環維黃楊星D對醛固酮誘導型心肌肥厚和凋亡的保護作用及機制*

蔣丹, 劉斌, 付凌云, 徐旖旎, 陶玲, 沈祥春*

(貴州醫科大學藥學院 &貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室, 貴州醫科大學, 貴州 貴陽 550025)

心血管疾病死亡率高、預后差,嚴重影響患者的生活質量[1]。心肌肥厚是心臟為滿足應激而激活的一種代償反應,以心肌細胞體積增大、蛋白累積增加為特征[2]。心肌肥厚初始是增強心臟功能的代償性反應,如運動或妊娠時。但長期心肌肥厚會誘發心室重塑、心力衰竭[3]。醛固酮(aldosterone,ALD)是激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)分泌的一種效應因子,參與心肌肥厚及心力衰竭的病理進程[4]。但ALD誘發的心肌肥厚病理機制尚不明確,因此,探究ALD誘導心肌肥厚的病理機制對探索治療心肌肥厚的新藥意義重大。沉默信息調節因子3(sirtuin3,Sirt3)在心臟中高度表達,在調節心肌肥厚、心肌梗死等心血管疾病中有重要作用[5]。研究表明,Sirt3過表達可減輕心肌肥厚和纖維化,防止心臟重塑和心臟功能障礙[6]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,PPARγ)作為核受體超家族的成員,是一種配體激活的轉錄因子,參與葡萄糖代謝、炎癥反應等[7]。有研究發現激活PPARγ可以減輕心衰小鼠的心室重塑、肥大和纖維化[8]。Sirt3通過激活PPARγ來改善血管生成和成纖維細胞轉分化等[9-10]。但關于Sirt3/PPARγ通路在ALD誘導的心肌肥厚中的作用研究未見報道。環維黃楊星 D(cyclovirobuxineD,CVB-D)是黃楊科植物小葉黃楊 (buxusmicrophyllasieb.et zucc.var.sinica rehd.et wils)及其同屬植物中提取而得的一種生物堿[11]。它作為我國研發的創新藥物,臨床已應用于多種心血管系統疾病,如心律失常、心絞痛和心力衰竭等[12]。本課題組前期研究證實CVB-D改善ALD誘導的心肌損傷和凋亡[13-14]。因此,本研究以ALD誘導心肌肥厚為模型,探討CVB-D減輕心肌肥厚和抑制凋亡的分子機制,為臨床治療心肌肥厚提供新靶點和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 體外實驗:新生1～3 d的SPF級SD大鼠,雌雄不拘,許可證號[SCXK(湘)2019-0014]。體內實驗:8周齡的SPF級C57BL/6雄性小鼠,18～22 g,50只,許可證號[SCXK(京)2019-0010]。所有動物由貴州醫科大學動物實驗中心提供,動物實驗經貴州醫科大學動物倫理委員會批準(批號2000904),符合動物倫理要求。

1.1.2藥物及試劑 CVB-D(成都普思生物科技股份有限公司,860-79-7),螺內酯(上海江萊生物科技有限公司,52-01-7),醛固酮(美國Sigma公司,#MKBX 5094V),5-溴脫氧尿嘧啶(美國Sigma公司,59-14-3),胰酶(維森特生物科技有限公司,2327859),青鏈霉素混合液(維森特生物科技有限公司,450-201-EL),DMEM高糖培養基(美國Gibco公司,8122356),胎牛血清(成都普思制藥公司,21110705),噻唑藍(北京索萊寶公司,117X0516),心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)購于英國Abcam(ab180649),B型尿鈉肽(b-type natriuretic peptide,BNP)購于英國Abcam(ab239510),心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT;15513-1-AP)、Bcl-2相關X蛋白(bcl-2 associated x protein,Bax;50599-2-Ig)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl2;26593-1-AP)、胱天蛋白酶3(Caspase3,19677-1-AP)、去乙?；?3(Sirtuin 3,Sirt3;10099-1-AP)和PPARγ(16643-1-AP)均購于美國Proteintech 公司,3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydes-3-phophate dehydrogenase,GAPDH)購于上海Bioworld(AP0063);BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司,PC0020);吉姆薩染色試劑盒 (珠海貝索生物有限公司,417086),乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所,A003-1-2/20210103)。ADV6-NC和Ad-Sirt3購自吉瑪基因。

