基于VIGS技術的烤煙煙堿調控及對煙堿含量的影響

楊再軍 張麗 張福強 張權 昝建朋 田舉要 白茂軍 徐世曉

摘要：在對烤煙原料要求煙堿含量低的中煙工業企業中，煙堿含量過高的煙葉難以在原料配方中適配，導致工業可用性較低。為了降低煙葉中煙堿的含量，通過病毒誘導基因沉默技術（virus induced gene silencing，VIGS）構建煙堿合成過程中4個關鍵基因（NtA622、NtPMT、NtBBL、NtMYB305a）的靶向沉默體系，探究瞬時沉默對基因相對表達量及煙堿含量的影響，并對不同載體的沉默效率與煙堿降低率進行貢獻度分析。結果表明，通過目標序列靶片段成功構建了基于VIGS技術的沉默載體；T2處理沉默NtPMT基因后，最大沉默效率為55.23%，T3處理沉默NtBBL基因后，沉默效率為50.78%，兩者差異不顯著；各處理沉默相應基因后，不僅表現出對應基因表達量的下調，同時對本研究中其他基因的表達量也有影響；煙堿降低最多的是T3處理，降低率達到39.34%，同時T3處理沉默NtBBL基因的沉默效率對煙堿降低的貢獻度最大，為0.775。本研究建立的VIGS技術體系有效沉默目的基因的表達，沉默NtBBL基因的T3處理沉默效率較高，煙堿含量較低，為調控煙堿含量提供了一種新思路與方法。

關鍵詞：VIGS；煙堿；載體構建；相對基因表達量；病毒誘導的基因沉默

中圖分類號：TS44⁺1? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0061-07

收稿日期：2023-09-29

基金項目：貴州省煙草公司安順市公司項目（編號：2023520400240038）；廣西壯族自治區煙草公司百色市公司項目（編號：202245100020409）。

作者簡介：楊再軍（1998—），男，貴州甕安人，碩士研究生，主要研究方向為煙草遺傳育種。E-mail：yangzaijun528.163.com。

通信作者：徐世曉，博士，副教授，從事煙草遺傳育種研究。E-mail：xushixiao@henau.edu.cn。

煙堿是煙草中最重要的一類生物堿，它不僅是煙草品質的重要構成要素，還是衡量煙草煙葉品質、卷煙產品質量的一項重要指標。煙堿含量占煙草生物堿總量的90%～95%^[1]，并且煙草只有根系具有合成煙堿的能力，其中根尖皮層、表皮細胞及圍繞維管束的薄壁細胞是煙堿合成的主要部位，煙草其他組織和器官并不能合成煙堿^[2]。煙草煙堿的代謝途徑由吡啶環的形成、吡咯環的形成和兩環結合3個步驟組成，目前該過程已基本明確^[3]。

在煙堿合成代謝途徑中，腐胺-N-甲基轉移酶（putrescine N-methyl transferase，PMT）是煙堿合成的關鍵控制酶^[4-5]，PMT基因只在煙草根部表達，煙堿生物合成的第1步是腐胺在腐胺-N-甲基轉移酶（PMT）的催化作用下生成S-腺苷甲硫氨酸、N-甲基腐胺^[6]。有研究表明，在煙草中利用消減雜交技術能一起分離得到PMT、A622^[7]，A622是一個異類黃酮還原酶基因；小檗堿橋狀酶（berberine bridge enzyme-like，BBL）基因家族在細菌、真菌和植物中廣泛存在^[8]；在煙堿代謝途徑的最后步驟（吡啶環和吡咯環結合）需要PIP家族異類黃酮還原酶類蛋白A622和小檗堿橋連酶類蛋白BBL的共同參與^[9-10]。NtMYB305a是R2R3-MYB轉錄因子家族中的一員，其分子進化關系與擬南芥中的AtMYB21、AtMYB24分子進化最接近^[11]，NtMYB305a的功能是通過結合在 AT-rich元件上來協同調控煙堿代謝途徑中部分基因的表達，其中包括NtPMT、NtBBL、NtA622基因的表達，另外，NtMYB305a基因表達上調或者下調都會顯著影響煙草植株葉片中的煙堿含量^[12]。在煙堿代謝的調控上，雖然減少施氮量、打頂留葉等栽培措施已被證實對煙草煙堿含量具有調節作用，但是還存在實際生產應用中因人工勞務量重或經濟效益差等原因導致的應用不夠廣泛等問題^[13]。諸多研究在探究煙堿合成途徑中的基因功能時，也有使用RNAi或者基因敲除的方式研究基因功能，但同時對不同基因沉默作用于煙堿含量的結果進行橫向比較的報道較少。

