miR-210通過NF-κB信號通路對胃癌細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移的影響*

魏明喬, 趙麗楠, 吳一辰, 王拓, 李樹敏

(赤峰學院附屬醫院 檢驗科, 內蒙古 赤峰 024000)

胃癌是全球范圍內發病率和病死率均較高的疾病,目前臨床中對胃癌患者的治療主要為手術聯合放化療和藥物治療,但因胃癌患者早期并無明顯癥狀,多數患者確診時已經為中晚期,因此臨床治療的總體預后較差,總體生存率也較低[1-2]。近年來隨著分子生物學的不斷發展,尋找有效信號通路干預已經成為臨床治療胃癌的熱點,以期能為今后胃癌防治提供新方向[3]。核轉錄因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一種特定多效轉錄因子,已有研究指出NF-κB信號通路激活可造成下游效應因子轉錄,促進細胞增殖和血管形成,參與到機體炎性反應中,促進胃癌的發生發展[4-5]。已經明確NF-κB在多數腫瘤中為活化狀態,可促進腫瘤的發生和進展,也能夠在一定程度上發揮抗腫瘤作用,因此臨床中調整NF-κB信號通路有望成為臨床防治胃癌的有效方法[6]。微小RNA(microRNA,miRNA)為長度18～22個核苷酸的內源性非編碼RNA,其可與相關靶mRNA相互作用,進而影響mRNA的轉錄過程以調節相關基因表達[7]。近年來已有研究指出miRNA在細胞增殖、侵襲、轉移、凋亡及存活中均有重要作用,如miR-210對結腸直腸癌、膀胱癌、乳腺癌等均有促進作用,且該過程與NF-κB信號通路密切相關[8]。但臨床中尚未明確miR-210在MGC803胃癌細胞中的表達情況,因此本研究分析了miR-210通過NF-κB信號通路參與胃癌發生發展的免疫調控作用,以期能為今后臨床治療提供指導?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 由北京協和細胞資源中心購入MGC803胃癌細胞以及正常的胃黏膜上皮細胞。

1.1.2主要儀器及試劑 胎牛血清(美國Gibco公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司);miR-210 inhibitor及inhibitor control(上海皓元生物醫藥科技有限公司);Trizol試劑和Lipofectamine 2000試劑(賽默飛世爾科技有限公司);CKK-8(日本同仁公司);Transwell小室(美國Coring公司);熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)測定試劑盒、逆轉錄試劑盒和AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡測定試劑盒(日本TaKaRa公司);電化學發光(ECL)試劑(碧云天生物科技研究所);IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB抗體(美國CST公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養和轉染[7]胃黏膜上皮細胞采用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。每周2～3次更換新鮮培養基,在密度達到80%時傳代后使用。將MGC803胃癌細胞置入含有10%胎牛血清的改良Eagle培養基(dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco,DMEM)培養基內培養,分別加入100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素,然后放置在含有5%CO2的37 ℃、95%相對濕度培養箱內培養,直至細胞貼壁生長密度超過80%時,加入0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。將對數生長期的MGC803胃癌細胞在6孔板上接種,每孔接種2×105個細胞,置入培養箱內常規培養,當細胞達到50%融合時,依據Lipofectamine 2000試劑說明書轉染miR-210 inhibitor及miR-210 inhibitor control,并將細胞分為空白對照組、陰性對照組(miR-210 inhibitor control)及實驗組(miR-210 inhibitor),將各組細胞置入37 ℃培養箱內繼續培養72 h。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-210表達[7]Trizol法提取對數生長期的MGC803胃癌細胞中總RNA,使用逆轉錄試劑盒合成cDNA,以其為模板,行熒光定量PCR試劑盒擴增,條件為:94 ℃預變性3 min,94 ℃ 15 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s,共40個循環。使用定量2-ΔΔCt法計算miR-210相對表達水平。

1.2.3CCK-8實驗檢測細胞增殖[7]將轉染后MGC803胃癌細胞接種至96孔板內,每孔接種5×103個細胞,設置3個復孔,細胞貼壁生長后,分別在24、48及72 h時每孔內均緩慢加入CCK-8溶液10 μL,置入37 ℃培養箱內孵育4 h,使用酶標儀測定450 nm波長處的OD值,重復3次,繪制生長曲線。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲[7]各組細胞轉染后的MGC803胃癌細胞均加入0.25%胰蛋白酶消化,使用Eagle培養基培養液懸浮和調整細胞濃度為1×108個/L。Transwell小室的上室內加入100 μL細胞懸液,下室內加入含有10%胎牛血清的DMEM培養液500 μL,置入37 ℃培養箱內培養48 h。取出Transwell小室,0.1%結晶紫染色20 min、PBS洗滌、風干后隨機選取5個視野觀察記錄,重復3次。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移 將轉染后的MGC803胃癌細胞接種至6孔板內,每孔接種1×106個細胞,置入37 ℃培養箱內培養細胞至貼壁單層生長,使用無菌移液槍對6孔板表面做垂直直線劃痕,PBS洗滌后更換培養液,培養48 h,均設置3個復孔,使用顯微鏡觀察細胞遷移個數,重復3次。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 將轉染后培養72 h的MGC803胃癌細胞使用預冷PBS洗滌2次,離心收集1×106個細胞,加入100 μL結合緩沖液重懸細胞,然后加入5 μL的FITC-Annexin V溶液孵育15 min,再加入5 μL的PI染液,混勻避光反應15 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,重復3次。

