番茄SlMYB48基因生物信息學及表達分析

劉佳鳳 郭曉青 王桂強 王虹云 朱桐 曹守軍 姚建剛 張麗莉 張瑞清 趙婧 李濤

收稿日期：2023-10-10；修回日期：2023-12-20

基金項目：煙臺市科技計劃項目（2022XCZX091）；國家現代農業產業技術體系專項（CARS-23-G11）；重慶市巫山縣科技項目（wskjdxbxm2023004）；國家自然科學基金面上項目（32372737）；西南作物基因資源發掘與利用國家重點實驗室開放課題（SKL-KF202224）

作者簡介：劉佳鳳，女，在讀碩士研究生，研究方向為番茄抗逆基因的驗證。E-mail：19558916823@163.com

通信作者：李? 濤，男，正高級農藝師，研究方向為蔬菜育種及分子生物學。E-mail：ytnkyscs@163.com

DOI：10.16861/j.cnki.zggc.202423.0652

摘??? 要：MYB轉錄因子是植物轉錄因子家族中數量最多、用途最廣的成員之一，為挖掘更多番茄（Solanum lycopersicum）MYB轉錄因子家族成員信息，初步探究其表達模式及功能，以番茄Ailsa Craig為試材，采用RT-PCR的方法克隆SlMYB48基因，并對其進行生物信息學及表達、定位分析。結果表明，番茄SlMYB48基因的開放閱讀框（ORF）長度為708 bp，編碼235個氨基酸，在番茄的根中表達量最高，葉中次之。SlMYB48蛋白含有保守的MYB結構域，定位于細胞核中，屬于不穩定、親水性蛋白。對SlMYB48啟動子分析，發現其含有大量的逆境響應元件，qRT-PCR及RNA-seq 數據庫分析結果表明，高鹽、生物逆境脅迫條件下，SlMYB48基因表達量均隨處理時間延長而升高，干旱脅迫條件下表達量下降，推測其可能參與番茄生物及非生物逆境脅迫反應。研究結果為進一步深入探究番茄SlMYB48基因的功能及作用機制提供了參考。

關鍵詞：番茄；SlMYB48；表達分析；定位

中圖分類號：S641.2?????????? 文獻標志碼：A??????????? 文章編號：1673-2871（2024）04-027-09

Bioinformatics and expression analysis of tomato SlMYB48 gene

LIU Jiafeng1， GUO Xiaoqing2， WANG Guiqiang3， WANG Hongyun4， ZHU Tong1， CAO Shoujun4， YAO Jiangang4， ZHANG Lili4， ZHANG Ruiqing4， ZHAO Jing1， LI Tao1， 4

（1. College of Life and Science， Yantai University， Yantai 264000， Shandong， China; 2. Yantai Agricultural Technology Extension Center， Yantai 265499， Shandong， China; 3. Agricultural Comprehensive Service Center， Zhangxing Town， Zhaoyuan 265403， Shandong， China; 4. Yantai Academy of Agricultural Sciences， Yantai 264500， Shandong， China）

Abstract： MYB transcription factor is one of the most abundant and widely used members of the plant transcription factor family. In order to mine more information about MYB transcription factor family members of tomato （Solanum lycopersicum） and preliminarily explore its expression pattern and function， this study took tomato Ailsa Craig as the test material. SlMYB48 gene was cloned by RT-PCR， and its bioinformatics， expression and localization were analyzed. The results showed that the open reading frame （ORF） length of tomato SlMYB48 gene was 708 bp， encoding 235 amino acids， and the expression level was the highest in tomato roots， followed by in leaves. The SlMYB48 protein contains a conserved MYB domain， which is an unstable， hydrophilic protein located in the nucleus . SlMYB48 promoter analysis found that it contained a large number of stress response elements. The results of qRT-PCR and RNA-seq database analysis showed that the expression of SlMYB48 gene increased with the extension of treatment time under high salt and biological stress， and decreased under drought stress， suggesting that SlMYB48 gene might be involved in biological and abiotic stress response of tomato. The results of this study provide a reference for further investigation of the function and mechanism of tomato SlMYB48 gene.

