間作刺槐對魔芋根際細菌群落結構及軟腐病發生的影響

何 斐 劉 歡 李 川 崔 鳴 魏夢琳 丁龍飛 劉 斌 段 杉

（安康學院現代農業與生物科技學院，陜西 安康 725000）

魔芋（Amorphophalluskonjac）軟腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum）［1］、環狀果膠桿菌（Pectobacterium aroidearum）［2］、迪基氏菌屬（Dickeyaspp.）［3］等病原菌侵染引起的土傳和種傳病害，危害極其嚴重，防治困難，至今未找到一種有效的防治方法。前人研究表明，作物土傳病害的發生與根際微生物相關，且一些有益微生物可以有效降低土傳病害的發病率［4］。Dong等［5］研究證實，芽孢桿菌（Bacillus）能降低檳榔芋（Colocasia esculenta）軟腐病的發病率；Dong 等［6］研究發現，黃粘球菌（Myxococcusxanthus）作為潛在的生防制劑，可以通過捕食和分泌胞外裂解酶來有效防治番茄（Lycopersicon esculentum）細菌性青枯??；假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）中的許多菌株可以有效緩解病原細菌和病原真菌引起的土傳病害［7-8］。眾多研究表明，作物抵抗土傳病害的能力與其根際細菌群落的豐度和多樣性密切相關［9］。

間作是一種能有效抑制作物土傳病害的生態農業種植制度。目前，間作控病機理特別是作物根際微生物層面的研究逐漸得到重視。間作能增加土壤生物多樣性以及有益微生物種類和數量，從而減輕土傳病害［10］。Jin 等［11］利用小麥（Triticumaestivum）與黃瓜（Cucumis sativus）間作，發現小麥間作促進了黃瓜根際潛在有益微生物的生長，進而降低了黃瓜枯萎病的嚴重程度。Yu 等［12］研究表明，與西瓜（Citrullusvulgaris）單作相比，間作小麥的西瓜根際細菌群落更穩定，其枯萎病發病指數更低。然而，根際微生物影響病原菌和間作作物的方式極其復雜，且不同間作搭配組合的抗病效果有所差異。因此有必要對特定作物間作模式下的根際微生態特征進行深入研究。從微觀角度了解間作作物病害地下部機理有助于對特定作物間作控病的具體措施進行宏觀調控，為優化栽培管理措施及構建可持續發展的間作技術體系提供理論依據和技術支撐。

關于魔芋軟腐病與土壤微生物多樣性之間關系的研究已有相關報道。如何斐等［13］研究表明，魔芋軟腐病發病率和病情指數與魔芋根系和根際土壤叢枝菌根真菌總侵染率、侵染強度和孢子密度呈極顯著負相關；Yang 等［1］研究發現，胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種侵染導致魔芋根際土壤細菌和真菌群落發生明顯改變。但有關魔芋軟腐病防治與土壤微生物多樣性之間關系的研究較少，特別是間作刺槐（Robiniapseudoacacia）對魔芋根際微生物多樣性影響的研究尚少見報道。長期生產實踐證明，間作刺槐能有效防控魔芋軟腐病的發生［14］，然而其微生態機理尚有待研究?；诖?，本研究借助Illumina 高通量測序技術分析刺槐‖魔芋種間互作對魔芋根際細菌群落結構的影響及其與軟腐病發病率之間的關系，旨在為通過間作套種等農藝措施改善土壤微生態環境及土傳病害防控提供理論支撐，也為深入理解特定作物間作套種模式下的根際微生態特征提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與實施

試驗于2021年5月3日在安康學院農學大棚進行。刺槐和魔芋根系分隔采用兩室根箱隔網裝置（圖1）設置3個處理：（1）塑料膜全隔單作（film complete separation，F）作為對照；（2）25 μm 尼龍網隔半間作（mesh semiseparation，M），水分和養分可穿過，但根系不能通過；（3）無隔間作（non-separation，N）。每處理重復3次。

