中國虎紋蛙多堿基重復微衛星位點的多態性

喬芬 邵偉偉 馬力 林植華 韋力

摘要 ?［目的］篩選出中國虎紋蛙高質量多態性的微衛星標記，用于該物種的鑒定以及遺傳多樣性、種群結構、遺傳連鎖圖譜分析。［方法］利用新一代測序技術，從中國虎紋蛙部分基因組中篩選出33個三核苷酸重復、42個四核苷酸重復和1個五核苷酸重復微衛星位點，共76個多堿基重復微衛星位點。所有位點對浙江麗水學院兩棲爬行動物實驗室人工飼養的種群（n=30）進行了擴增和基因型分析。［結果］每個位點觀察到的等位基因數和多態信息含量（PIC）的平均值分別為4個（2～7個）和0.514（0.164～0.822），觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）分別為0.00～0.97和0.18～0.82。有2個位點（THC141和THC377）顯著偏離哈迪溫伯格平衡，在11個位點中發現了顯著的連鎖不平衡。［結論］這些新篩選的多態性微衛星標記有助于進一步研究中國虎紋蛙的遺傳多樣性和開展遺傳育種，為制定有效的保護策略和開展分子輔助選擇提供依據。

關鍵詞? 中國虎紋蛙；多堿基重復微衛星；遺傳多樣性；分子標記；多態性

中圖分類號? S917.4?? 文獻標識碼? A?? 文章編號? 0517-6611（2024）07-0082-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.07.020

Polymorphic Multiple-base Repeat Microsatellite Loci of Chinese Tiger Frog Hoplobatrachus chinensis

QIAO Fen， SHAO Wei-wei， MA Li et al

（College of Ecology， Lishui University， Lishui， Zhejiang 323000）

Abstract? ［Objective］ Screening of highquality polymorphism microsatellite markers in the Chinese tiger frog Hoplobatrachus chinensis can be used for identification， genetic diversity， population structure， and genetic linkage map analysis of this species. ［Method］ In this study， we identified 76 multiplebase repeat microsatellite loci， including 33 trinucleotide， 42 tetranucleotide and 1 pentanucleotide repeat microsatellite loci from partial genome of Chinese tiger frog Hoplobatrachus chinensis using the nextgeneration sequencing technology. We genotyped 30 individuals from a population in an artificial pond at the herpetological laboratory of Lishui University， Zhejiang Province， China. ［Result］ The results showed that the mean number of observed alleles and polymorphic information content （PIC） per locus was 4 （range from 2 to 7） and 0.514 （range from 0.164 to 0.822）， respectively. The observed and expected heterozygosity values ranged from 0.00 to 0.97 and from 0.18 to 0.82， respectively. Two loci （THC141 and THC377） showed significant departure from HardyWeinberg equilibrium and significant linkage disequilibrium was found among 11 pairwise loci. ［Conclusion］ These novel polymorphic microsatellite markers are expected to be valuable for future studies on genetic diversity and conducting genetic breeding， enabling the formulation of effective conservation strategies and the use of molecular assisted selection for H. chinensis.

Key words? Hoplobatrachus chinensis;Multiplebase repeat microsatellite;Genetic diversity;Molecular marker;Polymorphism

中國虎紋蛙（Hoplobatrachus chinensis）之前被稱為H.rugulosus，屬于無尾目（Anura）蛙科（Ranidae），主要棲息于農田及其附近區域［1］。與其他兩棲動物一樣，中國虎紋蛙在害蟲防治、水生和陸生食物網等方面發揮著重要作用。關于中國虎紋蛙的研究主要包括生長發育［2-3］、聲通訊［4］、繁殖特征［5-6］、人工養殖［7］等。作為可食用蛙類，中國虎紋蛙在過去幾十年因過度捕捉而造成野生種群資源急劇減少，目前已被列為國家二級保護動物，因此，許多農民在我國南方地區開展了中國虎紋蛙的人工養殖［8］。由于許多養殖場近交現象嚴重，中國虎紋蛙種質資源多樣性嚴重下降。因此，開展中國虎紋蛙優質人工育種具有重要意義。其中，微衛星標記輔助育種是提高種質資源質量的可行方法之一［9］。迄今為止，雖然已經報道了幾十個中國虎紋蛙的微衛星位點［10-11］，但其中大多數位點是二核苷酸重復類型，且不同等位基因之間通常沒什么差異，影響種群研究中基因分型的準確性［12］。相比之下，應用多堿基重復微衛星可以提高基因分型的準確性，從而在群體遺傳結構和保護遺傳學方面具有更高的效 率［12］。為了進一步研究中國虎紋蛙的保護遺傳學，筆者篩選并鑒定了76個新的多堿基重復微衛星標記，為進一步研究該物種的遺傳多樣性和人工育種提供了有力的工具。