Key words： Solanum lycopersicum; SlMYB48; Expression analysis; Location

番茄（Solanum lycopersicum）具有良好的口感、豐富的營養、繁多的品種以及較高的研究價值和經濟價值，成為我國乃至世界上栽培最為廣泛的蔬菜作物之一。在生物學水平上，番茄也是應用于多種學科領域、進行遺傳轉化研究的非常重要的模式植物。自然環境中的高鹽、干旱、低溫等逆境因素嚴重影響番茄的生長發育和產量，因此了解番茄在抗逆反應過程中的作用機制，進而探尋抗逆基因資源、選育番茄抗逆品種在理論和生產上具有重大意義。

MYB轉錄因子是植物轉錄因子家族中數量最多、用途最廣的成員之一[1]。MYB轉錄因子是基于編碼蛋白含有一個或多個高度保守的DNA結構域-MYB結構域，含有大約50個氨基酸殘基組成的不完全重復的R結構（R1，R2和R3）[2]。根據每個基因中R結構的數量，可分為4個亞類[3]。其中，R1/R2-MYB亞類只包含1個MYB結構域，R2R3-MYB亞類包含2個MYB結構域，R1R2R3-MYB亞類包含3個連續結構域，4R-MYB亞類包含4個MYB結構域[4-6]。

在植物中第一個被發現的MYB類基因是從單子葉植物玉米中克隆出來的ZmMYBC1基因，該基因為色素合成有關基因[7]。隨著基因組學和分子生物學的發展，越來越多的MYB家族成員被鑒定。MYB轉錄因子不僅能對激素以及干旱、高溫、高鹽等逆境脅迫作出應答[8]，而且廣泛參與植物初生和次生代謝反應[9]，并對植物的生長發育和形態建成[10]，具有重要的調控作用。MYB轉錄因子參與植物的生長發育調控，AtMYB23基因參與擬南芥根表皮發育過程中的正調控途徑[11]。植物MYB類轉錄因子在植物的代謝生理活動中也發揮作用，玉米ZmMYB028和ZmMYB073成員與苯丙烷生物合成負調控相關[12]。已有研究表明，番茄MYB類轉錄因子在響應干旱脅迫方面發揮著重要作用。在干旱脅迫處理下，SlMYB10和SlMYB14兩個基因相對表達量呈升高趨勢，將SlMYB14基因沉默后，通過對生理生化指標以及活性氧的測定，表明SlMYB14基因對番茄耐鹽性和抗旱性有重要作用[13]。沉默SlMYB71基因后，促進了番茄植株在干旱脅迫下的生長，降低了活性氧含量、相對電導率和丙二醛含量，影響葉綠素積累和脅迫基因的表達，表明SlMYB71基因在非生物脅迫方面起著負調控作用[14]。

筆者前期通過海水栽培番茄的轉錄組分析，發現隨海水濃度增加，SlMYB48表達量升高[15]。為了進一步研究SlMYB48轉錄因子在番茄生長發育以及抗逆過程中的功能和機制，利用RT-PCR方法克隆了SlMYB48基因，并對其進行生物信息學、啟動子響應元件、表達、定位等分析，以期為后續研究番茄SlMYB48基因的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用番茄品種為Ailsa Craig，種子由山東省煙臺市農業科學研究院蔬菜花卉研究所保存。試驗于2022年10月至2023年7月在山東省煙臺市農業科學研究院蔬菜花卉研究所實驗室進行。取新鮮的番茄葉片，錫箔紙包裹置于液氮中冷凍，并在-80 ℃保存，用于RNA提取。用于組織表達分析取樣的部位及時期：葉為完全展開的功能葉；莖為生長點下端第2節位莖段；根為清洗后的白色根段；花朵為開放當天的花；成熟果為紅色的正常健康果實。將番茄種子播種于20 cm×20 cm塑料盆中，栽培基質按草炭、蛭石、珍珠巖體積比2∶1∶1進行配置，在植株5葉1心期時，進行干旱脅迫和高鹽脅迫處理，將200 mL10%的聚乙二醇6000 （PEG-6000）溶液、200 mL的NaCl溶液（200 mmol·L-1）分別灌溉番茄植株，在1、6、12、24、48、72 h分別取番茄葉片，液氮冷凍，-80 ℃保存，用于逆境脅迫表達分析。亞細胞定位所用植物材料為本氏煙草（Nicotiana benthamiana L.），將煙草種子播種于7 cm×7 cm穴盤中，光周期設置為光照12 h/黑暗12 h，在溫度為（25±2） ℃光照培養箱中培養1個月，用于煙草瞬時轉化。

RNA提取試劑盒購于北京華越洋生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購于天根生化科技有限公司；高保真DNA聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒和DNA回收試劑盒購于艾科瑞生物科技有限公司。其他化學藥品購于北京聚合美生物科技有限公司。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 將番茄嫩葉用液氮研磨，按照華越洋RNA提取試劑盒操作說明提取植物組織總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，使用天根cDNA第一鏈合成試劑盒將其反轉錄獲得cDNA，然后置于-20 ℃保存，用于后續試驗。