病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是利用RNA介導的植物防御病毒免疫機制而發展起來的一項詮釋植物基因功能的反向遺傳學技術，其內在的分子基礎是轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）^[14]。VIGS載體具有多種選擇，其中煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）載體以沉默效率高、沉默時效長、對接種植株不會造成明顯傷害等優點而成為病毒誘導的基因沉默技術中選擇率較高的載體^[15]。目前VIGS在煙草多方面均得到應用，如郭玉鴿等構建GS同工酶基因沉默體系，有效降低了氮代謝關鍵酶活性和含氮化合物含量^[16]；姚怡帆等沉默煙草NtPPO8基因，降低了PPO活性，提高煙葉耐烤性和降低煙葉褐變比例^[17]。國內外學者關于降低煙堿含量方面開展了大量研究，但是目前以VIGS技術沉默不同基因來調控煙堿合成的還鮮見報道。本試驗構建3個合成關鍵基因（NtPMT、NtA622、NtBBL）與1個轉錄因子NtMYB305a的沉默載體，以利用VIGS技術分別進行沉默，探究基因相對表達量與煙堿含量的關系，以及各載體沉默效率對煙堿降低率的貢獻度，篩選出沉默效率較好的靶向沉默載體，以期為降低烤煙煙堿含量提供理論依據，從而提高烤煙煙葉工業可用性。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

本試驗于2023年4月在河南農業大學科教園區煙草基地大棚內進行，材料采用盆栽種植，供試品種為云煙87，由河南農業大學煙草學院育種實驗室提供。pTRV2載體購自武漢淼靈生物科技公司，根癌農桿菌GV3101與pTRV1購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 選取沉默靶片段根據NCBI上已登錄的NtPMT（登錄號：107771646）、NtA622（登錄號：107784748）、NtBBL（登錄號：107791775）、NtMYB305a（登錄號：107821652）的序列，通過與鄭州煙草研究院自建云煙87與K326的全基因組數據庫對比，選取序列對比結果中的保守區段構建VIGS載體，根據目標序列合成30條引物。

1.2.2? VIGS載體構建利用合成的30條引物在高保真PCR聚合酶（PV2）的作用下進行PCR，以獲取克隆目標序列。擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳檢測發現條帶單一，而后參考Axygen產品說明書純化回收目的片段，同時用BamHⅠ/XhoⅠ對pTRV2-ve質粒進行雙酶切后，獲得線性化載體，將純化回收的目的片段和pTRV2-ve線性化載體在重組酶作用下進行重組連接。酶連后轉入大腸桿菌并進行菌液涂布試驗，37? ℃溫育過夜。挑取平板中的單菌落，電泳鑒定陽性克隆，提取質粒進行測序和酶切驗證。用驗證正確的質粒轉化農桿菌GV3101感受態細胞，參照農桿菌GV3101使用說明方法，挑取菌落培養在YEP液體培養基（25 mg/L利福平+50 mg/L 卡那霉素+25 mg/L 慶大霉素）中，取1 μL培養菌液進行PCR鑒定后分別擴繁。

1.2.3? 農桿菌接種體系構建制備LB培養基（50 μg/mL 利福平+50 μg/mL卡那霉素），將構建成功的含病毒載體pTRV1、pTRV2、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtA622、pTRV2-NtBBL和pTRV2-NtMYB305a的農桿菌菌株分別接種到LB培養基中，28 ℃、200 r/min恒溫培養24 h，用分光光度計調整菌液濃度（D_{600 nm}）為0.8～1.0，用pTRV1分別與pTRV2、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtA622、pTRV2-NtBBL 和pTRV2-NtMYB305a等體積混合，取混合液50 mL轉入離心管中高速離心，棄上清液，而后加入等體積的農桿菌浸染緩沖液（50 mmol/L氯化鈉、50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸、0.1 mmol/L乙酰丁香酮）中。避光2 h后，用1 mL注射器吸取含病毒載體的浸染液對6葉1心煙苗采用注射接種法浸染，注射部位為煙株嫩葉背面，主脈左右，避開支脈，每株煙苗注射左右對稱的2張葉片，每張葉片注射面直徑約1 cm。