1.1.3儀器 HF90型二氧化碳培養箱(上海力申科學儀器有限公司),VARIOSKANLUX多功能酶標儀(美國Themo Fisher Scientific公司),CFX型凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司),80-2型電動離心機(常州澳華儀器有限公司),XDS-2B型倒置顯微鏡(日本尼康公司),Dmi8倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司),小動物超聲成像系統(蘇州飛依諾科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1動物分組、造模及給藥 50只小鼠適應性喂養1周,隨機分為對照組(Control組)、模型組(ALD組,80 μg/kg),CVB-D低劑量組(CVB-D.L組,0.5 mg/kg CVB-D+80 μg/kg ALD),CVB-D高劑量組(CVB-D.H組, 1 mg/kg CVB-D+80 μg/kg ALD),陽性藥螺內酯組(Spir.組,20 mg/kg Spir.+80 μg/kg ALD),每組10只。給藥組連續7 d灌胃給予對應藥物,期間Control組、ALD組灌胃等量雙蒸水。第8天時,ALD組及給藥組頸背部皮下注射ALD并聯合高鹽飲水(1%NaCl),Control組皮下注射等量生理鹽水正常飲水,持續灌胃。給予ALD 8周后,乙醚麻醉小鼠,解剖取心臟。

1.2.2心功能檢測 小鼠經麻醉后固定四肢,脫去胸前毛發,涂抹超聲耦合劑,用小動物B超儀于M型下記錄超聲心動圖,并分析左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室縮短分數(left ventricular fractional shortening, LVFS)。

1.2.3組織病理學 心臟組織經預冷的PBS漂洗干凈,浸泡到 4%多聚甲醛固定。固定的心臟組織依次經脫水透化,石蠟包埋后切片。用HE、Masson及小麥胚芽凝集素熒光(WGA)試劑染色,封片后顯微鏡鏡檢,采集圖像并分析。

1.2.4原代新生大鼠心肌細胞(primary rat neonatal cardiomyocytes,PNRCMs)的培養和鑒定 通過胰酶消化法和差速貼壁法提取PNRCMs。取新生1～3 d的SD大鼠乳鼠的心臟,預冷的PBS沖洗2次,青霉素鏈霉素漂洗1次,PBS再次沖洗2次后剪成約1 mm3的組織小塊,加入4 mL 0.125%的胰酶消化液于4 ℃過夜。次日,加入6 mL 0.08%胰酶于37 ℃靜置5 min,膠頭滴管輕輕吹打5 min,上清與血清混合以終止消化,重復以上步驟至組織塊消失。細胞混合液于1 000 r/min離心5 min,用6 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸接種到培養瓶,90 min后按所需密度接種細胞,并加入終濃度為0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶置37 ℃,5%CO2的培養箱中培養72 h,采用cTnT鑒定細胞純度。

1.2.5PNRCMs藥物分組 于培養PNRCMs 72 h時點,給藥組先用CVB-D和螺內酯預保護2 h,與ALD共同孵育48 h后再進行后續實驗。實驗分組(1)為對照組(Control)、模型組(ALD,10 μmol/L),CVB-D低劑量組(CVB-D.L,0.1 μmol/L CVB-D+10 μmol/L ALD),CVB-D高劑量組(CVB-D.H, 1 μmol/L CVB-D+10 μmol/L ALD),陽性藥螺內酯組(Spir.組,1 μmol/L Spir.+10 μmol/L ALD)。Sirt3的過表達載體(Ad-Sirt3)對CVB-D改善PNRCMs肥大和凋亡的影響分組(2)為陰性對照組(ADV6-NC組),ALD(10 μmol/L)+ADV6-NC組,CVB-D(1 μmol/L CVB-D+10 μmol/L ALD)+ADV6-NC組,Ad-Sirt3組,ALD(10 μmol/L ALD)+Ad-Sirt3組,CVB-D(1 μmol/L CVB-D+10 μmol/L ALD)+Ad-Sirt3組。

1.3 觀察指標

1.3.1MTT檢測PNRCMs活力 將PNRCMs以1×109個/L的密度接種到96孔板中培養72 h后,分別加入0.1、1、10、100 μmol/L的ALD分別作用12、24、48 h摸索ALD造模濃度和時間,再給予0.1、0.5、1 μmol/L CVB-D和1 μmol/L Spir. 共孵育;48 h后每孔加入20 μL MTT(5 g/L)孵育4 h,棄上清液,每孔加入150 μL DMSO后,置于水平搖床至底部晶體溶解;最后,在490 nm處測定吸光度值,計算細胞存活率。