1 材料與方法

采用組織提取試劑盒從中國虎紋蛙的肌肉組織中分離得到基因組DNA。利用新一代測序技術，在北京諾禾致源科技股份有限公司進行部分基因組DNA的測序。測序后，利用SSR Hunter軟件（Version 1.3）對已組裝的序列進行搜索和微衛星位點識別［13］。選定的微衛星序列使用 primer 5.0軟件進行引物設計。對于設計的每一對微衛星引物，通過生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成，然后以6個中國虎紋蛙個體的基因組DNA為模板，優化擴增條件。

引物擴增條件優化后，對來自麗水學院兩棲爬行動物實驗室人工養殖的30個中國虎紋蛙DNA樣品進行擴增，擴增產物送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序和分型。采用 M13尾端（5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′）標記引物進行巢式PCR擴增。所有微衛星的正向引物的5′端都加入了M13的尾端標記，PCR混合物中加入了熒光標記的M13引物［11］。每個PCR擴增體系的總體積為15.0 μL，包含100 ng 模板DNA 1.0 μL，0.5 μmol/L的正向引物1.0 μL，0.5 μmol/L的反向引物1.0 μL，0.5 mmol/L的dNTP、0.1 U 熱啟動酶（QIAGEN）和1.2 mmol/L 的MgCl2 7.5 μL，不足用滅菌水補足。PCR擴增的條件是：先在95 ℃的初始變性溫度下進行5 min，然后進行34次95 ℃的30 s循環，Ta（最佳退火溫度）30 s，72 ℃延伸30 s，最后進一步擴增72 ℃ 20 min。PCR產物用ABI 3730測序儀（applied biosystems）進行基因分型，并用Genemarker v1.8軟件進行分析。用Genepop 4.0軟件［14］對觀測雜合度（observed heterozygosity，HO）和期望雜合度（expected heterozygosity，HE）進行計算，用Fstat 2.9.3.2軟件［15］對哈迪溫伯格（hardy-weinberg equilibrium，HWE）平衡和連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）偏差進行檢驗。用Cervus 3.0軟件計算多態信息含量（polymorphic information content，PIC）［16］。

2 結果與分析

利用新一代測序技術，從部分基因組中獲得了450條潛在多堿基重復微衛星DNA序列，共設計并檢測了80對微衛星引物。其中4對引物為單帶或擴增質量差，其余76對引物（包括33個三核苷酸、42個四核苷酸和1個五核苷酸重復微衛星引物）在30個中國虎紋蛙檢測樣品中均呈現多態性（表1）。共觀察到290個不同的等位基因位點，每個位點平均為4個（范圍為2～7個等位基因）。等位基因大小在99（THC353）到300（THC346）之間。

微衛星的多態信息含量（PIC）平均值為0.514，范圍在0.164（THC098和THC197）和0.822（THC226）之間。

觀測雜合度（HO）范圍為0.000～0.967，期望雜合度（HE）范圍為0.184～0.822。經過Bonferroni校對后，發現有2個微衛星位點顯著偏離哈迪溫伯格平衡（HWE）。經過連鎖不平衡（linkage disequilibrium）檢測試驗結果，發現有11對位點間存在連鎖不平衡，即位點THC100與THC105之間、THC100與THC250之間、THC100與THC320之間、THC031與THC105之間、THC031與THC320之間、THC063與THC204之間、THC075與THC281之間、THC105與THC320之間、THC106與THC161之間、THC130與THC352之間以及THC312與THC346之間。