圖1 刺槐（A）和魔芋（B）不同根系分隔處理模式圖Fig.1 Schematic diagram of R.pseudoacacia （A） and A.konjac （B） plants under different root separation treatments

以種植1 年魔芋的連作土壤（第一茬魔芋軟腐病平均發病率為3.7%）作為供試土壤，其類型為黃棕壤，基本理化性質：pH 值7.07，全氮1.46 g·kg-1，全磷0.87 g·kg-1，全鉀20.05 g·kg-1，速效氮27.9 mg·kg-1，速效磷70.2 mg·kg-1，速效鉀108.4 mg·kg-1，有機質14.69 g·kg-1。土壤去雜后添加有機肥50 g·kg-1，育苗基質20 g·kg-1，充分混勻用作栽培基質。

挑選飽滿的刺槐種子用10% H2O2消毒15 min，蒸餾水沖洗6 次、無菌水浸泡18 h，置于鋪有濕潤紗布的托盤上，25 ℃光照培養箱中催芽，每天光照10 h、換1 次水。當刺槐種子胚根生長至約0.1 cm 時播種在A室根箱中，刺槐出苗后生長至3 cm 時，各處理保留長勢一致的5株幼苗。

挑選質量為20 g、頂芽健康露白的魔芋球莖作為供試種芋，播種前用20%噻菌銅懸浮劑均勻噴霧消毒和晾曬。在A 室刺槐生長30 d 后，將消毒晾曬處理后的魔芋播種至B 室中，各處理播種3 株。播種后將根箱置于透光率為50%的遮陽網下，植株生長期內2 d澆1次水，澆至土壤相對含水量為75%。

于2021 年9 月10 日球莖膨大期采集各處理的魔芋根系，同時采用抖根法［15］收集魔芋根際土壤。每個處理各采集3 個根系（root，R）樣品和3 個根際土壤（soil，S）樣品，將采集的根系樣品用大量無菌水反復沖洗處理干凈后放入液氮速凍，再轉存于-80 ℃超低溫冰箱，用于分析細菌多樣性。土壤樣品剔除沙石等雜物后，部分土樣轉入無菌凍存管中，儲存于-80 ℃冰箱，用于16S rDNA 測序分析土壤細菌多樣性及實時熒光定量PCR分析氮循環關鍵功能基因拷貝數；剩余土樣自然風干后過0.25 或1 mm篩，用于測定土壤理化性質。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 土壤理化性質的測定 土壤理化性質測定參考《土壤農化分析》［16］，采用凱氏定氮法測定土壤全氮（total nitrogen，TN）含量；通過堿解擴散法測定土壤堿解氮（alkali-hydrolyzable nitrogen，AN）含量；采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測定土壤全磷（total phosphorus，TP）含量；采用碳酸氫鈉-鉬銻抗分光光度法測定土壤速效磷（available phosphorus，AP）含量；采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法測定土壤全鉀（total potassium，TK）含量；采用醋酸銨-原子吸收火焰分光光度計法測定土壤速效鉀（available potassium，AK）含量；采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定土壤有機碳（soil organic carbon，TOC）含量；采用電位法（水土比2.5∶1）測定土壤pH值。

1.2.2 魔芋軟腐病病害調查 于魔芋播種后50（出苗期）、75（發病高峰期）和200 d（球莖膨大期）分別調查統計魔芋軟腐病害嚴重程度。發病程度分4個等級：0級，健康無發病癥狀；1級，＜25%植株出現軟腐病癥；2級，25%～75%植株出現軟腐癥狀；3級，＞75%植株受侵染。根據費甫華等［17］的方法計算魔芋軟腐病病情指數（disease index，DI）和防治效果（control efficiency，CE）：

1.2.3 DNA 提取和PCR 擴增測序 按照FastDNA?Spin Kit for Soil 試劑盒（美國MPbio 公司）說明書步驟分別提取魔芋根系和根際土壤總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，使用NanoDrop 2000 核酸定量儀（美國賽默飛世爾科技公司）檢測DNA 濃度和純度。以細菌V3～V4 區的16S rDNA 序列進行PCR 擴增，引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）［18］。

