斑點叉尾鮰ZBTB38的原核表達、多克隆抗體制備及應用

張世勇 劉洪巖 鐘立強 趙彥華 王明華 陳校輝 ，

（1江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017；2江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014）

ZBTB38（又被稱為CIBZ、ZNF921或PPP1R171）屬于ZBTB蛋白家族（zinc finger and BTB domain-containing protein family），是分子量最大、結構最復雜的蛋白之一，其N端具有1個BTB結構域（Broad-Complex，Tramtrack and Bric a brac domain）（約115 個氨基酸），C 端一般具有5～10 個鋅指結構域（zinc finger domain）。該蛋白家族C 端的鋅指結構分為兩種類型，即C2H2 型和C2HC型，識別固定的順式作用元件或與DNA 甲基化位點結合［1］，N 端的BTB 結構域一般介導同源或異源蛋白形成二聚體或多聚體，改變染色質構象，從而起到調控基因轉錄的目的［2］。ZBTB 蛋白家族中部分成員已證實在精子發生［3］、性別決定［4］、神經和器官發育［5］、腫瘤發生［6］等多種生物學過程中發揮重要作用。

斑點叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）是我國特色淡水魚類的重要組成部分。自1984 年從美國引入我國后，先后突破苗種繁育、養殖技術、質量安全控制與產品加工等技術難關，形成了完整的產業鏈條，備受烤魚市場和預制菜行業的青睞。自“十三五”以來，斑點叉尾鮰產業的發展持續向好，是我國目前最為熱門的淡水魚養殖品種之一，隨著其養殖面積和總產量不斷增加，2022 年全國總產量已突破40 萬噸［7］，養殖規模和產量實現了對美國的全面反超［8］，促使我國成為斑點叉尾鮰的主產國和主消費國。

關于斑點叉尾鮰性別決定機制，目前普遍認為其為雄性異配子型（XX/XY）［9］，且不存在異形性染色體［10］。迄今，國內外學者對斑點叉尾鮰性別決定基因以及性染色體鑒定已做過較多的研究。Bao 等［10］通過對YY 型和XX 型斑點叉尾鮰的基因組序列進行比較研究，證實性別決定座位遺傳距離小于0.5 cM，物理距離為8.9 Mb，但X 和Y 染色體上并未發現與哺乳動物Y染色體性別決定區基因（sex-determining region of Ychromosome，SRY）和鳥類double-sex 和mab-3 相關轉錄因子（double-sex and mab-3 related transcription factor，DMRT）類似的性別特異基因。在之前的研究中，江蘇省淡水水產研究所斑點叉尾鮰課題組（本課題組）從斑點叉尾鮰性染色體上的zbtb38基因的編碼區鑒定到13 個性別連鎖單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）標記，其中6 個替換分別導致X和Y 染色體上zbtb38基因氨基酸編碼發生改變［11］，推測其為斑點叉尾鮰重要的性別決定候選基因。

由于多克隆抗體具有多個抗原識別表位，能夠與特異性抗原緊密結合，在研究基因功能過程中發揮了重要的作用。目前，ZBTB38蛋白的商業多克隆抗體主要應用于人（Homosapiens）、小鼠（Musmusculus）等哺乳動物［12］，而在魚類中缺乏特異性高、穩定性強的該蛋白抗體，因此在魚類中開展ZBTB38 蛋白多克隆抗體制備研究，對于進一步探究該基因的功能具有重要的意義。ZBTB38蛋白是一類分子量較大的蛋白（超過150 kDa），過大的分子量在原核生物中一般難以被誘導表達，或表達效率降低，且更容易形成包涵體［13］。為解決這一問題，通常的做法是利用較大蛋白的部分保守序列制備多克隆抗體，如人谷氨酰胺果糖6 磷酸氨基轉移酶1（GFPT1）［14］、鯉魚SLC15A1［15］、環形泰勒蟲DnaJ［16］等蛋白多克隆抗體均是通過該策略制備而成。在本研究中，將zbtb38基因部分序列經密碼子優化后連接至pET32a（+）載體以構建重組質粒pET32a（+）-zbtb38，利用原核表達系統誘導表達融合蛋白，免疫新西蘭白兔制備高效價兔源多克隆抗體，并使用該抗體利用免疫印跡（Western blot）技術檢測ZBTB38 蛋白在斑點叉尾鮰性腺組織中的表達水平，旨在為進一步在蛋白水平研究斑點叉尾鮰zbtb38基因的功能建立基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21（DE3）、中分子質量蛋白標記（Marker）（14.4～94 kDa），購自北京天根生化科技有限公司；山羊抗兔-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗、質粒pET32a（+），購自南京鐘鼎生物公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis）、三羥甲基氨基甲烷［Tris（hydroxymethyl）aminoethane，Tris］、弗氏佐劑，購自美國Sigma公司；透析袋和0.22 μm無菌濾器，購自美國Millipore 公司；四甲基乙二胺，購自美國伯樂公司；Ni-NTA瓊脂糖親和填料，購自德國QIAGEN公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒，購自江蘇碧云天生物技術研究院；RNA提取試劑盒、DNase I、PrimeScriptTMRT 試劑盒、SYBR?PrimeScript?Plus RT-PCR 試劑盒，購自大連TaKaRa 公司；新西蘭實驗兔由江蘇省農業科學院提供；斑點叉尾鮰試驗魚為本課題組培育。

