江蘇葫蘆科作物上瓜類褪綠黃化病毒的發生及其分離物全基因組序列分析

楊柳 任春梅 陸芳 繆倩 程兆榜 季英華

摘要：為了分析瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellow virus，CCYV）在江蘇省葫蘆科作物上的分布情況、發生趨勢以及變異情況，本研究對疑似感染CCYV的葫蘆科樣本進行采集，覆蓋了江蘇省8個地區的7種常見葫蘆科作物，通過RT-PCR方法對病樣進行了分子鑒定，并對在泰州采集的黃瓜分離物CCYV-JSXH進行分段克隆與測序，拼接獲得CCYV的全基因組序列后對其進行了序列比對和進化分析。檢測結果顯示，在建湖采集的西葫蘆樣本、泰州興化和南京江寧地區采集的黃瓜樣本均有CCYV感染。序列拼接與比對結果顯示，分離物CCYV-JSXH的RNA1序列與目前已經公布的各個分離物基因組序列相似度在99.58%以上，在進化樹上與山東西葫蘆分離物聚為一支；其RNA2序列與各分離株的相似性為99.47%以上，在進化上與廣東分離物聚為一支。本研究結果表明，CCYV可能由多個途徑傳入江蘇，并已經擴大蔓延到江蘇省多個地區和多種寄主上，對該病毒的監測防控已逐漸擴大為葫蘆科作物生產中亟待解決的突出問題之一。

關鍵詞：瓜類褪綠黃化病毒；分布；分子鑒定；基因組；系統進化分析

中圖分類號：S436.429? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0036-07

收稿日期：2023-04-28

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2022YFD1401200）；江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（19）3108]。

作者簡介：楊柳（1984—），女，江蘇徐州人，博士，助理研究員，主要從事蔬菜作物病毒病研究。E-mail：suiyangy@126.com。

通信作者：季英華，研究員，主要從事蔬菜病毒病研究。E-mail：jiyinghua@jaas.ac.cn。

瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）屬于長形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）。它最早于2009年在日本甜瓜上被發現^[1]，隨后在許多國家都有報道，包括蘇丹、黎巴嫩、伊朗、希臘、土耳其、沙特阿拉伯、塞浦路斯、以色列、美國、阿爾及利亞、西班牙、韓國和印度等^[2-14]。2010年，CCYV于我國臺灣地區首次被發現^[15]，而后在山東、北京、上海、河南、湖南、廣西、乃至海南、新疆和貴州等省份逐漸被報道，并且其危害地區還在不斷擴大^[16-25]。

CCYV是煙粉虱以半持久方式進行傳播的，在自然情況下主要感染葫蘆科作物，目前已經報道的以甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆等常見作物居多，但室內試驗顯示該病毒能夠侵染19種葫蘆科作物^[1]。此外CCYV 還可以侵染本氏煙、甜菜、紫花苜蓿、曼陀羅等植物，Orfanidou等明確了13種雜草為CCYV的寄主^[6]，莊新建等報道CCYV可以感染藥用作物地黃^[26]，韋建明等報道CCYV可以感染山藥^[25]。這些結果表明，CCYV的寄主范圍也在不斷擴大。

被CCYV感染的植株在早期會出現中部或基部葉片的褪綠黃化，而后逐步向上發展逐漸蔓延至植株頂部，葉片最初呈現褪綠癥狀，隨著病情發展，葉片黃化，同時仍能看見保持綠色的葉脈等局部組織，最后導致整個植株黃化，在大田生產中嚴重影響了葫蘆科作物的產量和產品品質，已逐漸擴大為葫蘆科作物生產中亟待解決的突出問題之一^[27]。

CCYV的基因組由2條正單鏈RNA （RNA1和RNA2）組成，其中RNA1約 8 607 nt，可編碼甲基磷酸轉移酶、依賴RNA的病毒解旋酶、依賴 RNA 的 RNA 聚合酶，P6-1蛋白和P22 蛋白；RNA2約 8 041 nt，可編碼外殼蛋白、小外殼蛋白、70 ku 類熱激蛋白、P59蛋白、P26蛋白、P9蛋白、P6-2蛋白和P4.9蛋白。在病毒的侵染、復制和傳播過程中，這些蛋白都發揮了重要的功能^[23]。