使用TransGen AP221-02試劑盒（北京全式金公司）進行PCR 擴增。反應體系為20 μL：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1三磷酸脫氧核苷酸2 μL，5 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，1%牛血清白蛋白溶液（大連TaKaRa 公司）0.2 μL，DNA 模板10 ng，補ddH2O 至20 μL。PCR 程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28次循環；72 ℃終延伸10 min。

使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，按照AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（美國Axygen 公司）說明書進行PCR 產物純化，用QuantiFluorTM-ST（美國Promega 公司）進行定量。通過Illumina NovaSeq 6000 PE250 平臺進行測序，由上海派森諾生物科技股份有限公司提供技術支持。

1.2.4 氮循環關鍵功能基因實時熒光定量PCR 分析 采用實時熒光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測固氮過程（nifH）、氨氧化過程（氨氧化古菌AOAamoA和氨氧化細菌AOBamoA）、反硝化過程（narG、nirS、nirK和nosZ）的7 個功能基因拷貝數。qRT-PCR 反應在Light Cycler?480 thermocycler（美國Axygen公司）平臺進行，定量引物序列及反應條件見表1。反應體系為20 μL：SYBR?Premix Ex Taq（大連TaKaRa 公司）10 μL，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，10 ng·μL-1土壤DNA 1 μL，1%牛血清白蛋白溶液（大連TaKaRa 公司）0.2 μL，ddH2O 6.8 μL。

表1 氮循環關鍵功能基因qRT-PCR引物及反應條件Table 1 qRT-PCR primers and reaction conditions for key functional genes related to nitrogen cycling

用插入目的片段且拷貝數已知的質粒DNA，經過10 倍系列稀釋，構建標準曲線，每個標準品重復3 次。質粒的制作：采用表1 中相應的引物對氮循環關鍵功能基因進行PCR 擴增，用膠回收試劑盒（大連TaKaRa公司）進行目的基因回收純化。純化的目的基因連接到pMD18-T 質粒載體上，導入感受態細胞中。經藍白斑篩選，挑出陽性克隆轉接LB 液體培養基37 ℃、160 r·min-1搖床振蕩培養18 h，部分菌液送至上海生工測序部進行測序驗證。擴大培養陽性克隆菌落，用TIANprep Mini Plasmid Kit 質粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取質粒DNA。用Nanodrop 2000C 分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）測定質粒濃度?；跍y出的質粒濃度，調整PCR 體系中模板的加入量。采用LightCycler?480熒光定量PCR儀（美國Axygen公司）進行擴增，以循環數閾值（cycle threshold，Ct）為橫坐標，以標樣拷貝數的對數值［log10（拷貝數）］為縱坐標，繪制標準曲線。

通過將土壤氮循環關鍵功能基因Ct 值與標準曲線比較，用獲得的拷貝數，參照文獻［25］的公式計算每克干土中的功能基因拷貝數。

1.3 數據分析

采用QIIME 2 分析流程［26］進行質控、拼接和降噪處理，聚類為擴增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs），比對Silva 138/16s_bacterial 數據庫，設置閾值為0.7，按最小樣本序列抽平。生信分析在上海派森諾基因云平臺（https：//www.genescloud.cn/）中進行，原始數據上傳至美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）旗下的序列閱讀檔案（Sequence Read Archive，SRA）數據庫（登錄號：PRJNA906959，各樣本序列登錄號SAMN31943274～SAMN31943291）。