1.2 試驗儀器

Allegra 21R臺式高速冷凍離心機（美國BECKMAN）；Centrifuge 5810 R 臺式高速離心機（德國Eppendorf）；320-S pH計（美國Mettler Toledo）；AR5120電子天平（美國AHOΜS）；MultiTemp Ⅲ恒溫水浴鍋（美國Amersham Pharmacia）；SIM-F140AY65 雪花狀制冰機（日本SANYO）；SW-CJ-1FD 超凈工作臺（中國蘇凈）；龍ETC-811 PCR 儀（中國東勝）；CFX96 熒光定量PCR 儀器；Mini-PROTEAN Tetra Cell 電泳儀（美國Bio-Rad）；Wellwash 4 MK2洗板機、Model 705超聲波細胞破碎儀、Q Exactive 質譜儀、Dionex Ultimate 3000 RSLCnano 液相色譜、Multiskan FC酶標儀（美國Thermo）等。

1.3 pET32a（+）-zbtb38重組表達載體的構建

由于原核生物蛋白表達具有密碼子偏好性，在構建斑點叉尾鮰zbtb38基因原核表達載體前，利用MaxCodonTMOptimization Program（v13）軟件將其開放閱讀框（open reading frame，ORF）前1 239 bp序列優化為適于原核表達的基因序列，且翻譯的蛋白序列不變，利用SMART軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析并繪制ZBTB38蛋白結構域示意圖。密碼子優化的總原則為用宿主細胞中使用頻率高的同義密碼子替換外源mRNA序列中的密碼子，保證外源mRNA序列中的密碼子和宿主細胞的密碼子使用偏向性更加契合，避免出現稀有密碼子，同時規避目標限制性內切酶位點。使用Clustal Omega多序列比對軟件（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）比較優化前后zbtb38基因序列。直接合成優化后的基因序列，在兩端添加含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點序列，并在基因序列3′端添加6× Histag 序列，基因合成委托南京金斯瑞公司完成，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因序列大小。用NdeI和XhoⅠ限制性內切酶對pET-32a（+）質粒和合成的基因序列進行雙酶切，之后將zbtb38基因連接到pET-32a（+）載體中。將pET32a（+）-zbtb38 原核表達載體轉化至大腸桿菌DH5α中，并進行PCR菌落鑒定和測序驗證。

1.4 重組ZBTB38蛋白誘導表達與純化

將測序正確的重組表達載體轉化至E.coliBL21（DE3）中，菌落PCR 鑒定陽性菌落后，取含重組質粒的菌液50 μL，接種至溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養基中（含卡那霉素），在37 ℃、200 r·min-1條件下培養4 h 后，用0.2 mmol·L-1IPTG 在16 ℃、200 r·min-1條件下過夜誘導融合蛋白表達。收集誘導表達后的菌體，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）鑒定成功表達后，對菌體進行超聲破碎；4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心30 min 后收集沉淀，使用12% SDS-PAGE鑒定，考馬斯亮藍染色。

