先天性馬蹄內翻足的遺傳相關基因研究進展*

張旭升，周明旺，柳海平，高向明

（1.甘肅中醫藥大學 中醫臨床學院，甘肅 蘭州 730000 ；2.甘肅省中醫院 骨科，甘肅 蘭州 730050）

先天性馬蹄內翻足是小兒骨關節結構畸形中最常見的一種先天性足畸形，如果不及時治療，將持續到成年期，導致行動不便和生活質量下降；其特征是后足內翻、前足內收、踝部馬蹄和高弓足，較難矯正[1]，發病率為1‰～4‰，男女比例為2.5∶1.0，雙側較單側多發[2]。目前，先天性馬蹄內翻足的病因尚未明晰，但已知其涉及遺傳因素，是一種多因素和復雜的疾病，與許多未知的遺傳、社會人口和環境危險因素有關。研究表明，基因表達或突變可能在先天性馬蹄內翻足的發生、發展中發揮重要作用，其家族史會增加個體出生時患該病的風險[3]。父母雙方若均患有馬蹄內翻足，則其子女患有馬蹄內翻足的概率為10%～20%[4]。此外，遺傳流行病學調查結果表明孕期吸煙是發生先天性馬蹄內翻足的重要危險環境因素之一[5]。先天性馬蹄內翻足的遺傳性質并不遵循典型的孟德爾遺傳模式[6]，所以由單個基因引起的可能性低，而是多基因和/或基于復雜遺傳模式的多因素影響。因此，探究先天性馬蹄內翻足的遺傳基因對該病的臨床預防及治療有重大指導意義，本文就先天性馬蹄內翻足的遺傳相關基因研究進展作一綜述。

1 遺傳因素

遺傳學在先天性馬蹄內翻足的發展中起著至關重要的作用，研究表明24%～50%的患者有先天性馬蹄內翻足家族史，且同卵雙胞胎發生先天性馬蹄內翻足的一致性為33%，異卵雙胞胎則為3%[7]，說明遺傳因素對該病具有顯著影響。

先天性馬蹄內翻足是一種多因素疾病且具有高度異質性和復雜性。相光華等[8]研究了67例先天性馬蹄內翻足，發現有2例染色體異常，行羊水及臍帶血穿刺檢查，結果提示XYY及2p12位置發生缺失；CHEN等[9]采用隊列、病例對照和隨機試驗分析總結了自1967年以來關于馬蹄內翻足的42項研究，分析臨床的危險因素，結果表明，母親和父親吸煙、母親體質量指數＞30 kg/m2和選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑藥物可增加先天性馬蹄內翻足的患病概率；另外，外界因素可影響胎兒足在子宮內的位置，導致位置性馬蹄內翻足，如妊娠15周前羊膜穿刺術、羊膜帶順序、羊水過少或多胎妊娠[10]；ARMIN等[2]的研究指出，大多數在新生兒期確診了先天性馬蹄內翻足的患兒是臀位分娩，表明胎兒分娩時的體位也對馬蹄內翻足有一定的影響。

先天性馬蹄內翻足的發病機制主要是遺傳因素和環境因素的共同作用，而其中遺傳因素又占了很大一部分比重。最近的研究報告顯示，先天性馬蹄內翻足的發病機制與攜帶同源盒基因（homeobox gene, HOX）家族、膠原家族基因、T-box（TBX）家族基因、肌肉收縮基因的變化密切相關，不同的基因多態性可導致先天性馬蹄內翻足的易感和不易感，而多個基因之間可能存在協同效應以及共同參與發病過程[11]，具體見表1。

表1 影響先天性馬蹄內翻足的相關基因

2 HOX家族基因

HOX家族基因與肢體軸向骨骼和四肢的正常生長發育密切相關，因此HOX家族基因是先天性馬蹄內翻足發病機制的主要候選基因。HOX家族基因是一組高度保守的轉錄因子，最初被發現于果蠅體內，在果蠅胚胎的前后軸發育中起著至關重要的作用，其缺失、突變或者異位表達均可以引起果蠅身體的同源異型轉化[12]，進而影響正常的胚胎發育，最終導致肢體畸形。隨著人們對HOX基因的深入研究，確定人類有39個HOX基因，分為HOXA、HOXB、HOXC、HOXD 4個簇。在HOX基因家族中，HOXA和HOXD在調節肢體形成中起重要作用，HOXB和HOXC的缺失不會誘發肢體異常[13]，因此，HOXA和HOXD在脊椎動物肢體發育中都起著不可或缺的作用，其缺失、變異會導致先天性畸形[14]，包括馬蹄內翻足。