1.3? 試驗設計

試驗共設置6個處理，處理如下：CK，不注射煙株；CK1空載，注射接種含pTRV2的侵染液（空載體對照）；T1，注射接種含pTRV2-NtA622的侵染液；T2，注射接種含pTRV2-NtPMT的侵染液；T3，注射接種含pTRV2-NtBBL的侵染液；T4，注射接種含pTRV2-NtMYB305a的侵染液。每個處理選取10株長勢均勻一致的煙苗進行注射接種，每株煙苗接種4 mL。其他盆栽管理措施保持一致。

1.4? 測定指標

1.4.1? 目的基因相對表達量的測定分別在接種后15 d取各處理煙株根部不定根，用清水洗凈后用脫脂棉吸干水分，充分消毒后經液氮冷凍，取3份樣品作生物學重復。樣本按照RNA試劑盒提取總RNA，反轉錄cDNA，根據選取的靶片段序列設計擴增引物（表2）。參照Quant qRT-PCR kit（S Y B RGreen） （TIANGEN公司）使用說明，在Quant Studio Tnl 6 Flex熒光定量PCR儀（ABI公司）上進行各目的基因的qRT-PCR檢測，以煙草26S rRNA為內參基因，作3次技術重復。根據檢測結果中的C_T值，采用2^-ΔΔC_T法分析各目的基因的相對表達量。以對照組CK基因表達量為1，沉默效率的計算公式如下：沉默效率=（1-試驗組相對基因表達量）×100%。

1.4.2? 煙堿含量的測定同時取新生葉片作殺青樣，每個處理取3份樣品作生物學重復，將烘箱溫度升至105 ℃后，放入葉片樣品殺青30 min，然后將烘箱溫度調至60 ℃，使葉片充分脫水并烘干至恒定干重，去除主脈、支脈，研磨過60目篩，采用連續流動化學分析儀（AA3，德國Seal公司）測定煙堿含量。煙堿含量降低率的計算公式：降低率=（對照組煙堿含量-試驗組煙堿含量）/對照組煙堿含量×100%；

沉默效率對煙堿含量降低的貢獻度計算公式：貢獻度=煙堿含量降低率/基因沉默效率。

1.5? 數據分析

用Excel 2010、DPS 7.05軟件進行相關數據統計分析，用Duncans新復極差法比較不同處理間各種指標之間的差異。

2? 結果與分析

2.1? VIGS載體的構建

2.1.1? 目標序列的克隆將基因NtPMT、NtA622、NtBBL、NtMYB305a序列通過引物合成、PCR方法融合并克隆入載體pTRV2-ve。根據目標序列合成30條引物，通過PCR獲取克隆目標序列，克隆鑒定每個載體的2個條帶，結果見圖1。對PCR產物進行膠回收，回收產物的驗證結果見圖2。

2.1.2? 載體的重組連接用BamHⅠ/XhoⅠ處理pTRV2-ve質粒，進行膠回收，在重組酶的作用下將目標序列克隆的膠回收產物進行重組連接。重組后轉化大腸桿菌并進行涂布試驗，每個基因隨機挑選2個陽性菌進行驗證，結果見圖3，提取驗證正確的質粒測序并進行酶切驗證，結果見圖4。

2.1.3? 轉化農桿菌將測序正確的質粒轉化農桿菌GV3101感受態細胞，轉化后取1 μL培養菌液進行PCR鑒定，結果見圖5。檢測引物（位于目的片段插入位置的上、下游）序列：TRV-F，5′-CATTAGCGACATCTAAATAGG-3′；TRV-R，5′-AACCTAAAACTTCAGACACG-3′。

2.2? 各處理的基因沉默效率分析

由圖6可知，在接種后15 d，各基因在CK與CK1中的相對基因表達量差異不顯著，各處理對應的基因相對表達量與CK、CK1相比均表現下調，且與CK間差異顯著。相較于CK，T1處理沉默NtA622基因后，NtA622基因的相對表達量最高，與其他處理差異顯著，基因沉默效率最低，為26.54%。

T2處理沉默NtPMT基因后，NtPMT基因的相對表達量最低，沉默效率最高，為55.23%，與T1、T4處理差異顯著。T3處理沉默NtBBL基因后，沉默效率為50.78%，與T2處理間差異不顯著。根據各處理基因相對表達量結果，沉默效果較好的是T2、T3處理。