1.3.2吉姆薩染色觀察細胞形態 提取PNRCMs后接種于6孔板,培養72 h后按方法1.2.5分組(1)進行給藥處理;48 h后棄培養基,PBS洗3次,4 %的多聚甲醛固定15 min;按照試劑說明書加入吉姆薩A液和B液染色,于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3LDH的測定 提取PNRCMs后接種于6孔板,培養72 h后按方法1.2.5分組(1)進行給藥處理;48 h后收集細胞上清液,及時根據南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行檢測,最后于450 nm處測定吸光度值,計算結果。

1.3.4免疫熒光檢測細胞表面積 提取PNRCMs后接種于6孔板,培養72 h后按方法1.2.5分組(1)進行給藥處理;48 h后棄細胞培養液,PBS洗3次,4 %的多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,山羊血清封閉40 min;加入cTnT(1∶500)一抗孵育過夜;次日,避光回收一抗,PBS洗 3次;先孵育熒光二抗1 h,再用DAPI染細胞核 5 min;最后于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5Western blot檢測蛋白的表達 取5 mg心臟組織,剪碎后加入RIPA裂解液,置冰上振搖30 min;PNRCMs按方法1.2.5分組(1)處理,48 h后棄細胞培養液,加入RIPA裂解液置冰上振搖30 min提取細胞總蛋白。BCA定量試劑盒定量,分裝好的蛋白經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕法轉膜,將蛋白轉至PVDF膜上,用5%牛血清白蛋白V封閉2 h,按照不同蛋白的分子量剪膜,加入相應的一抗孵育:ANP(1∶1 000)、BNP(1∶500)、Bax(1∶2 000)、Bcl2(1∶2 000)、Caspase3(1∶1 000)、Sirt3(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000),室溫孵育30 min,4 ℃過夜。次日孵育相應的二抗90 min,TBST洗3次。ECL發光液淋膜,采用Bio-Rad蛋白質印跡成像系統顯影,采集圖像,最后用Image Lab 4.0軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.3.6Sirt3在PNRCMs中過表達 提取PNRCMs后接種于6孔板,每孔加入1 mL中含1 μL腺病毒的培養液感染細胞,適當晃蕩6孔板,在37 ℃培養箱孵育8 h后更換新培養液,待細胞恢復12 h后給藥。通過免疫印跡檢測轉染效率。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 CVB-D對ALD誘導小鼠心功能的影響

小動物B超儀檢測心功能結果如圖1所示,與Control組相比,ALD組小鼠心動圖紊亂無規律,心臟質量/體質量(HW/BW)增加(P<0.01),LVEF、LVFS均降低(P<0.01);與ALD組相比,CVB-D.L組、CVB-D.H組小鼠心動圖較為規律且清晰,顯著降低HW/BW(P<0.01),升高LVEF和LVFS (P<0.01)。以上提示CVB-D可改善ALD誘導小鼠心臟功能的損傷。

注：A為小鼠超聲心動圖的代表圖,B、C為LVEF和LVFS的統計結果,D為HW/BW統計圖;(1)與Control組比較,P<0.01;(2)與ALD組比較,P<0.01。

2.2 CVB-D對ALD誘導小鼠心臟病理形態的影響

HE染色結果顯示,Control組小鼠心肌結構完整且排列有序,無明顯細胞壞死;ALD組小鼠心肌纖維紊亂,心肌細胞肥大、炎癥細胞浸潤;CVB-D.L、CVB-D.H組小鼠心臟心肌細胞肥大、壞死等均明顯改善。Masson染色結果顯示,Control組小鼠膠原纖維排列整齊,無明顯膠原沉積;ALD組小鼠膠原纖維沉積、斷裂,明顯纖維化;CVB-D.L、CVB-D.H組小鼠纖維沉積明顯減少。以上結果表明CVB-D改善ALD誘導的心臟組織病理變化。見圖2。