1.2.2 番茄SlMYB48基因的克隆 從NCBI中獲得番茄MYB家族基因成員SlMYB48的序列，利用Primer 5工具設計全長引物，引物序列為F：ATGGCACAAGAAGAAATGAGAAGAG；R：TTAGCCAGCAAAGAATGTGTTATCCT，以cDNA為模板，擴增SlMB48全長序列。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸22 s，共40個循環，72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，切膠后使用華越洋DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，將擴增產物連接至pMD18-T克隆載體，連接產物轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取經PCR鑒定的陽性克隆，送樣測序。

1.2.3 SlMYB48基因生物信息學分析 在NCBI中利用Conservation Domain程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ cdd/？term=）進行基因保守結構域分析。在ProtParam網站（https：//web.expasy.org/protparam/）計算蛋白的等電點、分子質量和分子式。運用TMHMM Server v. 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白的跨膜域預測；通過SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1）預測信號肽。利用ExPasy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預測蛋白質親水疏水性。利用SOPMA網站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa _automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）預測蛋白質二級結構。利用Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）網站進行同源建模預測三級結構。在NCBI網站中利用blastn（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？ PROGRAM=blastn& PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）將SlMYB48基因與蛋白nr數據庫比對。利用DNAMAN對各物種中的MYB的氨基酸序列進行比對。使用MEGA7軟件的鄰接法構建系統進化樹。

1.2.4 SlMYB48表達模式分析 采用CTAB方法提取番茄不同組織部位RNA，并反轉錄為cDNA。通過Primer Premier 5軟件設計熒光定量PCR引物（F：ACGATACGGGTGGACTTGAC；R：ATCCTGGTTGTCCAAGCAAT，擴增片段為227 bp），選取actin為內參基因，引物序列為F：GGAATGGGACAGAAGGAT；R：CAGTCAGGAGAACAGGGT，擴增產物為183 bp，以獲得的cDNA為模板，參照iScript? gDNA Clear cDNA Synthesis Kit試劑盒（伯樂生命醫學產品上海有限公司）說明書，進行實時熒光定量PCR擴增。采用7500型實時熒光定量PCR儀（ABI，USA）進行分析，PCR反應體系為：2×qPCR Mix 10 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，cDNA單鏈模板1 μL，ddH2O 8 μL，共20 μL。PCR反應條件為：95 °C預變性5 min，95 °C變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環，60 °C 延伸 1 min。設置3次生物學重復，使用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。數據通過Excel計算并繪制柱狀圖。

利用番茄基因組數據庫（https：//solgenomics.net）查詢番茄SlMYB48基因相關表達量。在番茄基因組數據庫工具欄內進入番茄表達數據庫（TED），在表達量一欄下的RNA-seq數據庫中輸入基因ID：Solyc06g005310進行表達量查詢。選取試驗編號為D007，該基因在生物脅迫下，受細菌菌株（熒光假單胞菌、惡臭單胞菌和農桿菌）處理的多個表達量作為參考，分析SlMYB48基因在生物脅迫下的表達模式，并將SlMYB48基因數據通過Excel整理、繪制柱狀圖。

1.2.5 亞細胞定位 使用 Primer Premier 5 軟件設計引物，并且在特異性引物上添加BsaI和Eco31I酶切位點及保護堿基（F：cagtCGTCTCacaacatggcacaagaagaaatgag；R：cagtCGTCTCatacagccagcaaagaatgtgttat），按照1.2.2 PCR擴增體系對番茄葉片cDNA進行擴增，反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，51 ℃ 20 s，72 ℃ 22 s，共40個循環，72 ℃延伸5 min，采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，切膠回收目的片段。使用BsaI和Eco31I限制性內切酶，對載體和膠回收片段進行雙酶切，載體雙酶切體系如下：Nuclease-free Water 13 ?L，10×Buffer 2 ?L，BsaI/Eco31I 1 ?L，pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp 4 ?L，共20 ?L，37 ℃反應 1 h。目的基因膠回收片段酶切體系同上。按照PCR反應液純化試劑盒說明書純化酶切產物。得到純化產物后進行連接。連接體系為：Nuclease-free Water 5.5 ?L，10×Buffer 1 ?L，T4DNAligase 1 ?L，純化產物2.5 ?L，共10 ?L。將重組產物轉化到大腸桿菌DH5α細胞，菌液PCR篩選陽性克隆子進行測序，將測序正確的陽性菌落搖菌培養提取質粒。將表達載體轉入農桿菌GV3101后，將菌液涂布于卡那霉素抗性YEB 固體培養基上，挑取單克隆放入YEB液體培養基中，在28 ℃下培養2 d，離心去上清液后，用10 mmol·L-1 MgCl2（含120 μmmol·L-1 AS）重懸菌體，調節OD600至0.6左右。從煙草葉片下表皮（背面）壓迫注射菌液，弱光培養2 d。制作玻片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，同時以空載體轉化的農桿菌作為對照，重復上述操作。