使用Mothur 軟件［27］進行細菌群落α 多樣性分析，利用基于Bray-Curtis 距離的主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）分析不同處理細菌β 多樣性，結合Adonis 分析進行處理間差異檢驗；使用Canoco 5 軟件進行細菌群落與土壤因子之間的冗余分析（redundancy analysis，RDA）。運用微科盟生科云平臺（https：//www.bioincloud.tech/）進行細菌群落Circos圖的制作。在chiplot 在線網站（https：//www.chiplot.online/）進行Pearson 相關性分析和繪圖。使用SPSS 22.0 軟件對不同處理間氮循環關鍵功能基因拷貝數進行單因素方差分析，以Duncan 多重比較法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 魔芋根系和根際土壤細菌多樣性指數

2.1.1 α 多樣性指數 由表2 可知，無隔處理的魔芋根系和土壤細菌Observed species 和Chao 1 指數均最大，細菌物種最豐富，與全隔處理相比差異達到顯著水平。不同分隔處理魔芋根系細菌多樣性水平也存在一定的差異，無隔處理的魔芋根系細菌群落多樣性水平最高，其Shannon 指數顯著高于網隔和全隔處理。而魔芋根系和土壤細菌群落的Simpson 指數在不同分隔處理之間無顯著差異。

表2 不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細菌α多樣性指數Table 2 Alpha diversity indices of bacterial communities in A.konjac roots and rhizosphere soils under different separation treatments

2.1.2 β 多樣性指數 為明確各處理在細菌群落物種組成上的差異性，采用PCoA 比較不同分隔處理魔芋根系和根際土壤細菌群落的β多樣性差異。結果表明（圖2），主成分PCo1 和PCo2 分別解釋了41.2%和8.2%的群落結構差異，兩者累計貢獻率達49.4%。無隔和網隔2種土壤樣品間的細菌群落存在重合，說明2種土壤樣品中的細菌物種組成差異較??；結合Adonis分析表明，無隔、網隔和全隔魔芋根際土壤樣品中細菌群落的β 多樣性差異顯著（P=0.006，R2=0.313），3 個處理的魔芋根系細菌群落β 多樣性差異亦顯著（P=0.005，R2=0.393）。

圖2 基于Bray-Curtis距離的魔芋根系和根際土壤細菌群落β多樣性主坐標分析（PCoA）Fig.2 Principal coordinates analysis （PCoA） of bacterial community beta diversity in roots and rhizosphere soils of A.konjac based on Bray-Curtis similarities

2.2 魔芋根系和根際土壤細菌群落結構組成

18 個樣本按最小樣本序列數抽平1 次，每個樣本得到34 675 條有效序列。ASV 稀疏曲線均趨于平緩（圖3-A），表明本研究中測序深度已基本覆蓋了樣品中所有物種，序列信息可以充分反映細菌群落的真實信息。不同處理魔芋根際細菌群落測序結果表明，無隔處理魔芋根系和根際土壤細菌的ASV 總數最大，分別為4 649 和7 346 個；全隔處理最少，分別為3 296 和6 713個（圖3-B）。

圖3 不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細菌群落稀疏曲線（A）和韋恩圖（B）Fig.3 Rarefaction curve （A） and Venn diagram （B） of bacterial communities in roots and rhizosphere soils of A.konjac under different separation treatments

2.2.1 門水平 由圖4-A可知，不同分隔處理細菌門水平的群落結構組成相似，但細菌門相對豐度存在差異。6 個樣品中，相對豐度≥1.0%的已知優勢細菌包括9 門，而相對豐度＜1.0% 的其他細菌門占比在0.67%～2.98%之間。

圖4 不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細菌門水平（A）和屬水平（B）的群落組成Fig.4 Bacterial community composition in roots and rhizosphere soils of A.konjac at the phylum （A） and genus （B） levels under different separation treatments

在魔芋根系中，放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）在全隔、網隔、無隔處理中所占比例均表現為依次降低的趨勢，分別為11.46%、10.32%、10.05%和21.79%、17.03%、16.14%；而綠彎菌門（Chloroflexi）和厚壁菌門（Firmicutes）在全隔、網隔和無隔處理中所占比例依次增加，分別為1.79%、2.21%、4.56%和0.36%、0.37%、1.07%。