胎兒母親與胎兒父親的HOXA9基因表達模式存在顯著差異，WANG等[15]從患先天性馬蹄內翻足母親的胎兒羊水細胞中獲得了一個人的全基因組，同時胎兒父親被臨床診斷為雙側馬蹄內翻足，并發現胎兒與父親均存在rs3801776變異，表明HOXA9變異可能增加了先天性馬蹄內翻足發生的概率，在病因學中起到重要的作用。WANG[16]通過蛋白質印跡分析發現，HOX在先天性馬蹄內翻足患者的肌肉組織中表達升高，并且在先天性馬蹄內翻足患者的肌肉組織樣本中檢測到HOXD10 mRNA表達水平的變化，表明HOXD10表達上調的突變可能會造成馬蹄內翻足。

HOXD10表達的變化導致5'HOXC微缺失時出現下肢表型，說明5'HOXC微缺失的鑒定體現了轉錄調節因子在嚴重下肢畸形病因學中的重要性。HOXC缺失患者的肌肉體積一致減少，并且5'HOXC基因和上游調控區域的缺失會影響下游基因的表達水平，因此后肢轉錄調節因子可能是馬蹄內翻足的重要影響因素[17]。LI等[18]研究表明，HOXA9基因在馬蹄內翻足的發病機制中起到了重要作用，HOXA9基因的多態性位點rs3801776突變可增加先天性馬蹄內翻足的患病風險。因此，可通過HOXA9基因啟動子的相關位點遺傳多態性分析對中國馬蹄內翻足患兒進行篩查。

先天性馬蹄內翻足模型大鼠中GLI3 mRNA和蛋白表達增加，這可能意味著HOXD13是GLI3的轉錄因子。HOXD13低表達可能導致肢體形成過程中GLI3表達升高，這可能在先天性馬蹄內翻足發病機制中起關鍵作用[19]。HONG等[20]通過逆轉錄聚合酶鏈反應、實時熒光定量聚合酶鏈反應和蛋白質印跡法檢測HOXD9 mRNA和蛋白表達，發現全反式維甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）使大鼠胚胎后肢芽間充質細胞（rat embryo hindlimb bud mesenchymal cell, rEHBMC）中HOXD9的表達降低。ATRA是現代實驗胚胎學中最早顯示出對肢體發育產生深遠影響的分子之一，通過下調HOXD9的表達來抑制rEHBMC的軟骨生成，這種效應可能通過下調HOXD9的表達來抑制軟骨的生成參與胚胎肢體發育，從而導致先天性馬蹄內翻足。綜上所述，HOX家族中的HOXA9、HOXD10、HOXD9是先天性馬蹄內翻足的易感基因，可以檢測這些基因以期更加準確地了解先天性馬蹄內翻足的發病機制。

3 膠原家族基因

膠原蛋白是哺乳動物中最豐富的蛋白質，其家族由28個成員組成，至少包含一個三螺旋體域。許多疾病是由編碼膠原α鏈的基因突變引起的，突變通過減少分泌膠原蛋白的數量來影響細胞外基質（extra cellular matrix, ECM），通過分泌突變膠原蛋白或誘導內質網應激和展開的超分子組裝蛋白質反應，由于編碼膠原蛋白的基因突變而致患先天性馬蹄內翻足。其相關遺傳學研究的焦點是COL9A1和COL1A2基因，近年來對COL1A1的研究也不斷增多。Ⅰ型膠原是骨、韌帶和肌腱等間質組織的主要組成成分，其由兩條α1鏈及一條α2鏈組成，α1鏈由COL1A1基因負責編碼，α2鏈由COL1A2基因編碼[21]。COL9A1基因編碼Ⅸ型膠原的α1鏈，Ⅸ型膠原是透明軟骨中的主要成分[22]。