3 討論

微衛星在原核生物和真核生物中普遍存在［17-18］。由于其高重復性、多等位基因性、共顯性遺傳模式以及在基因組中的廣泛覆蓋率，微衛星已成為最受歡迎的遺傳標記類別之一［19］。傳統的微衛星篩選方法包括磁珠富集法、選擇性雜交和表達序列標簽等，這些篩選方法雖有效但數量有限、耗時長且價格昂貴［20］。近年來，利用計算機軟件從DNA序列數據庫中對微衛星序列進行篩選，已經迅速取代了從基因組文庫中篩選微衛星標記的傳統方法［21］。該研究通過新一代測序技術對中國虎紋蛙進行簡化測序，從其部分基因組中篩選微衛星序列。結果表明，通過簡化測序能夠獲得足夠多的潛在微衛星序列。對設計的80對微衛星引物進行檢測，發現有76對呈現出多態性，進一步說明基因組篩選微衛星的有效性。用76對引物對30個檢測樣品進行擴增和分型，共觀察到290個不同的等位基因位點，每個位點平均為4個，等位基因大小在99到300之間。Shao等［10］利用磁珠富集法獲得9對中國虎紋蛙微衛星位點，共觀察到77個不同的等位基因，平均為8.6個等位基因。Chen等［11］通過轉錄組測序法獲得33對中國虎紋蛙微衛星位點，共觀察到174個不同的等位基因，平均為5.3個等位基因。造成這些差異的原因可能與檢測樣品個體的親緣關系有關。

該研究中，中國虎紋蛙微衛星的多態信息含量（PIC）平均值為0.514，根據Botstein等［22］描述的PIC值，發現該研究有43個微衛星位點為高信息量位點（PIC>0.5），31個微衛星位點為中等信息量位點（0.5>PIC>0.25），2個微衛星位點為低信息量位點（PIC<0.25），該結果與Chen等［11］對該物種的轉錄組測序篩選的微衛星結果相似，即PIC為0.552。類似的結果見海陸蛙（Fejervarya cancrivora）［23］的研究報道。但是，與科基蛙（Eleutherodactylus coqui）［24］的PIC（均值為0743）和飾紋姬蛙（Microhyla fissipes）［25］的PIC（均值為0.679）相比，該研究的PIC偏低。

該研究的中國虎紋蛙的平均觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）分別為0.460和0.582，該兩項指標與Chen等［11］對該物種的研究結果相似（HO=0.502，HE=0.609），但均低于Shao等［10］對該物種的研究結果（HO=0.796，HE=0.837），也低于其他無尾兩棲類（如沼水蛙［26］和海陸蛙［23］的HO和HE分別為0.488、0.635和0.789、0.669），進一步表明微衛星位點的多態性與檢測樣品個體的親緣關系有關。另外，該研究發現，有2個微衛星位點顯著偏離哈迪溫伯格平衡，相似的研究結果也在海陸蛙［23］和飾紋姬蛙［25］等上發現，這可能是由于2個位點之間的等位基因大小相似引起的［14，27］。

4 結論

該研究篩選的76個多堿基重復微衛星位點豐富了中國虎紋蛙微衛星文庫資源，研究結果將有助于開展中國虎紋蛙的遺傳多樣性、遺傳圖譜、種群遺傳結構和人工育種研究。

參考文獻

［1］? 費梁，葉昌媛，江建平.中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒［M］.成都：四川科學技術出版社，2012.

［2］ WEI L，SHAO W W，DING G H，et al.Density but not kinship regulates the growth and developmental traits of Chinese tiger frog（Hoplobatrachus chinensis）Tadpoles［J］.Asian herpetological research，2014，5（2）：113-118.

［3］ TANG Y，CHEN Z Q，LIN Y F，et al.The combined effects of temperature and aromatase inhibitor on metamorphosis，growth，locomotion，and sex ratio of tiger frog（Hoplobatrachus rugulosus）tadpoles［J］.PeerJ，2020，8：1-17.

［4］ WEI L，LIN Z H，MA X M，et al.Acoustic characteristics of the tiger frog，Hoplobatrachus rugulosus，during the breeding season［J］.Zoological research，2011，32（4）：456-460.

［5］ 李艷艷.親緣關系對虎紋蛙繁殖及其蝌蚪同類相食的影響［D］.杭州：杭州師范大學，2016.

［6］ 馬小浩.虎紋蛙的繁殖特征及其蝌蚪攻擊行為［D］.杭州：杭州師范大學，2012.

［7］ 符史杭，汪繼超，傅麗蓉，等.海南省人工養殖虎紋蛙的現狀及其對策［J］.湖北農業科學，2013，52（5）：1118-1120.

［8］ YU D N，ZHANG J Y，LI P，et al.Do cryptic species exist in Hoplobatrachus rugulosus？ An examination using four nuclear genes，the Cyt b gene and the complete MT genome［J］.PLoS One，2015，10（4）：1-22.