在魔芋根際土壤中，變形菌門（Proteobacteria）和藍藻門（Cyanobacteria）在全隔、網隔、無隔處理中所占比例均依次降低，分別為35.40%、31.16%、30.35%和0.25%、0.09%、0.06%；厚壁菌門（Firmicutes）也表現出相同趨勢，在3 個處理中所占比例依次減少，分別為4.01%、3.93%和3.75%。

2.2.2 屬水平 不同分隔處理細菌屬水平群落組成見圖4-B。在相對豐度≥1.0%的優勢細菌屬中，相較于全隔處理，網隔和無隔條件下魔芋根系中細菌屬相對豐度均上升的有鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、溶桿菌屬（Lysobacter）和Chryseolinea屬；根際土壤中細菌屬相對豐度均上升的有原小單孢菌屬（Promicromonospora）、戴沃斯菌屬（Devosia）、極地所菌屬（Pricia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、Galbibacter屬、申氏桿菌屬（Shinella）和溶桿菌屬（Lysobacter）。此外，藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、溶桿菌屬（Lysobacter）和Chryseolinea屬相對豐度在無隔處理魔芋根系和根際土壤中最高，而獨島菌屬（Dokdonella）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和類土地桿菌屬（Parapedobacter）相對豐度在全隔處理魔芋根系和根際土壤中最高。

2.3 細菌屬組成與土壤因子的關系

為了分析不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細菌群落屬組成產生差異的關鍵土壤因子，對細菌群落屬組成與土壤理化性質進行RDA 分析。結果顯示（圖5），RDA1 和RDA2 累計解釋魔芋根際細菌群落99.05%的變異量，其中AN 對魔芋根際細菌群落影響顯著（P＜0.05），解釋其群落結構變異的67.43%。其他土壤因子對其無顯著影響。從圖5 也可看出，原小單孢菌屬（Promicromonospora）和Galbibacter屬相對豐度均與TN、TK、AN 和TOC 含量呈正相關；溶桿菌屬（Lysobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）和極地所菌屬（Pricia）相對豐度與TP、AK、AP 和TOC 含量呈正相關，極地所菌屬（Pricia）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、Chryseolinea屬、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和類土地桿菌屬（Parapedobacter）相對豐度與土壤pH值呈正相關；噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和類土地桿菌屬（Parapedobacter）相對豐度與除pH 值之外的其他土壤理化性質指標均呈負相關關系。其他如戴沃斯菌屬（Devosia）、申氏桿菌屬（Shinella）和獨島菌屬（Dokdonella）細菌相對豐度也與土壤理化性質指標表現出一定的相關關系。

圖5 魔芋根系和根際土壤細菌群落屬組成與土壤因子的冗余分析（RDA）Fig.5 Redundancy analysis （RDA） of bacterial community composition at the genus level in roots and rhizosphere soils of A.konjac in relation to soil factors

2.4 魔芋根際土壤氮循環關鍵功能基因的表達豐度

通過qRT-PCR 對固氮微生物中編碼氮循環關鍵酶的7 個基因（nifH、AOAamoA、AOBamoA、narG、nirK、nirS和nosZ）豐度進行絕對定量分析。結果顯示（圖6），網隔和無隔處理的nifH基因拷貝數分別較全隔處理顯著增加82.36%和19.73%（圖6-A）。反硝化微生物nosZ和nirS基因拷貝數變幅分別為8.52×107～12.16×107和2.39×107～3.62×107copies·g-1，均呈現出無隔＞網隔＞全隔的變化趨勢，且全隔和網隔處理間無顯著差異，但無隔處理的nosZ和nirS基因拷貝數分別較全隔處理顯著增加42.79%和51.54%（圖6-B 和6-C）。反硝化微生物nirK基因拷貝數變幅為9.21×108～13.96×108copies·g-1，呈現出全隔＞無隔＞網隔的變化趨勢，但全隔和無隔處理間無顯著差異（圖6-D）；narG基因拷貝數在全隔、網隔和無隔處理間無顯著差異（圖6-E）。在全隔處理中，硝化微生物AOBamoA基因拷貝數分別較網隔和無隔處理顯著增加59.16%和56.41%（圖6-F）； AOAamoA基因拷貝數呈現出無隔＞全隔＞網隔的變化趨勢（圖6-G）。