江蘇地區的設施蔬菜和露地蔬菜在我國蔬菜生產中均占有重要地位，但病毒病的發生也一直威脅著省內蔬菜產業的發展，根據目前已有報道，在我國許多葫蘆科作物種植區都出現了CCYV的感染，但在江蘇地區尚未有針對性的報道。筆者所在課題組于2022年在江蘇省內針對葫蘆科作物CCYV感染進行了普查，并對在主要感染區（泰州興化）采集的CCYV分離物進行了全基因組序列分析。

1? 材料與方法

1.1? 病原材料

2022年6—11月在江蘇省多個葫蘆科作物生產地采集到各種葫蘆科作物疑似病毒病感染樣品，主要為植株葉片，少部分為果實，癥狀表現為斑駁、褪綠、黃化、皺縮、畸形等。需要保存的樣品經液氮速凍存于-80 ℃冰箱。

1.2? RNA提取和cDNA的合成

取0.5 g病葉樣品，如果是病果則切取果皮部分，于液氮中充分研磨成粉末，使用多糖多酚植物RNA試劑盒（上海浦迪生物科技有限公司）按說明書步驟操作提取RNA。而后取2 μL RNA使用HiScriptⅡ Q RT SuperMix試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）按說明書步驟反轉錄成cDNA，用于PCR和克隆。

1.3? PCR檢測分析

采用引物CCYV-dtF （5′-AGAACATGATCAAGTCGTGAGTC-3′）和CCYV-dtR （5′-GGTAGGAATGAACTCAGTGTCVG-3′）對反轉錄后的病樣cDNA進行PCR擴增。擴增體系為2×Taq Master mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）12.5 μL，前后引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH₂O補足至 25 μL。反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30個循環后再 72 ℃ 延伸5 min。若電泳后在約792 bp處出現目的條帶則將PCR產物送至南京擎科生物科技有限公司進行序列測定。

1.4? CCYV基因組序列克隆與測序

根據干射香等設計的引物^[28]分段擴增并通過拼接獲得CCYV1和CCYV2序列全長。擴增體系：2×phanta PCR mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）25 μL，前后引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH₂O補至50 μL。反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min 30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切取凝膠上的目的條帶，使用Axygen膠回收試劑盒（愛思進生物技術有限公司）根據說明書步驟進行回收?；厥债a物連接至pEASY-Blunt載體（北京全式金生物技術有限公司），轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α（南京擎科生物科技有限公司），挑取單克隆經PCR篩選后送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.5? 序列比對分析

將測序測得的所有序列利用Invitrogen軟件里的ContigExpress功能進行拼接獲得CCYV1和CCYV2全長序列。比對分析使用NCBI網站的BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和ClustalX軟件，聚類分析和進化樹的構建使用MEGA6軟件。

2? 結果與分析

2.1? 江蘇省CCYV的發生情況

本研究于2022年在江蘇省內共采集樣本246份，分別來自于8個地區的7種常見葫蘆科作物（表1），寄主植物樣品大多數來源于種植面積較大的葫蘆科作物，如西瓜、甜瓜、南瓜和黃瓜。對所采樣品提取RNA，經過RT-PCR檢測后發現在建湖、興化、南京采集的樣品中均檢測出了CCYV，其他地區樣品中均未檢出（圖1）。在南京江寧采集的21份甜瓜中有3份檢出CCYV，13份黃瓜樣品中有7份檢出，總檢出率為29.4%。在興化采集的30份樣品中黃瓜占29份，絲瓜1份，其中包括絲瓜在內的26份樣品檢出CCYV，檢出率為86.7%。在建湖采集的9份西葫蘆樣品中全部檢出CCYV。在全部246份樣品中，CCYV總檢出率為18.3%。