2.3? 沉默后相關基因表達量差異分析

由圖7-a可知，在T1處理下對NtA622基因進行沉默后，與CK相比，NtPMT、NtMYB305a基因的相對表達量下調，且差異顯著，NtBBL基因的相對表達量上調，但差異不顯著。NtPMT、NtBBL、NtMYB305a基因之間相對表達量差異顯著，相對基因表達量較高的是NtBBL基因，相對基因表達量較低的是NtPMT基因。

由圖7-b可知，在T2處理下對NtPMT基因進行沉默后，NtA622、NtBBL、NtMYB305a基因的相對表達量與CK間差異顯著，NtA622基因的相對表達量上調，NtBBL、NtMYB305a的相對表達量均下調。在T2處理下，NtPMT、NtBBL、NtMYB305a基因之間相對表達量均存在差異，相對基因表達量較高的是NtA622基因，相對基因表達量較低的是NtMYB305a基因。

由圖7-c可知，在T3處理沉默NtBBL基因后，相較于對照組CK，NtA622基因的相對表達量上調，NtMYB305a基因的相對表達量下調，均差異顯著，NtPMT基因的相對表達量變化不大，差異并不顯著。NtA622、NtBBL、NtMYB305a在T3處理中的相對表達量均差異顯著，相對表達量較高的是NtA622基因，相對表達量較低的是NtMYB305a基因。

由圖7-d可知，T4處理沉默NtMYB305a基因后，NtA622、NtPMT、NtBBL基因的相對表達量均下調，且與CK差異顯著。但在T4處理中，NtA622、NtPMT、NtBBL基因相對表達量的差異并不顯著。

2.4? 沉默后各處理煙堿含量的變化

煙葉煙堿含量是沉默目的基因后的最終結果，由圖8可知，接種后15 d，各處理的煙堿含量較CK、CK1都有不同程度的下降。CK、CK1的煙堿含量變化無明顯差異，其他處理的煙堿含量均與CK差異顯著，其中煙堿含量降低最多的是T3處理，煙堿含量為0.50%，降幅為39.34%；其次為T2處理，煙堿含量為0.60%；煙堿含量降低最少的是T4處理，煙堿含量為0.78%，降幅為10.82%。

2.5? 各處理沉默效率對煙堿含量降低的貢獻度分析

由圖9可知，T2處理的基因沉默效率最高，顯著高于T1、T4處理，但與T3處理對應基因的沉默效率間差異不顯著。各處理對應的煙堿含量有顯著差異，其中煙堿含量降幅最高的是T3處理，顯著高于其他處理。T3處理的沉默效率對煙堿含量降低的貢獻度最高，為0.775，T4處理的沉默效率對煙堿含量降低的貢獻度最低，為0.307；基因沉默效率與煙堿含量降低率越高，說明對煙堿含量降低的貢

獻度越大，兩者成正比關系。

3? 討論

烤煙煙堿含量過高的問題一直是工業企業原料配方不適配、可用性低的重要影響因素，其中烤煙上部葉煙堿含量偏高的問題尤為突出。在烤煙大田生產中，常常通過調整移栽期、種植密度、打頂高度、留葉數、氮肥施用量等^[18-19]栽培措施調控煙

堿含量，但往往與烤煙形成的品質互相矛盾。任夢娟研究發現，用嫁接技術對煙草進行換根，可顯著降低煙堿生物合成，生產無煙堿或煙堿水平極低的煙葉^[20]，但煙堿含量過低的煙葉勁頭小、香氣量少、煙氣淡而無味且無法滿足工業需求^[21]。馮吉等利用CRISPR/Cas9技術對煙堿合成和轉運的5個基因進行基因編輯，獲得4種低煙堿純合基因型T2代煙草植株^[22]，但該技術存在易脫靶、無法對多拷貝基因編輯問題。張明月利用RNA干擾技術調控煙堿合成，但只是通過PMT基因的沉默來進行研究，載體單一^[23]。

本研究利用生物學技術調控煙堿生物合成，通過大量文獻調研，篩選出煙堿合成中的3個關鍵基因（NtPMT、NtA622、NtBBL）與1個轉錄因子NtMYB305a。通過基因序列比對，選擇基因保守片段作為靶序列，通過PCR克隆沉默目標序列，重組連接載體，獲得正確的質粒，并用該質粒轉化農桿菌，成功構建了基于VIGS技術的4個基因沉默載體，利用4個載體成功沉默了相應基因，降低了葉片中的煙堿含量。