利用低壓層析系統，上清溶液以0.5 mL·min-1流速上樣至Ni-IDA-Sepharose Cl-6B親和層析柱（上樣前層析柱經Ni-IDA Binding-Buffer 預平衡），以0.5 mL·min-1流速沖洗，直至流出液的280 nm 吸光值（OD280）到達基線。然后用Ni-IDA Washing-Buffer 以1 mL·min-1流速沖洗，至流出液的OD280值到達基線。再用Ni-IDA Elution-Buffer 以1 mL·min-1流速洗脫目的蛋白，收集流出液。收集上述蛋白流出液加入透析袋中，并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液透析過夜，最后使用12% SDS-PAGE鑒定目的蛋白。

1.5 重組ZBTB38蛋白鑒定

采用三種方法對純化后的重組蛋白進行鑒定：（1）以0.5 mg·mL-1牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為蛋白質標準品，使用12% SDS-PAGE 鑒定純化后的ZBTB38 蛋白；（2）使用Western blot 方法，以Anti-His Tag抗體檢測帶有His標簽的重組ZBTB38蛋白，從而實現對重組蛋白的敏感檢測；（3）使用液相色譜-質譜聯用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LCMS）精準鑒定重組ZBTB38 蛋白，具體過程為重組蛋白切膠回收后經水洗、脫色、脫水、烷基化、水洗、脫水等系列步驟后，用胰蛋白酶酶切重組ZBTB38 蛋白，進一步超聲破碎后并提取肽段，肽段用樣品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解，用冷凍離心機在4 ℃、13 200 r·min-1條件下離心20 min，取上清液利用LCMS 技術進行進一步鑒定。使用MM File Conversion軟件處理質譜原始下機文件，然后用MASCOT 軟件（http：//www.matrixscience.com/）在uniprot 數據庫中進行檢索。肽段在質譜儀中離子化后，會帶上一定量的電荷，通過檢測器分析，可得到各肽段的質荷比（m/z），從而得知各肽段的相對分子質量。

1.6 重組ZBTB38蛋白多克隆抗體的制備及鑒定

已純化的重組ZBTB38蛋白進行二喹啉甲酸（BCA）濃度測定后，與等量的完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，進行兔源多克隆抗體制備。分3 次免疫，14～21 d免疫1 次，每次400 μg 皮下免疫。第3 次免疫后，于第7 天采血，并根據間接酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法確定抗血清針對斑點叉尾鮰ZBTB38 蛋白的效價，當抗血清效價大于1∶50 000時采血制備最終抗血清。制備成抗原親和純化層析柱：ZBTB38 重組蛋白與瓊脂糖介質偶聯，將上述抗血清與PBS溶液等量混合后緩慢上樣；用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫層析柱，收集洗脫液。在PBS溶液中4 ℃過夜透析層析柱，隔日檢測抗體的純度、濃度以及效價。

采用BCA 濃度測定試劑盒測定抗體濃度；使用12% SDS-PAGE電泳后進行考馬斯亮藍染色，以鑒定抗體純度。通過間接ELISA 檢測純化抗體的效價，操作過程參見文獻［17］。將相應稀釋度的稀釋液在450 nm吸光值/陰性吸光值＞2.1定為抗體的效價。

1.7 性腺組織ZBTB38蛋白和基因表達檢測

分別取斑點叉尾鮰精巢和卵巢組織各0.5 g，用RIPA 裂解液提取總蛋白，經BCA 法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液后煮沸5 min，14 000 r·min-1離心5 min，取上清液進行Western blot檢測，使用H3組蛋白作為內參［18］。

分別取斑點叉尾鮰精巢和卵巢組織50 mg，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA；使用DNase I 去除基因組DNA，并檢測RNA 濃度和質量。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit 將肝臟中提取的總RNA 進行反轉錄獲得cDNA。通過Primer 5.0軟件設計實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物，以αtubulin基因作為內參基因［19］，引物序列如表1所示。使用SYBR?PrimeScript?Plus RT-PCR 試劑盒進行qRTPCR。根據2-ΔΔCT法分析數據，定量數據以“平均值±標準差”表示，利用t檢驗進行基因表達差異性分析。