注：HE中箭頭所指細胞腫脹,纖維排列紊亂;Masson中箭頭所指纖維斷裂、纖維化。

2.3 CVB-D對ALD誘導小鼠心肌肥厚的影響

WGA是特異性結合心肌細胞膜的糖蛋白,因此,本研究采用WGA染色分析心肌細胞是否肥大。如圖 3A所示,與Control組相比,ALD組小鼠心肌細胞明顯增大,提示ALD誘導小鼠心肌細胞肥大;與ALD組相比,CVB-D.L、CVB-D.H組小鼠心肌細胞明顯減小。為進一步明確CVB-D對心肌肥厚小鼠心臟的保護作用,本研究檢測了肥厚指標ANP和BNP蛋白表達水平。如圖3B所示,與Control組相比,ALD組小鼠心臟組織ANP、BNP表達明顯上調(P<0.05);與ALD組相比,CVB-D.L、CVB-D.H組ANP、BNP表達明顯下調(P<0.05)。以上結果表明,CVB-D改善ALD誘導的小鼠心肌肥厚。

注：A為CVB-D對ALD誘導心肌細胞面積的影響(400×),B為ANP和BNP蛋白的表達水平,(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與ALD組比較,P<0.05。

2.4 CVB-D對ALD誘導PNRCMs損傷的影響

2.4.1ALD和CVB-D對PNRCMs活力的影響 PNRCMs純度鑒定結果見圖 4A。ALD分別以0.1、1、10、100 μmol/L處理PNRCMs 12、24、48 h,如圖4B所示,與Control組相比,PNRCMs活力均有不同程度的降低(P<0.05);最終選擇10 μmol/L的ALD作用PNRCMs 48 h時,細胞活力降低了20%(P<0.01);如圖4C所示0.1、0.5及1 μmol/L的 CVB-D對ALD誘導的PNRCMs損傷均有改善作用(P<0.05)。

注：A為免疫熒光法鑒定PNRCMs純度圖(400×),B、C為不同濃度ALD對PNRCMs活力的影響;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與Control組比較,P<0.01;(3)與ALD組比較,P<0.05。

2.4.2CVB-D對ALD誘導的PNRCMs損傷的影響吉姆薩染色結果顯示,與Control組相比,ALD導致PNRCMs肥大,細胞核易位、皺縮,出現空泡化,而CVB-D可以改善以上細胞形態變化,見圖5A。LDH結果顯示,與Control組相比,ALD組胞內LDH的滲漏增加(P<0.01),而CVB-D.L、CVB-D.H組均降低了胞內LDH滲漏(P<0.05),見圖 5B。以上結果提示,CVB-D可以改善ALD誘導PNRCMs損傷。

注：A為吉姆薩染色觀察PNRCMs形態(200×),B為細胞培養上清液中LDH的泄漏率;(1)與Control組比較,P<0.01;(2)與ALD組比較,P<0.05。

2.5 CVB-D對凋亡相關蛋白Bax,Bcl2,Caspase3表達的影響

Western blot結果提示(見圖6),與Control組相比,ALD組中Bax和Caspase3的蛋白表達水平上調(P<0.01),Bcl2的蛋白水平下調(P<0.01),而CVB-D可逆轉上述蛋白的表達(P<0.05)。提示CVB-D可以改善ALD誘導的細胞凋亡。

注：A為Bax、Caspase3和Bcl2蛋白印跡代表圖,B為Bax、Caspase3和Bcl2蛋白表達定量結果;(1)與Control組比較,P<0.01;(2)與ALD組比較,P<0.05;(3)與ALD組相比,P<0.01。

2.6 CVB-D對ALD誘導的PNRCMs肥大的影響

cTnT熒光染色結果如圖7A所示,與Control組相比,ALD組心肌細胞表面積增大,CVB-D顯著降低心肌細胞表面積。Western blot結果也提示,與Control組相比,ALD處理增加了肥厚蛋白ANP和BNP的表達水平(P<0.05),而CVB-D.L、CVB-D.H組均逆轉ANP和BNP的蛋白表達水平(P<0.05),見圖 7B。以上結果表明CVB-D可以改善ALD誘導的PNRCMs肥大。

注：A為cTnT檢測PNRCMs細胞大小的熒光圖(400×),B為ANP和BNP蛋白的表達水平;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與ALD組比較,P<0.05;(3)與ALD組相比,P<0.01。

2.7 CVB-D對ALD誘導的Sirt3和PPARγ蛋白表達的影響

Western blot結果如圖8所示,與Control組相比,ALD組中Sirt 3和PPARγ的蛋白表達水平下調(P<0.01),CVB-D上調Sirt 3和PPARγ的表達(P<0.05),提示Sirt3和PPARγ參與了CVB-D改善ALD誘導的心肌肥大的過程。