煙堿生物合成是代謝途徑中多基因共同作用的結果^[24-25]，降低合成過程中關鍵基因的表達量，可以降低葉片中的煙堿含量。本研究結果表明，利用VIGS技術體系對煙堿合成關鍵基因的沉默是有效的。各處理沉默后對應基因相對表達量均顯著降低，其中T2處理沉默NtPMT基因后，其相對基因表達量降低得最多，沉默效率最大，為55.23%；T3處理沉默NtBBL基因后，沉默效率為50.78%，兩者差異并不顯著。在本研究建立的VIGS體系下，各處理沉默對應基因均得到明顯的沉默效果，但相互之間的沉默效果均存在差異，這與郭玉鴿等的研究結果^[26]相似。其中以NtPMT、NtBBL基因的沉默效率較高。

在本研究中，各處理沉默相應基因后，不僅表現出對應基因表達量的下調，同時對本研究中其他基因的相對表達量也有影響，這與郭玉鴿等的研究結果^[16]相似。T1處理沉默基因NtA622后，NtPMT、NtMYB305a基因的相對表達量下調；T2處理沉默NtPMT基因后，NtA622的相對表達量上調，NtBBL、NtMYB305a基因的相對表達量下調；前人研究發現，A622參與所有生物堿合成所需的煙酸衍生物前體的形成，同時參與吡啶環、吡咯環的縮合反應^[9]。而在PMT抑制表達的植株中，煙堿合成所需的N-甲基吡咯啉陽離子的豐度降低，而煙酸衍生的吡啶環代謝物的積累增多^[27]，這可能是因為這些基因的功能不同，所參與的代謝物質形成具有相互調節作用。T3處理沉默NtBBL基因后，NtPMT基因表達量差異不顯著，NtMYB305a基因表達量下調，NtA622基因表達量上調。前人研究發現，BBL蛋白參與煙堿形成的最后階段，BBL的作用階段在吡啶環和 N-甲基-吡咯環起始縮合之后^[28]，而PMT基因主要作用是催化腐胺能夠生成S-腺苷甲硫氨酸、N-甲基腐胺^[5]，所以當NtBBL基因沉默后，并不會太影響NtPMT的表達，而NtA622基因表達上調，原因是可能存在煙堿合成的次要途徑，不涉及BBL活動^[29]。T4處理沉默NtMYB305a基因后，NtA622、NtPMT、NtBBL基因的相對表達量均下調。前人研究發現，NtMYB305a對NtA622，NtPMT，NtBBL基因的表達具有調節作用^[30]，在茉莉酸信號途徑中，可能還存在其他未知的調控因子與NtMYB305a共同參與調控煙堿代謝功能基因的表達^[31]。

煙堿含量是葉片中重要組成成分，也是本研究中不同沉默載體的直接作用結果。結果表明，各處理的煙堿含量均降低，且差異顯著。各處理基因沉默后對應基因表達量趨勢與煙堿含量變化趨勢基本一致，其中煙堿降低最多的是T3處理，降低率達到39.34%。分析各處理基因沉默效率與煙堿降低率的關系時，貢獻度可以表示不同的沉默效率對煙堿降低多少的影響，其中T3處理沉默NtBBL基因的沉默效率對煙堿降低的貢獻度最高，為0.775。

本研究建立的VIGS技術體系具有成本低、方法操作簡單等優點^[32]，可有效沉默目標基因的表達，進而達到葉片煙堿含量顯著降低的目的。有研究發現，VIGS技術通過灌根接種法＋葉部注射法對根部的特異表達基因沉默效率高達80%^[33]。而本研究未采用灌根接種法，是考慮到煙堿是煙草特有化合物，對烤煙品質十分重要，過高過低都會影響到烤煙品質。下一步將繼續研究同時沉默不同目標基因載體對煙堿含量的影響，以達到降低煙堿含量到適中的目的，以期用于大田生產實際提供理論基礎。

4? 結論

本研究建立的沉默NtBBL基因的VIGS體系能夠有效沉默目標基因的表達，基因沉默效率達50.78%，成功降低了葉片中煙堿含量，降低率達39.34%，并且該基因沉默效率對煙堿降低的貢獻度達0.775，為烤煙煙堿調控提供了新的思路與方法，對優質煙葉生產具有一定理論與實際意義。

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