mTOR在非酒精性脂肪性肝病脂質代謝中的作用研究進展

邱曉遠 胡德勝 楊夢靈 朱 銳

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中西醫結合科,武漢 430022

隨著經濟的發展和生活方式的轉變,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為全球最普遍的肝臟疾病,是肝細胞癌的主要危險因素,也與2型糖尿病、心血管疾病等的風險增加有關。NAFLD是指在很少飲酒或不飲酒且沒有肝臟脂肪變性繼發原因(如病毒性肝炎、脂肪營養不良或已知會誘發這種疾病的藥物暴露)的個體中,繼發于肝臟脂肪過度積累的一系列疾病[1],常作為肥胖的并發癥,與2型糖尿病、血脂異常和高血壓等密切相關,是常見的肝臟脂質代謝異常誘發的代謝類疾病。NAFLD是一個連續的疾病譜,大致可以分為2個亞型:伴或不伴輕度炎癥的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty live,NAFL)以及伴有壞死性炎癥的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH),其特征是明顯的肝脂肪變性、肝小葉炎癥以及肝細胞腫脹。隨著肝細胞損傷和肝臟炎癥的進一步加重,NAFL發展為NASH,繼續加重的肝損傷和纖維化的積累會導致肝硬化和肝癌,危及生命。隨著經濟水平的增長和居民生活方式的改變,近十年內,中國NAFLD患病率的增長速度是西方國家的兩倍[2]。NAFLD發病機制復雜,臨床治療手段乏善可陳,早期可以通過改變生活方式、減輕體重得到恢復,但是疾病進展到纖維化后就很難逆轉,一旦發展到肝硬化和肝癌,只能依靠肝臟移植。因此,揭示NAFLD發病機制,尋找潛在的干預靶標,將更好地指導有效藥物的開發和臨床決策。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路處于細胞生長和代謝的中心,參與許多代謝性疾病的發生;大量研究表明,抑制mTOR對緩解NAFLD有益。mTOR關聯許多信號通路,它通過調節細胞內的能量和營養狀態來協調細胞成分的合成與分解,是調控細胞生長的網絡中心節點。研究證實,NAFLD的發生發展與mTOR通路介導的脂代謝異常密切相關?；诖?本文聚焦于目前國內外對mTOR通路調控脂代謝的研究,綜述其在NAFLD中的作用。

1 mTOR結構與功能

mTOR是胞內磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶(phosphatidylinositol-3 kinase-related kinase,PIKK)家族的一個289k Da的絲/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動物中,mTOR核化形成2個功能和結構不同的復合物,即mTOR復合體1(mTOR complex 1,mTORC1)和mTOR復合體2(mTOR complex 2,mTORC2),二者的組成、對雷帕霉素的敏感性、底物以及功能都不盡相同。相較而言,mTORC2功能更簡單,而mTORC1通過磷酸化下游底物,可以調控多個生物過程。mTORC1核心成分為mTOR、哺乳動物致死蛋白8(mammalian lethal with SEC13 protein 8,mLST8)和mTOR相關調節蛋白(regulatory-associated protein of mTOR,RAPTOR),其中,mLST8穩定mTOR的激酶結構域,RAPTOR負責mTORC1的亞細胞定位和招募底物。mTORC1通過小GTP酶RagA、RagB、RagC和RagD感知營養可用性,整合營養物質、生長因子和能量輸入,促進合成代謝和細胞生長,同時抑制分解代謝。Rags形成異源二聚體,其活性構象RagA/RagBGTP和RagC/RagDGDP將mTORC1招募到溶酶體中,并被小GTP酶Ras蛋白腦組織同源類似物(Ras homolog enriched in brain,Rheb)激活。激活后的mTORC1磷酸化下游底物增加蛋白合成等合成代謝途徑,抑制自噬、溶酶體生物合成等分解代謝相關通路;其中,真核翻譯起始因子-4E結合蛋白-1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1,eIF4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)是經典的mTORC1底物,其磷酸化后促進蛋白合成。