［9］ MUNDKUR R，MUNIRAJU E.Molecular markerassisted selection breeding in silkworm，Bombyx mori［M］//KUMAR D，GONG C L.Trends in insect molecular biology and biotechnology.Cham：Springer International Publishing，2018.

［10］? SHAO C，WANG Y，QIAO N N.Isolation and characterization of microsatellite loci in tiger frog（Hoplobatrachus rugulosus）［J］.Conservation genetics，2009，10（5）：1601-1603.

［11］ CHEN Z Q，DING G H，WANG Y M，et al.Development and characterization of 33 microsatellite loci for the tiger frog Hoplobatrachus rugulosus（Wiegmann 1834）through transcriptome sequencing［J］.Journal of genetics，2018，97（5）：e147-e151.

［12］ DIWAN N，CREGAN P B.Automated sizing of fluorescentlabeled simple sequence repeat（SSR）markers to assay genetic variation in soybean［J］.Theoretical and applied genetics，1997，95：723-733.

［13］ 李強，萬建民.SSRHunter：一個本地化的SSR位點搜索軟件的開發［J］.遺傳，2005，27（5）：808-810.

［14］ ROUSSET F.Genepop007：A complete reimplementation of the genepop software for Windows and Linux［J］.Molecular ecology resources，2008，8（1）：103-106.

［15］ GOUDET J.FSTAT（version 1.2）：A computer program to calculate Fstatistics［J］.Journal of heredity，1995，86（6）：485-486.

［16］ KALINOWSKI S T，TAPER M L，MARSHALL T C.Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment［J］.Molecular ecology，2007，16（5）：1099-1106.

［17］ SREENU V B，ALEVOOR V，NAGARAJU J，et al.MICdb：Database of prokaryotic microsatellites［J］.Nucleic acids research，2003，31（1）：106-108.

［18］ TTH G，GSPRI Z，JURKA J.Microsatellites in different eukaryotic genomes：Survey and analysis［J］.Genome research，2000，10（7）：967-981.

［19］ SHARMA P C，GROVER A，KAHL G.Mining microsatellites in eukaryotic genomes［J］.Trends in biotechnology，2007，25（11）：490-498.

［20］ ZANE L，BARGELLONI L，PATARNELLO T.Strategies for microsatellite isolation：A review［J］.Molecular ecology，2002，11（1）：1-16.

［21］ BEIER S，THIEL T，MNCH T，et al.MISAweb：A web server for microsatellite prediction［J］.Bioinformatics，2017，33（16）：2583-2585.

［22］ BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］.American journal of human genetics，1980，32（3）：314-331.

［23］ ZHENG Y T，WANG L J，HONG M L，et al.Isolation and characterization of 20 microsatellite markers for the crabeating frog Fejervarya cancrivora［J］.Conservation genetics resources，2016，8（3）：251-253.

［24］ PETERS M B，BEARD K H，HAGEN C，et al.Isolation of microsatellite loci from the coqui frog，Eleutherodactylus coqui［J］.Molecular ecology resources，2008，8（1）：139-141.

［25］ ZHANG J，WANG J，JIANG J P.Development and characterization of 15 polymorphic microsatellite markers for a highly adaptive and widerange frog（Microhyla fissipes）［J］.Asian herpetological research，2013，4（3）：202-206.

［26］ SHAO W W，LIN Z H，FAN X L，et al.Characterization of 25 microsatellite loci for the Guenthers frog Hylarana guentheri［J］.Conservation genetics resources，2018，10（1）：31-33.

［27］ WATTIER R，ENGEL C R，SAUMITOULAPRADE P，et al.Short allele dominance as a source of heterozygote deficiency at microsatellite loci：Experimental evidence at the dinucleotide locus Gv1CT in Gracilaria gracilis（Rhodophyta）［J］.Molecular ecology，1998，7（11）：1569-1573.

基金項目?? 浙江省自然科學基金項目（LY19C040001）；麗水市重點研究項目（2021ZDYF09，2020ZDYF07）；百山祖國家公園科學研究項目（2021KFLY01）。

作者簡介?? 喬芬（1983—），女，河北保定人，講師，博士，從事生態學研究。

通信作者，教授，博士，從事動物學研究。

鳴? 謝?? 該研究工作得到楊寧同學的幫助，在此表示感謝。