圖6 不同分隔處理下魔芋根際土壤中氮循環關鍵功能基因qRT-PCR絕對定量分析Fig.6 Absolute quantification of nitrogen cycling-related key functional genes in rhizosphere soils of A.konjac under different separation treatments by qRT-PCR

2.5 魔芋軟腐病發病情況

魔芋播種50 d 時，魔芋‖刺槐無隔和網隔處理條件下，魔芋未發病，而全隔魔芋已開始出現發病癥狀。魔芋播種75 和200 d 時，全隔魔芋軟腐病病情指數分別是網隔處理的2.4 和2.0 倍，而無隔魔芋仍未發?。ū?）。上述結果說明根系互作和物質傳遞在刺槐‖魔芋間作系統中發揮著推遲和控制發病程度的作用。

表3 不同分隔處理下魔芋軟腐病發病情況及防治效果Table 3 The disease index and control efficiency of A.konjac soft rot under different separation treatments

2.6 根際細菌群落與魔芋軟腐病的相關性

以圖4-B 中13 個相對豐度≥1%的優勢屬為例，通過相關性圖可視化展示樣本中魔芋根際細菌多樣性、屬豐度以及氮循環關鍵功能基因拷貝數與軟腐病發病程度之間的關系。由圖7 可知，播種50 d 的魔芋軟腐病病情指數與溶桿菌屬（Lysobacter）細菌相對豐度呈顯著負相關（P＜0.05），與AOBamoA基因拷貝數呈極顯著正相關（P＜0.000 1）。播種75 和200 d 的魔芋軟腐病病情指數與溶桿菌屬（Lysobacter）和鏈霉菌屬（Streptomyces）相對豐度以及nirS基因和nosZ基因拷貝數呈顯著負相關，但與AOBamoA基因拷貝數呈顯著正相關（P＜0.05）。與不同調查時間段魔芋軟腐病病情指數和其他因子的相關性趨勢相比，防治效果與其他因子的相關性均表現出相反的趨勢。

圖7 細菌群落多樣性、屬豐度及氮循環關鍵功能基因拷貝數與魔芋軟腐病發生的Pearson相關性分析Fig.7 Pearson correlation analysis between bacterial community diversity，genus abundance，copy numbers of nitrogen cyclingrelated functional genes，and the development of A.konjac soft rot

3 討論

3.1 不同根系分隔方式對魔芋根際細菌多樣性和群落組成的影響

本研究利用高通量測序技術分析與刺槐不同根系分隔方式下的魔芋根際細菌多樣性。結果表明，與刺槐間作增加了魔芋根際細菌種類并豐富了其群落多樣性。一方面，與全隔相比，無隔處理改變作物覆被，使根系分布更為復雜，導致根際細菌與作物根系分泌物互作更頻繁［11-12］，從而改變了根際細菌代謝活性，促使間作魔芋根際細菌群落多樣性與單作產生差異。另一方面，豆科刺槐的固氮體系可以增加土壤氮素含量［28］，這也可能是影響魔芋根際細菌群落多樣性的原因。