HUANG等[23]在一例患者中檢測到纖維軟骨標記基因COL1A1中c.3407 G＞C的突變，生物信息學軟件預測這種錯義突變會破壞蛋白質結構和功能，說明COL1A1的變異可能導致各種疾病的發生，包括先天性馬蹄內翻足。WANG等[24]通過mRNA測序鑒定先天性馬蹄內翻足患兒與正?；純旱牟町惐磉_基因，發現COL1A2基因上調，并通過蛋白質印跡和實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測發現COL1A2的表達增強，因此，COL1A2的高表達可能在先天性馬蹄內翻足病理變化的調控中發揮潛在的重要作用。而COL9A1序列變異也可導致生長發育的異常，ZHAO等[25]確定了COL9A1 rs6455357與母親飲酒之間的基因環境相互作用信號，COL9A1單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）的次要等位基因（A等位基因）與母親飲酒的患者中先天性馬蹄內翻足風險增加相關，結果表明COL9A1基因的遺傳多態性和母親飲酒與先天性馬蹄內翻足的易感性。王正東等[26]采用免疫熒光染色及免疫組織化學染色發現，先天性馬蹄內翻足模型大鼠足踝部組織中COL9A1蛋白表達高于對照組，證明先天性馬蹄內翻足畸形的產生可能與COL9A1基因在足踝部組織的高表達有關。RAIKWAR等[27]分析了COL9A1基因在先天性馬蹄內翻足患者及其母親中的表達，發現位于COL9A1基因編碼區的SNP位點rs1135056在G等位基因的頻率高于對照組；與對照組相比，AA基因型頻率降低，AG、GG基因型頻率增高。因此，COL9A1基因高水平表達，rs1135056多態位點G等位基因與先天性馬蹄內翻足的發生相關。

上述研究表明COL1A1基因的變異、COL1A2和COL9A1基因的高表達會增加先天性馬蹄內翻足的致病概率。因此，建議今后應繼續對先天性馬蹄內翻足候選基因進行多態性分析，以發現新的先天性馬蹄內翻足易感基因。

4 TBX基因

TBX家族包含在胚胎發生和形態發生中起關鍵作用的轉錄因子，其家族成員是具有高度保守的DNA結合結構域的轉錄因子，許多人類先天性發育綜合征與突變的TBX基因有關[28]。TBX3和TBX4是脊椎動物肢體發育的重要調控基因，其作用與肢體的正常生長密切相關[29]；另外，遺傳學研究發現PITX1變體與人類和小鼠的先天性馬蹄內翻足表型有關，PITX1是后肢形態發生所必需的同源盒轉錄因子，PITX1缺失或錯義變異會導致馬蹄內翻足的發生[30]。

TBX3蛋白是TBX家族的一種轉錄抑制因子，在胚胎發育時期對四肢的發育起著重要作用，該基因的突變會影響肢體發育。任舒月等[31]通過在胚胎肢體發育調控相關基因Tbx3所在的染色體9p13、12q24區域內，選擇2個微衛星DNA標記D9S319和D12S378，應用聚合酶鏈反應及放射自顯影技術，證實先天性馬蹄內翻足與D12S378遺傳標記位點的第3個等位基因存在傳遞不平衡，提示TBX3是先天性馬蹄內翻足易感基因。TBX4是TBX轉錄因子家族成員之一，在胚胎后肢中特異性表達。研究表明，過表達的TBX4野生型和突變體在細胞核中均有均勻表達，這表明這些突變不會改變TBX4向細胞核的易位，同時使用過表達TBX4的間充質干細胞進行了染色質免疫沉淀測定，結果表明TBX4突變體對FGF10啟動子的異常生物過程，可引起下肢骨骼發育異常[32]；雖然沒有直接的證據證明TBX4的變異與馬蹄內翻相關，但TBX4作為后肢特異性表達的轉錄因子之一并且其變異可引起下肢發育異常，因此TBX4可作為下一步研究的一個目的基因，可通過全基因組關聯分析以期證明TBX4與先天性馬蹄內翻足的相關性。PITX1-TBX4通路負責早期肢體發育，研究表明，編碼轉錄因子PITX1和TBX4的基因中的突變導致人類和小鼠的下肢肌肉組織和馬蹄內翻足表型的減少[33-34]。PITX1是與肢體發育相關的轉錄因子，其缺失或變異可引起一系列下肢畸形。ROUCO等[35]通過結合單細胞轉錄組學和胚胎內細胞示蹤方法，觀察到PITX1低表達細胞的比例增加而高表達細胞的比例減少，并且PITX1低表達細胞的比例增加可導致馬蹄內翻足表型。因此，先天性馬蹄內翻足的發生可能與TBX3、TBX4和PITX1密切相關，今后應繼續從這方面進行全基因組的分析，以期對馬蹄內翻足的發病機制有更深的認識。