2 mTOR信號通路在NAFLD中的作用

雖然一般認為肥胖與NAFLD密切相關,但體重正常的非肥胖人群也會出現NAFLD,其危險因素是高爾基體蛋白73;通過其GTP酶激活蛋白活性調節極低密度脂蛋白-載脂蛋白B從肝內向肝外的輸出,使肝臟中的甘油三酯、膽固醇等脂類向肝外運輸受阻,進而促使了非肥胖型NAFLD的形成[3]。有趣的是,低蛋白飲食的營養不良人群也會罹患嚴重肝脂肪變性,在必需氨基酸,尤其是支鏈氨基酸、亮氨酸和異亮氨酸缺乏時,肝細胞中的E3泛素連接酶Ubr1失活,其催化降解具有穩定脂滴作用的Plin2蛋白的作用被抑制,Plin2蛋白水平的升高抑制了肝臟脂質的分解,從而引起肝臟脂肪變性[4]。由此可見,NAFLD最主要的表現是肝臟脂質的異常累積。正常情況下,肝細胞攝取自由脂肪酸,以甘油三酯的形式儲存在脂滴中,脂滴可以通過水解或自噬來降解。然而,過度攝取脂肪酸或者脂質的轉運障礙會使胞內脂滴富集,導致脂毒性,促使NAFLD的發生,進一步發展為炎癥并可導致NASH。脂毒性和炎癥是促進NAFLD發展的兩個主要因素。mTOR以多條通路參與了肝細胞異常的脂質累積和炎癥的發展。

2.1 調節脂質代謝

肝細胞脂毒性損傷是NAFLD的主要原因及表現。脂滴的清除對于維持肝臟正常功能至關重要。在脂質代謝方面,mTORC1通過2條以轉錄因子為中心的軸驅動脂質合成,分別是膽固醇調節元件結合蛋白1/2(sterol regulatory element-binding protein 1/2,SREBP1/2)和過氧化物酶體增殖激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)[5]。膽固醇調節元件結合蛋白轉錄調控脂質的合成和脂質穩態,其包括三種異構體,其中SREBP-1a激活脂肪酸和膽固醇合成,SREBP-1c激活脂肪酸合成,SREBP-2與膽固醇合成和攝取相關[6]。mTORC1則激活SREBP-1促進脂質的合成[7]。在NAFLD小鼠模型實驗中,學者證實mTORC1可以下調SREBP-1c的抑制因子——細胞周期激酶8(cyclin-dependent kinases 8,CDK8),從而避免SREBP-1c的泛素化降解,實現脂質從頭合成的持續激活[8]。在機制上,mTORC1直接磷酸化下游分子SREBP的抑制劑磷脂酸磷酸酶lipin1并抑制其核進入,促進SREBP上調脂質從頭合成和膽固醇合成的基因,并且通過下調PPARγ活性抑制脂噬、脂肪酸氧化和生酮[9-10]。最近有動物實驗證實中藥豬膽的主要活性成分豬去氧膽酸通過調控PPARα細胞核定位改善肝臟脂質累積[11]。轉錄因子FOXK1也參與了mTORC1下游脂質代謝的調控,在小鼠肝細胞mTORC1激活條件下,與脂質分解代謝相關的4個基因Ppara,Acadm,Decr1和Etfa,以及與脂質合成代謝相關的2個基因Scap和Hacd2,都是FOXK1的直接靶點[12]。

mTOR下游分子眾多,除了通過調節4E-BP1和S6K1等靶點發揮廣泛的作用,同時還控制許多轉錄因子的活性,從而控制基因的表達。因此,僅對少數mTOR靶標進行磷酸化就可以產生廣泛的影響,導致在以mTOR為靶點治療NAFLD等脂質代謝疾病時可能會產生一些額外的效應,因此特異性阻斷肝細胞內調節脂質穩態的mTORC1通路十分有意義。先前有研究揭示在非肝細胞中mTORC1招募底物方式的多樣性,濾泡素(folliculin,FLCN)可以賦予mTORC1底物特異性,FLCN功能突變導致mTOCR1底物轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)和轉錄因子E3(transcription factor E3,TFE3)的持續磷酸化,而不影響經典磷酸化底物S6K1和4E-BP1的激活[13]。FLCN可以和卵泡刺激結合蛋白(folliculin-interacting protein 1,FNIP1)或FNIP2形成復合物,介導RagC或RagD的GTP水解,促進Rag C/DGTP向Rag C/DGDP轉換。而TFEB和TFE3是同源螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix)亮氨酸拉鏈轉錄因子,可調節/參與溶酶體生物發生、自噬和脂質代謝。TFEB和TFE3在饑餓時轉移到細胞核中激活靶基因。在營養充足時,它們被mTORC1磷酸化,被滯留在細胞質中。Gosis等[14]研究表明,通過敲除肝細胞中FLCN可以特異調節TFE3的入核,激活溶酶體基因轉錄,保護小鼠免受NAFL和NASH的困擾。筆者實驗發現,肝臟特異性敲除FLCN對肝臟脂質穩態的多個方面產生有利影響,包括促進脂肪酸氧化和抑制新生脂肪生成;進一步研究發現,FLCN敲除后,TFE3得到釋放進入細胞核,誘導INSIG2抑制SREBP-1c蛋白水解和激活,最終導致脂質從頭合成得到抑制。另一方面,FLCN的缺失會導致TFE3的結合模式和結合強度都發生改變,全基因范圍內,TFE3結合定位于SREBP-1c附近,這種定位位置的接近性不僅不會競爭性地與染色質結合,相反,SREBP-1c的存在反而協同促進了TFE3與靶基因的結合。這一結果也在小鼠中得到證實,肝臟特異性敲除FLCN保護缺乏膽堿和氨基酸的高脂飲食(choline-deficient amino acid-defined and high fat,CDAA-HF)喂養小鼠免受NAFLD和NASH,甚至可以逆轉NAFLD和NASH的脂肪變性水平和炎癥水平。以上研究表明,mTOR通路的激活主要通過轉錄因子SREBP-1c來增加肝細胞異常的脂質累積。