在屬水平上，戴沃斯菌屬、極地所菌屬、藤黃單胞菌屬、鏈霉菌屬、溶桿菌屬5 類菌屬豐度值較大，在不同分隔處理樣品中的相對豐度≥1.0%；但未分類菌屬相對豐度最高，達68.25%～77.38%（圖4-B），說明各樣品中仍存在大量未知細菌有待進一步鑒定并探索其功能。無隔處理下魔芋根系和根際土壤鏈霉菌屬分布比例高于全隔處理。前人研究表明，有些鏈霉菌通過產生抗生素和水解酶類物質抑制魔芋土傳病原菌的生長［29］。根瘤菌可在非豆科植物中以內生菌形式普遍存在［30］，其中健康魔芋根表土壤和根內存在的放射型根瘤菌（Rhizobiumradiobacter）具有促生增產和抗魔芋軟腐病能力［31］。本研究同樣發現，與刺槐間作的魔芋根系和根際土壤中根瘤菌為較具優勢的一類種群，相對豐度分別達2.94%和1.68%；溶桿菌屬細菌在與刺槐間作的魔芋根際大量存在。研究表明，溶桿菌屬細菌對多種植物病原真菌、卵菌、革蘭氏陽性細菌及線蟲均有顯著的拮抗作用，是具有重要生防前景的一類細菌［32-33］。例如，溶桿菌屬生防菌06-4 能在魔芋根際生態位點穩定定殖，對魔芋軟腐病控制效果達58.92%［34］。Chryseolinea屬在與刺槐間作的魔芋根際也占有一定比例。有研究表明，Chryseolinea屬細菌在土壤氮循環過程中發揮著重要作用［35-36］。上述菌屬細菌豐度的增加可能有利于間作魔芋植株的生長并增強其抗病能力。

3.2 不同根系分隔方式對魔芋根際土壤氮循環關鍵功能基因豐度的影響

本研究利用qRT-PCR 技術檢測了7 個關鍵氮循環功能基因，以研究間作對參與反硝化、硝化和固氮作用微生物的影響。nifH是生物固氮的關鍵基因，主要編碼調控固氮酶鐵蛋白的合成；氨氧化古菌（ammoniaoxidizing archaea，AOA）的amoA基因編碼調控氨單加氧酶，參與調控硝化過程；nirS和nosZ是調控反硝化過程的關鍵基因。以上調控氮循環固氮過程（nifH）、硝化過程（AOAamoA）及反硝化過程（nirS和nosZ）的關鍵基因在無隔處理中的拷貝數顯著高于全隔單作（圖6），說明間作刺槐改變了魔芋根際微生物群落結構，尤其改變了氮循環相關微生物基因拷貝數，從而促進整個氮循環過程。與前人研究結果類似，如楊亞東等［37］研究表明，大豆‖燕麥和綠豆‖燕麥間作顯著提高了燕麥土壤固氮微生物nifH基因拷貝數，改變了固氮微生物的群落結構和優勢類群的相對豐度。

3.3 間作刺槐的魔芋根際細菌與軟腐病發生的關系

國內外研究認為，土傳病害的發生與土壤微生物多樣性相關［11-13，38］。一方面，土傳病害的發生會降低土壤微生物多樣性［29］，例如患有軟腐病的魔芋根系和根際土壤細菌群落結構發生改變且多樣性指數較健康土壤明顯降低［39］。另一方面，土壤微生物群落結構及多樣性變化也影響土傳病害的發生，例如微生物多樣性高的辣椒根際土壤枯萎病病原菌數量少且難以大量繁殖［40］。已有研究表明，魔芋軟腐病的發生及程度是病原菌與根際微生物互作的結果［41-43］。根際微生物在防控土傳病害和促進植物生長方面具有重要作用［44］。本研究中，網隔和無隔處理下魔芋軟腐病發病率較全隔明顯降低，可能與溶桿菌屬、鏈霉菌屬、固氮和反硝化微生物比例增加有關，這些細菌種類增強了植株抵抗病原菌的能力，從而降低了魔芋軟腐病的發病率。

4 結論

隨著刺槐與魔芋種間根系互作強度的增強，即種間根系從完全隔離（單作）到不完全隔離（半互作）再到開放無隔（互作）變化，魔芋根系和根際土壤細菌物種豐富度和α 多樣性指數依次增加。同時，間作改變了根際細菌和氮循環相關微生物群落結構，增加了一些有益細菌豐度，提高了植株對軟腐病菌的抵抗能力，從而降低了魔芋軟腐病的發病率。