2 結果與分析

2.1 SlMYB48基因的克隆

以番茄嫩葉cDNA為模板，以全長引物進行PCR擴增，獲得基因全長708 bp（圖1），編碼235個氨基酸。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 SlMYB48轉錄因子的保守結構域分析 為了分析SlMYB48蛋白保守結構域，將得到的核苷酸序列翻譯成蛋白序列后，在NCBI的功能結構域選項中進行預測。結果表明，SlMYB48基因含有典型的MYB轉錄因子家族的DNA結構域，還含有PLN03091、REB1和SANT結構域（圖2）。

2.2.2 SlMYB48編碼蛋白質的理化性質和信號肽以及編碼蛋白質產物的親水性疏水性分析 利用在線軟件Protparam分析SlMYB48蛋白質的理化性質，其分子式為C1226H1874N348O365S15，分子質量為27.8 kD，理論等電點pI為8.86。其編碼蛋白質的氨基酸組成中絲氨酸（Ser）占比最高，為9.4%，其次是賴氨酸（Lys），為8.1%，天冬酰胺（Asn）為8.1%。蛋白不穩定性指數為71.71，屬于不穩定蛋白（表1）。TMHMM在線預測該蛋白的跨膜結構，SlMYB48轉錄因子所編碼的235個氨基酸均不在跨膜區，說明SlMYB48蛋白不含跨膜結構，不屬于跨膜蛋白（圖3-A）。通過Signal IP4.0軟件分析該蛋白信號肽，結果表明SlMYB48蛋白序列無信號肽（圖3-B）。

利用ExPasy-ProtScale對SlMYB48蛋白進行親水性疏水性分析，結果如圖4所示，-3.233為最小的負值，1.556為最大的正值，負值的絕對值大于正值的絕對值，表明該蛋白為親水性蛋白。

2.2.3 SlMYB48蛋白結構分析 運用在線軟件SOPMA預測SlMYB48的二級結構，結果顯示SlMYB48蛋白中不規則卷曲含量高達49.79%，其次為α-螺旋，占36.17%，延伸鏈占7.23%，最少的是β-折疊，僅占6.81%（圖5-A）。

為了驗證筆者對SlMYB48蛋白二級結構預測的結果，利用SWISS-MODEL網站對SlMYB48的蛋白三級結構進行建模（圖5-B），從圖中可以看出，SlMYB48蛋白結構主要由無規則卷曲和螺旋結構構成，與上述的蛋白二級結構預測結果相符。

2.2.4 蛋白的同源比較及進化分析 通過NCBI中Blast檢索，將SlMYB48與蛋白nr數據庫比對，分析得知SlMYB48與其他植物的 MYB蛋白有高度的同源性（圖6），說明其蛋白的結構和功能都高度保守。結果表明，同源性最高的是潘那利番茄MYB48（XM_015222064.2），同源性達到98.07%；其次是馬鈴薯MYB48（XM_006366855.2），同源性為96.92%；野生馬鈴薯MYB48（XM_049519716.1）、窄刀薯MYB48（XM_049556356.1）、辣椒MYB48（XM_016721740.2）這3個MYB基因編碼的氨基酸序列同源性也具有較高的同源性，分別為96.72%、96.34、89.39%。

為了進一步分析SlMYB48與其他植物MYB之間的進化層面關系，在上述氨基酸多重比對的基礎上，利用MEGA 7軟件對栽培番茄（Solanum lycopersicum）、潘那利番茄（Solanum pennellii）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、野生馬鈴薯（Solanum verrucosum）、窄刀薯（Solanum stenotomum）、辣椒（Capsicum annuum）、絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）、漸狹葉煙草（Nicotiana attenuata）和林煙草（Nicotiana sylvestris）這9種植物的MYB氨基酸序列進行系統進化樹分析。通過進化樹分析（圖7）可以看出，與番茄SlMYB48蛋白親緣關系最近的是潘那利番茄，被聚為一組，其次是馬鈴薯，這與氨基酸多重比較的結果一致，不同植物中的MYB蛋白進化關系分析結果基本符合植物分類學地位，其種屬特性比較明顯，即種屬關系越近的親緣關系越近。