注：A為Sirt3和PPARγ蛋白印跡代表圖,B為Sirt3和PPARγ蛋白表達定量結果;(1)與Control組比較,P<0.01;(2)與ALD組比較,P<0.05。

2.8 CVB-D改善ALD誘導的PNRCMs肥大和凋亡與上調Sirt3信號的關系

Western blot結果顯示,ALD可顯著增加ANP、BNP、Bax和Caspase3的表達(P<0.01),降低Bcl2、PPARγ和Sirt3的表達(P<0.01),單獨使用CVB-D或Ad-Sirt3可降低ANP、BNP、Bax和Caspase3蛋白的表達(P<0.05),增加Bcl2、Sirt3和PPARγ的表達(P<0.05),提示在ALD誘導心肌肥厚中Sirt3可能作為一種負調控因子;CVB-D和Ad-Sirt3聯合應用時則增強了CVB-D下調肥大、凋亡和PPARγ蛋白表達的能力(P<0.05),提示CVB-D可能通過調節Sirt3/ PPARγ信號改善ALD誘導的心肌肥厚和凋亡。見圖9。

3 討論

心肌肥厚是心力衰竭最危險的獨立病理因素之一,是心臟為了滿足應激需要而激活的一種保護機制。但長期的心肌肥厚會影響心肌供需,誘發心肌梗死、心律失常和心力衰竭等多種心血管疾病[15],探究心肌肥厚的治療策略對預防心力衰竭有益。ALD是一種鹽皮質激素,它可以調節電解質穩態、容量和血壓等,但心臟長期處于高ALD的環境,心肌和周圍血管易發生纖維化,促進膠原纖維形成、心室重塑,從而引發心臟衰竭;使用ALD拮抗劑如螺內酯等對降低心衰的死亡率有一定作用[16-17]。因此,闡明ALD誘導心肌肥厚的發病機制十分重要。

中藥是我國傳統中醫特有藥物,而且在治療心肌肥厚方面頗有療效。CVB-D是傳統中藥小葉黃楊的主要活性成分,對治療心血管疾病有良好的藥理活性,臨床常用制劑有黃楊寧片[18]?，F有多項研究揭示CVB-D的作用機制與Nrf2抗氧化通路[19]和NLPR3抗焦亡[20]等通路相關。凋亡是心肌細胞死亡的重要途徑之一,而心肌細胞死亡是心肌肥厚發展為心力衰竭的重要事件,提示抑制細胞凋亡對心臟保護有重要作用[21]。本研究結果表明,ALD成功誘導心肌肥厚的過程中觸發凋亡,并下調了Sirt3和PPARγ的表達,而CVB-D減輕肥厚,抑制凋亡,上調了Sirt3和PPARγ的表達,這提示Sirt3/PPARγ信號通路參與了CVB-D改善心肌肥厚和凋亡的過程。

Sirt3是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性組蛋白Ⅲ類去乙?；?參與凋亡、調控代謝和基因轉錄等多種細胞進程[22]。Sirt3信號通路與心肌肥厚的發展密切相關,在心肌肥厚中Sirt3激活有益于改善心臟功能障礙和重塑[23],敲低Sirt3促進心肌細胞凋亡和氧化應激,顯著惡化心肌纖維化和肥大[24],這表明激活Sirt3通路可能是治療心肌肥厚的潛在策略。PPARγ在治療心肌纖維、心力衰竭方面有重要意義。PPARγ的激活可以抗心肌凋亡,從而減輕心臟損傷,保護心臟;心肌細胞特異性缺乏PPARγ會導致心肌肥厚,而PPARγ的激活可以減輕肥厚[25-26]。此外,現有研究表明Sirt3通過調控PPARγ改善心功能等[26-27]。本研究發現,CVB-D通過上調Sirt3信號發揮抗肥厚和抑制凋亡的作用。

綜上所述,本研究初步證實了CVB-D對PNRCMs的保護、減輕ALD誘導的心肌肥厚和抑制凋亡作用,其機制可能與調節Sirt3/PPARγ信號通路相關,為心肌肥厚的治療提供新的理論基礎。然而,深層次的調控機制及作用位點尚待進一步研究。