2.2? CCYV泰州興化分離物基因組特征分析

采用分段克隆拼接的策略，對CCYV泰州興化

黃瓜分離物CCYV-JSXH的每條鏈分別分4段進行克隆，通過軟件拼接獲得CCYV-JSXH全基因組序列。對CCYV-JSXH序列信息進行分析比對發現，該分離物的RNA1序列全長共計8 607個堿基，包含4個開放閱讀框（ORF），其中74～6 034位堿基為ORF1a，編碼1個由1 987個氨基酸組成、分子量約226.5 ku的蛋白，6 036～7 553位堿基為ORF1b，編碼1個由505個氨基酸組成、分子量約 58.7 ku的蛋白，7 629～7 787位堿基編碼1個由52個氨基酸組成、分子量約6.1 ku的蛋白 P6，7 791～8 357位堿基編碼1個由188個氨基酸組成、分子量約22.1 ku的蛋白P22，5′UTR和 3′UTR 的長度分別為73 nt和250 nt。

RNA2序列全長共計8 041個堿基，編碼8個蛋白，其中1 035～1 166位堿基編碼由43個氨基酸組成、分子量約4.9 ku的蛋白P4.9，1 207～2 877位堿基編碼由556個氨基酸組成、分子量約62.4 ku的蛋白HSP70h，2 878～3 042位堿基編碼1個由54個氨基酸組成、分子量約6.6的蛋白P6，3 036～4 589 位堿基編碼由517個氨基酸組成、分子量約59.7 ku的蛋白P59，4 571～4 810 位堿基編碼由79個氨基酸組成、分子量約9.3 ku的蛋白P9，4 941～5 693位堿基編碼由250個氨基酸組成、分子量約28.7 ku的蛋白CP，5 693～7 117位堿基編碼由474個氨基酸組成、分子量約54.5 ku的蛋白CPm，7 179～7 820位堿基編碼由213個氨基酸組成、分子量約24.9 ku的蛋白P26，5′UTR和3′UTR的長度分別為1 034 nt和221 nt。

BLAST分析結果表明，CCYV-JSXH的RNA1序列與目前已經公布的各個分離物基因組序列的相似度在99.58%以上，其中與北京分離物JQ904628和河南分離物MW768903的相似度最高，序列一致性達99.88%。但CCYV-JSXH RNA1的各編碼基因和非編碼序列與已知CCYV分離物的各序列相似度不完全一致，其中5′UTR、3′UTR和 P6基因序列保守性較高，大多數分離物的相似性為100%，堿基變化較多存在于ORF1a、ORF1b 和P22基因上，它們的一致性在99.27%～99.90%之間（表2）。

CCYV-JSXH的RNA2序列與目前已公布的分離物基因組序列相似度在99.47%以上，其中與廣東分離物GDLJ（MZ392421）相似度最高，序列一致性達99.80%。CCYV-JSXH RNA2的各編碼基因和非編碼序列與已知CCYV分離物的各序列相似度也不完全一致，其中P4.9、P6、P9和 3′UTR序列保守性較高，許多分離物的相似性高達100%，而5′UTR、HSP70h、 P59、CP、CPm和P26上的變異較多，其一致性在99.09%～99.94%之間（表3）。

將本研究獲得的分離物CCYV-JSXH與已經公布的和其一致性較高的3個分離物（JQ904628、MW768903、MZ392420）的序列進行比較分析。結果（表4）顯示，這4個分離物中共有51個位點存在堿基變化，RNA1中有21個差異堿基位點，RNA2中有30個。JSXH與其他3個分離物均不相同的位點有23個，RNA1中8個，RNA2中15個。RNA1上的差異堿基位點共有13個為同義突變，8個位點為錯義突變；RNA2上有9個位點為同義突變，12個錯義突變，另外還有9個突變位點處于RNA2的UTR區域。錯義突變存在的位置分別位于ORF1a、ORF1b、P22、HSP70h、CP、CPm和P26上。