5 肌肉收縮基因

一些涉及遠端關節彎曲癥（distal arthrogryposis）病因學的肌肉攣縮基因被認為是馬蹄內翻足的候選基因，包括TNNI2、TNNT3和TPM1[36]。TPM1是原肌球蛋白家族的成員，包括參與橫紋肌和平滑肌收縮以及非肌肉細胞的細胞骨架的肌動蛋白結合蛋白。研究表明編碼骨骼肌纖維收縮蛋白的基因在先天性馬蹄內翻足中導致肌肉生長障礙而引起的肌肉失衡，先天性馬蹄內翻足患者在出生時表現出臨床上明顯的小腿肌肉改變，通常在治療后恢復[37]，這表明由于基因突變致異常纖維以遲緩的速度生長，無法跟上骨骼結構的生長，最終處于緊張狀態，加之張力可能是產生馬蹄內翻足的變形力。一些調節肌肉生長的生長因子減少，而抑制成肌細胞增殖和分化的肌肉生長抑制素存在于先天性馬蹄內翻足患者的比目魚-跟腱連接處，先天缺陷不均勻地影響腿部間的肌肉，可能導致肌肉失衡，進而導致胎兒發育過程中的馬蹄內翻足畸形[38]。

肌鈣蛋白（Troponin, Tn）是調節橫紋肌收縮的關鍵蛋白復合物，由Tn-I、Tn-T和Tn-C 3個亞基組成，Tn-I抑制肌動球蛋白ATP酶，Tn-T結合原肌球蛋白和Tn-C[39]，Tn-C結合鈣并克服肌鈣蛋白復合物對肌動蛋白絲的抑制作用，從而限制肌肉收縮和足部運動，由于骨骼肌收縮功能障礙，當關節發生變形時，肢體將失去支持而逐漸發生下垂或屈曲畸形，進一步的受限可能會導致先天性馬蹄內翻足。HUANG等[23]在研究中檢測到TNNI2和TNNT3基因的突變，其中1例患者在連續2次懷孕的24孕周時通過超聲觀察發現胎兒足部的姿勢異常，并通過臍帶穿刺術進行了遺傳學診斷，結果顯示兩次妊娠的胎兒都攜帶TNNI2基因的突變。另1例患者也表現出相同的表型，在第25周進行羊膜腔穿刺術時，發現TNNT3基因中新發變異。因此可認為編碼骨骼肌纖維收縮蛋白的基因（TNNI2、TNNT3）變異在先天性馬蹄內翻足的病因發生了一定的作用。LI等[40]對430例患有先天性馬蹄內翻足的兒童和891例沒有患先天性馬蹄內翻足的兒童進行病例對照研究，探討了3個TPM基因多態性（TPM1/rs4075583 G＞A、TPM2/rs2145925 C＞T和TPM2/rs2025126 G＞A）與先天性馬蹄內翻足風險的潛在相關性，結果表明TPM1 rs4075583 G＞ A多態性與中國南方人群的先天性馬蹄內翻足風險相關。這可能是由于先天性馬蹄內翻足患兒可能存在TPM1多態性異常表達，進而導致先天性馬蹄內翻足的發生。