表1 qRT-PCR反應檢測基因表達所用的引物信息Table 1 The primers for qRT-PCR used in this study

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的鑒定

斑點叉尾鮰zbtb38基因ORF 前1 239 bp 序列編碼的蛋白序列包含BTB結構域、2個鋅指結構（圖1-A），優化后的zbtb38基因序列與原序列的比對情況如圖1-B所示。其中，236個密碼子的1個堿基發生改變（第1位11 個、第3 位225 個），19 個密碼子的兩個堿基發生改變（第1 和第2 位9 個、第1 和第3 位10 個），27 個密碼子的3 個堿基均發生改變。人工合成優化后的斑點叉尾鮰zbtb38基因片段，并與pET32a（+）載體一同進行NdeⅠ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切，酶切過后的載體與目的基因形成重組質粒。重組質粒經菌落PCR和測序驗證，測序結果與設計的序列一致，說明重組載體pET32a（+）-zbtb38 質粒構建成功，兩種序列的部分測序峰圖如圖1-C所示。

圖1 斑點叉尾鮰zbtb38基因及蛋白序列Fig.1 zbtb38 gene and protein sequence of channel catfish

2.2 重組蛋白的表達與純化

將測序正確的pET32a（+）-zbtb38 重組表達載體轉化至E.coliBL21（DE3）表達菌株中，以空載體pET32a（DE3）作為對照。SDS-PAGE 結果顯示相對于未經IPTG 誘導的E.coliBL21（DE3）大腸桿菌，經過IPTG 誘導后，在45 kDa 上方出現特異性目的條帶（圖2-A），但目的蛋白比預測的分子量（46.34 kDa）略大，可能是蛋白表達后進行了翻譯后修飾或蛋白質折疊。大批量誘導后的E.coliBL21（DE3）大腸桿菌經過高壓破碎和純化，得到了特異的單一條帶（圖2-B），表明成功表達出重組ZBTB38蛋白。

圖2 重組蛋白表達與純化的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant ZBTB38 protein

2.3 重組蛋白的鑒定

根據SDS-PAGE（圖3-A）和Western blot（圖3-B）鑒定結果進一步證明了重組ZBTB38 蛋白分子量比理論分子量偏大，故采用LC-MS 進行進一步鑒定。檢索軟件根據肽段二級質譜信息與數據庫比對，結合匹配度打分及錯配過濾，得到肽段的確切序列，進而拼接出蛋白的完整序列。經液相質譜檢測，重組ZBTB38 蛋白序列與預期一致。

圖3 重組蛋白質檢分析Fig.3 Quality control of recombinant ZBTB38 protein

2.4 重組ZBTB38蛋白多克隆抗體鑒定

第3 次加強免疫后，采集兔血清，間接ELISA 檢測檢測血清中特異性抗體的效價，當樣品吸光值/陰性吸光值＞2.1 即認為是陽性。結果發現，所得血清效價可達1∶512 000（圖4-A）。已純化的抗體進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，可見兔抗斑點叉尾鮰ZBTB38蛋白多克隆抗體重鏈為55 kDa（圖4-B），純度在85%以上。BCA 法測得抗體濃度為0.42 mg·mL-1，抗體得率達到5.04 mg。表明以斑點叉尾鮰重組ZBTB38 蛋白為免疫原，制備出了高效價的特異性多克隆抗體。

圖4 重組ZBTB38蛋白多克隆抗體鑒定Fig.4 Identification of polyclonal antibody of recombinant protein

2.5 qRT-PCR 和Western blot 對zbtb38 基因的比較分析

為進一步驗證制備的抗體的有效性，用兔抗斑點叉尾鮰ZBTB38 抗體檢測斑點叉尾鮰精巢和卵巢組織中ZBTB38 蛋白的表達水平，結果如圖5-A 所示。ZBTB38蛋白在精巢組織中表達量最高，而在卵巢中的表達量最低。同時，為了驗證上述結果，采用qRTPCR 方法檢測了精巢和卵巢組織中zbtb38基因的表達水平，精巢組織中zbtb38基因的表達水平極顯著高于卵巢，結果與Western blot檢測結果一致（圖5-B）。

圖5 斑點叉尾鮰zbtb38基因在精巢和卵巢組織中的表達分析Fig.5 Expression patterns of zbtb38 gene and protein in testis and ovary of channel catfish

3 討論

為了深入研究斑點叉尾鮰zbtb38基因的功能，本研究首先制備了含有ZBTB38 蛋白N 端413 個氨基酸序列的重組蛋白，并以此重組蛋白作為抗原免疫動物獲得了特異性較強、效價較高的多克隆抗體。制備的兔抗斑點叉尾鮰ZBTB38 蛋白多克隆抗體能特異性識別性腺組織中的ZBTB38蛋白。