將NCBI中有全基因組序列報道的CCYV RNA1和RNA2序列分別使用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行聚類分析，將毛形病毒屬成員萵苣褪綠病毒（LCV）（NC012909）作為外群，進化樹分支置信度（Bootstrap）使用1 000次自導復制驗證，由此構建的Bootstrapconsensustree結果（圖2）顯示，CCYV-JSXH與其他CCYV分離物聚在一起，表明該分離物確實為CCYV成員之一。根據RNA1序列的系統進化樹拓撲結構分析可以看出CCYV-JSXH與山東分離物CC-XH聚為一支（圖2-A），說明它們之間RNA1親緣關系較近。但從RNA2序列的系統進化樹拓撲結構可以看出CCYV-JSXH與廣東分離物GDLJ聚為一支（圖2-B），表明這2個分離物的RNA2親緣關系較近。

3? 討論與結論

CCYV 最初在2009年被發現，后來在世界許多國家的葫蘆科作物上均有發生報道，近些年來出現越來越多的報道，2010年該病毒在我國臺灣地區被發現，而后在多個省市陸續被發現。劉放等調查發現湖南省南瓜CCYV檢出率呈上升趨勢，并且對CCYV分離物的CP基因進行選擇壓力和中性檢測分析，結果顯示，我國種群受到正向選擇壓力或多樣化選擇作用，其種群多態性較低，正處于擴張趨勢，但從世界范圍來看，CCYV維持相對穩定狀態^[21]。本研究團隊在前期研究普查中，曾于2019年在山東壽光的黃瓜上發現CCYV感染^[29]，后于2019—2020年在江蘇7個地區的7種葫蘆科作物調查中發現豐縣、睢寧、南京、蘇州采集的樣品中出現該病毒，感染寄主有黃瓜、西瓜和甜瓜，總感染率為6.64%^[30]，這是首次在江蘇省境內發現CCYV的侵染。2022年在對南京市、泰州市姜堰區和另外6個地區進行葫蘆科作物調研的過程中，又發現了該病毒的侵染，除了黃瓜和甜瓜外，絲瓜和西葫蘆也檢出CCYV，本次樣品CCYV總檢出率為18.3%。該病毒在江蘇省內的傳播可能也呈現逐漸擴大的趨勢。

煙粉虱的流行暴發本身就會給蔬菜產業造成損失，而且煙粉虱又可以同時攜帶多種病毒，再加上它們食性繁雜、寄主廣泛，這就給相關病毒的擴

展蔓延提供了很多機會^[31]。走訪調查發現該病毒病的暴發時間與煙粉虱的暴發時間相吻合，條件適宜的溫室環境下隨時可能暴發；而露地作物在 8—10 月期間也有可能集中暴發。不僅煙粉虱向周邊地區的擴散會造成病毒的蔓延，蔬菜作物和種子的貿易往來等也會造成病毒長距離的傳播^[32]。圖2為分別基于NCBI中不同CCYV分離物的RNA1和RNA2全序列分析構建的系統進化樹，該類型的進化樹是很多次Bootstrap得到的平均結果。從圖2可以看出，無論是RNA1還是RNA2，來自國外的分離物（美國分離物、日本分離物和以色列分離物）都聚在一個大分支上，這說明CCYV的進化具有一定的地域性。在國內分離物中，江蘇分離物JSXH的RNA1與山東分離物CC-XH親緣關系最近，但是其RNA2卻與廣東分離物GDLJ親緣關系最近，這可能意味著該病毒通過多種途徑傳入江蘇，并在不同毒株之間發生了復制重組。

實驗室條件下發現該病毒能感染19種葫蘆科作物，本研究在葫蘆科作物集中生產地采集的黃瓜、甜瓜、絲瓜和西葫蘆上均發現了該病毒，這說明該病毒在自然狀態下確實可以感染多種作物導致生產問題。目前已有報道該病毒在自然情況下侵染西甜瓜、西葫蘆、黃瓜等多種葫蘆科作物，其中CCYV感染絲瓜還未有詳細報道。因此該病毒是葫蘆科作物生產中的巨大威脅。還有研究報道其能感染13種雜草，這更加大了該病毒的防控難度，在生產中不僅要注意作物本身的防控還要注意田邊雜草的管理。此外，相似度和系統進化分析發現來源于同一寄主的分離物并沒有聚在一起（圖2），表明該病毒的進化不受寄主的影響。

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