綜上所述，影響肌肉發育的TNNI2、TNNT3和TPM1基因變異可能是先天性馬蹄內翻足發病的危險因素之一，因此可認為編碼骨骼肌纖維收縮蛋白的基因變異為先天性馬蹄內翻足的發病機制提供了有力的證據。

6 其他基因/因素

N-乙酰轉移酶（N-acetyltransferase, NAT）基因的多態性可以使香煙中的自由基乙?；钚越档?，而先天性馬蹄內翻足與吸煙引起的DNA氧化損傷有關，這表明芳香胺的生物轉化和DNA加合物的積累不足，導致潛在的毒性作用和先天性馬蹄內翻足的發展。因此NAT被認為是導致先天性馬蹄內翻足發病的候選基因[5]。PANDEY等[41]通過聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）對亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetra hydro folate reductase, MTHFR）基因進行了SNP分析，發現MTHFR基因變異增加了先天性馬蹄內翻足發生的概率，變異位點為C677T，同時發現該基因參與調節細胞周期中的細胞分裂和生物合成，因此可認為該基因變異可能與先天性馬蹄內翻足發生相關。徐晨晨等[42]通過構建先天性馬蹄內翻足樣品的基因表達譜，發現分泌磷酸蛋白1（secreted phosphoprotein 1, SPP1）和核糖體蛋白S27（ribosomal protein S27, RPS27）在試驗組和對照組中基因相對表達量差異明顯，表明SPP1和RPS27可能與先天性馬蹄內翻足的發病相關。SPP1的高表達可增加先天性馬蹄內翻足的發病概率[43]，而SPP1編碼骨橋蛋白的蛋白質，骨橋蛋白是位于骨內的非膠原細胞外凝集糖蛋白之一，可以調節人臍靜脈內皮細胞的增殖、運動、遷移和血管形成，然后可能導致先天性馬蹄內翻足的發生。張真翊等[44]研究發現，實驗組足踝部組織低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1, HIF-1）表達下調，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、跨膜受體蛋白（Notch-1）的表達減少，推測HIF-VEGFNotch信號通路可能與馬蹄內翻足畸形的發生相關。李汾杰等[45]研究發現先天性馬蹄內翻足大鼠的足踝部組織中Sox9高表達受Wnt/β-catenin信號通路調控，而且該通路參與先天性馬蹄內翻足畸形的形成。因此NAT、MTHFR、SPP1基因的變異或者高表達可引起先天性馬蹄內翻足的發生，另外HIFVEGF-Notch信號通路與Wnt/β-catenin信號通路也參與先天性馬蹄內翻足畸形足的形成。

7 總結與展望

綜上所述，先天性馬蹄內翻足在遺傳和基因方面的病因是十分復雜的，其遺傳因素與環境因素密切相關，隨著基因組學、蛋白質組學和其他組學技術的應用，馬蹄內翻足的遺傳學機制正在逐步得到證實，在人類和動物中已經發現了多種相關易感基因，包括HOX家族基因（HOXA、HOXD）、膠原家族基因（COL1A1、COL9A1）、TBX基因（TBX3、TBX4、PITX1）等，還有由影響肌肉收縮的基因（TNNI2、TNNT3、TPM1）的突變和NAT、MTHFR、SPP1基因的變異引起的肢體缺陷，此外HIF-VEGF-Notch與Wnt/β-catenin信號通路也與先天性馬蹄內翻足病因有關。這些易感基因與相關的危險因素在不同體質的人群中表現出不同的致病機制，但由于先天性馬蹄內翻足發病機制復雜，臨床表現多種多樣，給該病診斷及治療帶來一定的困難?？傊?，由于先天性馬蹄內翻足畸形足是一種復雜的畸形，其發病機制復雜，涉及到多個易感基因，因此，研究先天性馬蹄內翻足畸形足的發病機制對預防其發生及治療有重要意義。今后在遺傳基因方面應繼續加深研究，應用全基因組學技術以及不斷進步的科技手段，以期更加明確先天性馬蹄內翻足的易感基因與生物分子遺傳學機制，為揭示病因、預防和治療疾病提供理論依據。