2.2.5 SlMYB48啟動子順式作用元件分析 利用軟件Plant CARE對SlMYB48基因啟動子序列上的順式作用元件進行預測分析，如表2所示，SlMYB48啟動子中含有大量與逆境脅迫、激素響應和光響應相關的順式作用元件，包括光響應元件GA-motif、GATA-motif、TCCC-motif、G-Box等，逆境響應元件ABRE、ARE、TCA-element等，表明SlMYB48可能參與相應生長發育與逆境脅迫響應過程。

2.3 SlMYB48基因的表達分析

2.3.1 SlMYB48基因在番茄不同組織中的表達 以番茄肌動蛋白基因 actin為內參，qRT-PCR分析結果表明，SlMYB48 基因在番茄苗的根、莖、葉和花中均有不同程度的表達，其中在根和葉中的表達量較高，在花和莖中表達量極低，在果實中幾乎不表達（圖8）。

2.3.2 非生物脅迫對SlMYB48基因表達量的影響 對鹽脅迫和干旱脅迫下SlMYB48的表達量進行分析，如圖9所示。與對照相比，高鹽脅迫處理下，6 h后SlMYB48在番茄葉片中表達量迅速上升，并在48 h達到最大值，之后略有下降，但表達量均高于對照。模擬干旱條件下，隨處理時間延長，SlMYB48表達量呈先降低后升高的變化趨勢，處理1 h，表達量約為對照的一半，12 h后明顯低于對照植株。以上結果表明SlMYB48對高鹽及干旱均產生脅迫響應。

2.3.3 生物脅迫對番茄SlMYB48基因表達量的影響 番茄葉片在經過細菌菌株（熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和根癌農桿菌）處理后，SlMYB48基因表達量均隨處理時間延長上調，其中根癌農桿菌受誘導更明顯，SlMYB48表達量在6 h后達到17.23。受熒光假單胞菌誘導較弱，說明SlMYB48可能參與番茄生物脅迫（圖10）。

2.4 SlMYB48基因的亞細胞定位

為了明確SlMYB48蛋白在細胞中的作用部位，利用農桿菌介導的瞬時轉化法，將培養好的帶有SlMYBS48與GFP融合蛋白載體的農桿菌注射到煙草葉片，培養2 d后在顯微鏡下觀察融合蛋白在煙草葉片細胞中的分布情況。以空載體注射煙草的結果作為對照。結果表明，SlMYB48蛋白定位在細胞核中，說明該蛋白主要在細胞核中表達（圖11）。

3 討論與結論

R2R3-MYB蛋白是植物特有的豐富蛋白，在植物的基因組中大約有100多個R2R3-MYB成員，參與植物生長發育、次生代謝調控、生物和非生物脅迫應答[16]。筆者通過RT-PCR技術克隆得到了全長為708 bp的番茄SlMYB48基因的目的片段，位于番茄6號染色體上。通過生物信息學分析得知，SlMYB48是一種不穩定的親水性蛋白，不含跨膜結構域和信號肽。SlMYB48蛋白編碼了235個氨基酸，對其保守結構域分析表明，SlMYB48蛋白含有2個植物MYB轉錄因子家族的特異性結構域-SANT-myb DNA結合結構域，表明SlMYB48為R2R3型MYB轉錄因子。

通過與其他植物MYB氨基酸比對分析，發現番茄SlMYB48與其他植物的MYB48氨基酸表現出了較高的同源性，其中與馬鈴薯和潘那利番茄的同源性較高，表現出較近的進化關系。已有研究表明，StMYB48-like主要參與調控花青素的合成，在植物根的生長中起重要調節作用，同時參與干旱和高鹽等非生物脅迫耐受性[17]。有研究表明，在水稻中過表達OsMYB48-1能顯著提高水稻的耐旱性和耐鹽性[18]。在擬南芥中過表達水稻ZmMYB48，發現ZmMYB48可能是通過ABA信號參與干旱脅迫響應的積極調控因子，表明不同物種的同種基因可能有相似的功能[19]，據此推測番茄SlMYB48基因可能與調控番茄植株抗逆特性有關。

筆者對番茄SlMYB48基因啟動子序列上的順式作用元件進行預測分析發現，番茄SlMYB48啟動子中含有大量與逆境脅迫、激素響應和光響應相關的順式作用元件。AtMYB48在擬南芥根中表達量最高，且與野生型相比，在H2O2介導的氧化作用下，AtMYB48敲除后植株的根長顯著減少，表明AtMYB48在根發育中具有正調控作用[20]。在筆者的研究中，不同部位表達模式分析表明，番茄SlMYB48基因在番茄根中表達量最高，這與在擬南芥中的研究結果一致，推測SlMYB48基因在番茄中也存在相似的功能，表明SlMYB48基因可能在抵抗逆境脅迫和根的生長發育中發揮重要作用。