1.2.7Western blot檢測IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB水平 取對數生長期MGC803胃癌細胞的蛋白,加入適量RIPA裂解液于冰上裂解30 min,置于4 ℃下12 000r/min離心30 min,取上清液,加入等量總蛋白上樣,以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白分離后電轉至PVDF膜上,置入含5%脫脂奶粉的封閉液內封阻1 h,分別加入一抗(1∶500)后置于4 ℃下過夜雜交,PBST洗滌3次,10 min/次,然后加入HRP標記的二抗(1∶2 000),室溫下雜交2 h,PBST洗滌3次,10 min/次,加ECL試劑顯影,以β-actin作為內參照,使用Image J軟件分析蛋白表達情況,重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 正常胃黏膜上皮細胞與胃癌細胞中miR-210表達水平

與正常胃黏膜上皮細胞相比,MGC803胃癌細胞中miR-210水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與正常胃黏膜上皮細胞比,P<0.05。

2.2 各組miR-210轉染效率

與空白對照組、陰性對照組細胞相比,實驗組細胞中miR-210表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與空白對照組比,P<0.05;(2)與陰性對照組相比,P<0.05。

2.3 各組細胞增殖能力的比較

與空白對照組、陰性對照組相比,實驗組細胞的增殖能力降低,差異有統計學意義(P<0.05),空白對照組和陰性對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。 見圖3。

注：(1)與空白對照組比,P<0.05;(2)與陰性對照組比,P<0.05。

2.4 各組細胞侵襲能力的比較

與空白對照組、陰性對照組相比,實驗組轉染后48 h的細胞侵襲個數減少,差異有統計學意義(P<0.05 ),空白對照組和陰性對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4和表1。

表1 各組細胞侵襲能力的比較Tab.1 Comparison of cell invasion ability among three groups

圖4 各組細胞侵襲侵襲能力(Tranwell,×100)Fig.4 Comparison of cell invasion ability among three groups(Tranwell,×100)

2.5 各組細胞遷移情況比較

與空白對照組、陰性對照組相比,實驗組劃痕的距離變化明顯,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5和表2。

表2 各組細胞遷移情況的比較Tab.2 Comparison of cell migration among three groups

圖5 各組細胞劃痕試驗結果Fig.5 Result of cell scratch assay in three groups

2.6 各組細胞凋亡情況比較

與空白對照組、陰性對照組相比,實驗組細胞凋亡率升高,差異有統計學意義(P<0.05),空白對照組和陰性對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6和表3。

表3 各組細胞凋亡能力的比較Tab.3 Comparison of apoptosis ability in each group

圖6 各組細胞凋亡能力的比較Fig.6 Comparison of apoptosis ability among three groups

2.7 各組細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平的比較

如圖7,與空白對照組、陰性對照組相比,實驗組細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平均降低,差異具有統計學意義(P<0.05),空白對照組和陰性對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。

注：A為蛋白表達條帶圖,B為蛋白表達水平;(1)與空白對照組比,P<0.05;(2)與陰性對照組比,P<0.05。

3 討論

近年來雖然對胃癌患者的診斷、手術治療和靶向治療等方面均有明顯進展,但由于胃癌的發病分子機制尚不明確,因此雖然部分患者可獲得及時合理的治療,仍然無法獲得較佳的預后[9]。有研究指出[10],miRNA表達異常對腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移均有一定作用,因此深入探究miRNA的生物學功能對惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療具有積極意義。既往有研究表明[11],人類多種腫瘤內miR-210均呈現高表達,其能夠靶向調控基因表達或信號通路活化,是臨床已經明確的致癌基因之一。Liu等[12]在研究中指出,骨肉瘤組織中miR-210表達明顯高于正常組織,且miR-210可促進骨肉瘤細胞的侵襲和遷移。Luan等[13]也指出,前列腺組織中miR-210表達水平高于癌旁組織,其可通過下調BNIP3表達而抑制前列腺癌細胞凋亡。同時臨床中也有文獻指出miR-210的高表達與乳腺癌、腎癌、多發性骨髓瘤等腫瘤淋巴結轉移、TNM分期、不良預后等均存在相關性[14-15]。因此積極明確miR-210在胃癌發生發展中的作用,對改善患者預后有重要意義。

miRNA可對基因內源性非編碼RNA進行調控,且miRNA在腫瘤的發病機理中有重要作用,miRNA表達譜可作為臨床診斷、預后、疾病管理的潛在生物標志[16]。因此本研究中下調miR-210后細胞增殖能力降低,細胞遷移、侵襲率降低,而細胞凋亡率升高,同時細胞內p-IκBα、p-NF-κB水平均降低,提示p-IκBα、p-NF-κB水平均降低,提示miR-210可能通過激活NF-κB信號通路而調控了某些相關蛋白表達,進而促進了細胞凋亡。本研究結果與既往研究一致,抑制NF-κB信號通路可抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移,進而促進細胞凋亡[17]。由于NF-κB可以IκB相結合形成復合體,進而在細胞質內以無活性形式存在,因此當細胞遭受外界刺激后,IκB發生磷酸化而暴露NF-κB核定位位點,進而轉移至細胞核內,對相關基因的轉錄和表達過程進行調控,達到調控細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的效果[18]。而miR-210作為缺氧特異性microRNA,無論是在病理性還是生理性的低氧環境下,其均會呈現高表達。因此當胃癌患者發病后體內miR-210表達也會升高,此時miR-210可通過靶向基因SDHD激活低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF-1),而HIF-1激活上調后又會促進miR-210表達變化,進而影響腫瘤血管生成過程,這種作用形成惡性循環[19]。

綜上所述,MGC803胃癌細胞內miR-210水平明顯升高,下調miR-210可通過抑制NF-κB信號通路抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移,促進胃癌細胞凋亡。提示通過抑制miR-210表達可形成一個協同或輔助作用因子而影響腫瘤的生長和發展,為開發胃癌抗血管生成藥物提供了理論基礎。