南芥中缺失bZIP84基因后顯著降低了擬南芥對干旱脅迫和高溫脅迫的耐受性。

2.9 ZmbZIP84基因編碼蛋白的亞細胞定位

為了進一步驗證ZmbZIP84蛋白在細胞中的位置，將其進行亞細胞定位。結果顯示，對照組在細胞核和質膜均能發出綠色熒光信號，而試驗組只能在細胞核中觀察到綠色熒光信號，說明該基因編碼的蛋白定位于細胞核中，屬于核蛋白基因（圖8）。

圖8 ZmbZIP84的亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of ZmbZIP84

3 討論

bZIP 轉錄因子是植物器官發育及生理過程的主要調節因子［19］，在植物抗逆中發揮著重要的作用，對選育優質、綠色、高產、抗逆作物品種具有重要意義［14，20］。本研究通過分析轉錄組數據，在玉米中篩選到一個響應干旱脅迫及復水的轉錄因子ZmbZIP84，對該基因進行生物信息學分析并克??；通過qRT-PCR 系統分析該基因在高溫、干旱、缺氮及NaCl 處理下的表達模式；利用CRISPR/Cas9 技術獲得擬南芥陽性純合突變體植株，驗證該基因在高溫及干旱脅迫下的耐受性；通過亞細胞定位確定該基因在細胞中的位置，這些研究內容為進一步深入探究ZmbZIP84的功能及其調控的網絡關系奠定了基礎。

研究表明，植物bZIP 轉錄因子在提高作物的質量、產量及抗逆方面具有積極的作用［21］。有研究報道，ZmbZIP72基因過表達后轉擬南芥，能夠增加過表達植株對ABA 和滲透脅迫的敏感性，同時提高轉基因株系對干旱和鹽脅迫的耐受性［12］；ZmbZIP81過表達后能夠提高轉基因擬南芥對NaCl 的耐受性［22］。本研究發現ZmbZIP84基因在玉米植株各器官中差異表達，且在高溫脅迫、干旱脅迫及缺氮處理下表達量上調，而在鹽脅迫下表達量下調，說明ZmbZIP84基因在玉米的逆境脅迫應答中起重要的作用，這與前人研究結果一致。為進一步研究ZmbZIP84基因的功能，以模式植物擬南芥為受體，利用CRISPR/Cas9 技術敲除ZmbZIP84基因與擬南芥同源基因中高度保守的序列獲得陽性純合突變體植株，對突變體植株分別進行高溫、干旱脅迫后發現Col 株系的長勢比突變體株系好，說明Col 株系比突變體株系在高溫、干旱脅迫下具有較高的耐受性。進一步說明bZIP84基因缺失會降低擬南芥的抗旱、耐高溫能力。

在植物抗逆性研究中，葉綠素含量、脯氨酸含量、SOD 及POD 活性等常被用作重要的檢測指標，來反應植物的抗逆性能。逆境脅迫下植物體內葉綠體的結構發生改變，導致葉綠素含量及光合作用過程相關酶的活性降低［23-24］；同時體內滲透調節物質如脯氨酸等含量增加，以調節細胞水勢使植物適應不利環境［25-26］。本研究測定在高溫、干旱脅迫下Col 和突變體植株中的葉綠素含量，發現受脅迫后植株體內的葉綠素含量顯著下降，但突變體植株的葉綠素含量顯著低于Col；而在高溫、干旱脅迫下Col 和突變體株系中的脯氨酸含量都顯著升高，且Col 株系中的脯氨酸含量是突變體株系中1～2 倍。逆境脅迫會損傷細胞膜，導致細胞內超氧陰離子及過氧化氫（H2O2）等活性氧的累積［27-28］，SOD 和POD 作為植物細胞內重要的保護酶，在逆境脅迫下其活性顯著增加以清除活性氧，從而維持細胞穩態［29-30］。本研究發現在高溫、干旱脅迫下Col和突變體株系中SOD 和POD 酶活性顯著增加，且脅迫后Col株系相比于突變體株系中的SOD 和POD 酶活性較高。結果表明，擬南芥突變體植株在高溫、干旱脅迫下體內的葉綠素、脯氨酸、SOD 及POD 含量較Col 較低，從而判斷ZmbZIP84基因敲除后會降低植物的抗旱、耐高溫能力。

4 結論

本研究鑒定并克隆了響應干旱脅迫的基因ZmbZIP84，該基因屬于bZIP 轉錄家族成員，是組成型表達基因，且被高溫、干旱、NaCl 和氮處理誘導表達。利用CRISPR/Cas9 技術獲得ZmbZIP84基因的擬南芥同源基因缺失型陽性純合突變體植株，發現突變體植株在干旱和高溫脅迫下生長狀況遠不如野生型。亞細胞定位顯示，ZmbZIP84基因編碼的蛋白屬于核蛋白。本研究初步證明了bZIP84基因缺失會導致擬南芥抗旱性和耐高溫能力顯著下降，證明了ZmbZIP84轉錄因子在高溫、干旱脅迫中起正向調控作用。