在本研究中，將斑點叉尾鮰zbtb38基因序列優化為適于原核表達的基因序列，因為不同物種對同義密碼子的使用頻率往往不同。在外源基因的同義密碼子使用頻率與表達宿主相匹配的情況下，外源基因的表達水平會顯著提高［20］。因此，利用原核生物表達真核生物基因時進行密碼子優化是十分必要的，經過優化的基因序列能提高mRNA 二級結構的穩定性，避免因tRNA不充足導致翻譯延遲、移碼、終止，以及氨基酸錯配等情況發生。趙茜［21］在進行金魚（Carassiusauratus）Tgf2 轉座酶原核表達研究時，依據大腸桿菌對密碼子的簡并性和偏好性對金魚Tgf2 轉座酶的密碼子進行優化，不僅增加了重組蛋白表達量，而且純度也得到了提高。

本研究通過牛血清白蛋白（BSA）標準品SDS-PAGE以及Western blot 等方法對表達的目標蛋白進行鑒定，發現其實際分子量相較于理論分子量偏大，進一步的質譜鑒定證明獲得的蛋白確實為目標蛋白。對于分子量偏差的原因可能是：（1）ZBTB38 蛋白N 端413 個氨基酸與6×His-tag 組成的重組蛋白等電點為7.45，堿性蛋白與SDS 形成復合物后，仍含有大量緊密的螺旋結構［22］，而不是松散的無規則卷曲，較為緊密的構型使復合物在凝膠中有更小的阻力，因此遷移更快；（2）重組蛋白具有兩個鋅指結構域，仍具有鋅離子結合能力［23］，從而使其帶有較高的正電荷，為中和正電荷，蛋白通常會經歷蛋白修飾（如糖基化、乙?；揎椀龋?，結合的大量鋅離子和各種修飾導致分子量偏大。

多項研究表明，ZBTB 家族基因在哺乳動物性腺分化和發育過程中具有重要的作用。哺乳動物性別決定基因SRY上游調控區序列包含一個BTB-zinc finger 結合位點，這意味著SRY基因受到ZBTB 蛋白家族的調控［24］。利用同源重組技術將小鼠plzf（zbtb16）基因第二外顯子敲除后，其睪丸變小，成年期精原細胞逐漸消失，精子形成過程發生阻斷［25］。而bcl6（zbtb27）基因缺陷型小鼠精子數目比plzf缺陷小鼠更少，且精母細胞在減數分裂中期的I 時期凋亡程度更大［26］。同為ZBTB 家族的fru基因能夠調控果蠅（Drosophila melanogaster）的求偶行為，fru基因的變異會導致果蠅求偶對象發生改變［27］。與ZBTB38高度同源的Kaiso蛋白（ZBTB33）在調控細胞凋亡時，與野生型p53 蛋白結合會激活細胞凋亡通路上的相關基因［28］，而與突變型p53 蛋白結合會抑制細胞凋亡通路上的相關基因［29］。Kaiso 蛋白通過其鋅指結構域識別并調控N-CoR［30］、Rapsyn［31］、BRCA1［32］等蛋白，以及WNT/β-Catenin［33］、TGF-β［34］等信號通路參與的生物學過程，其中大多數蛋白和信號通路均參與不同物種的性別決定過程。在本研究中，使用制備的兔抗斑點叉尾鮰ZBTB38蛋白抗體并結合qRT-PCR 技術檢測了zbtb38基因及其編碼的蛋白在斑點叉尾鮰性腺組織中的表達水平，結果表明精巢組織中zbtb38基因的表達水平極顯著高于卵巢，結果與Wu 等［35］在點帶石斑魚（Epinephelus coioides）中關于zbtb40基因的研究結果較為一致。說明zbtb38基因及其家族基因在魚類性別決定和維持等方面具有重要的作用。

4 結論

本研究基于密碼子的簡并性和偏好性原則，優化斑點叉尾鮰zbtb38基因部分編碼序列，成功構建了其原核表達載體pET32a（+）-zbtb38。通過原核表達系統E.coliBL21 （DE3）誘導表達出ZBTB38 重組蛋白，利用重組蛋白制備了效價高、特異性強的兔抗斑點叉尾鮰ZBTB38 蛋白多克隆抗體。應用該抗體檢測了ZBTB38蛋白在斑點叉尾鮰性腺組織中的表達水平，證明其在精巢中的表達水平顯著高于卵巢。