2.2 mTOR與自噬

自噬通過多種方式調節肝臟代謝[15],在NAFLD和脂肪性肝炎等疾病中發揮著關鍵作用[16]。脂滴的自噬降解稱為脂噬,是脂質降解的重要代謝途徑。Singh等[17]首次闡明自噬調節脂質代謝的功能,他們發現,無論在體外肝細胞還是小鼠體內肝臟,抑制自噬都可以增加甘油三酯和脂滴的累積;此外,二者之間還存在反向關系,脂質的異常累積損傷自噬功能,因此形成負性循環,即脂質的累積抑制自噬功能,導致體內脂質的累積進一步增多。Nakadera等[18]進一步證實了這一結論,并闡明了肝脂肪變性引起了囊泡型腺苷三磷酸酶(vacuolar-type adenosine triphosphatases,V-ATPase)下調,通過破壞溶酶體和自噬泡酸化導致自噬功能障礙。作為自噬的中樞調節因子,mTORC1在通過調節脂噬來實現脂滴清除中的作用不可或缺。He等[19]發現,禁食或者高脂飲食誘導小鼠肝臟乙酰輔酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1,ACOX1)的富集,使得胞質中乙酰輔酶A的水平升高,進一步乙?；疪aptor,促進mTOR的溶酶體定位激活,抑制了肝臟累積脂滴的自噬降解,從而促進NAFLD的發展。而在上述Gosis等[14]的研究中,肝臟特異性敲除FLCN不僅促進了脂肪酸氧化,還增加了溶酶體生成。這些研究都表明,在脂質代謝異常條件下mTOR被激活,自噬水平被抑制,導致脂質在肝細胞中進一步累積,從而誘導疾病進展。

2.3 mTOR與炎癥

炎癥的發生是NAFLD發展為NASH的標志,肝細胞脂肪變性和炎癥共同損傷肝細胞正常功能,導致肝組織的慢性損傷。炎癥通常發生在肝脂肪變性之后,一方面,肝細胞脂質的異常累積可以導致炎癥的發生;另一方面,炎癥也會影響肝臟脂滴的清除,擾亂膽固醇代謝,加速脂質累積[20],是NAFLD的獨立危險因素。許多研究都證明了炎癥通過mTOR擾亂脂質代謝,例如,炎癥通過促進mTOR及其下游的磷酸化,增加了脂肪酸轉運蛋白CD36的翻譯效率,促進了脂質的積累[21]。在炎癥小鼠模型和IL-1β刺激的HepG2細胞系中都表現出脂質的累積,mTORC1的沉默抑制了這一現象,表明mTORC1參與了炎癥刺激的脂毒性[22]。mTOR參與了高脂飲食誘導的大鼠發生NAFLD以及棕櫚酸誘導HepG2細胞產生炎癥[23],表明NAFL向NASH的進展過程可能與mTOR的活化相關。干擾素刺激基因(stimulator of interferon genes,STING)識別來源于病原體或細胞內異常的雙鏈DNA,激活下游IRF3、NF-κB等信號通路,刺激干擾素和炎癥因子的轉錄[24]。多項研究揭示了NAFLD患者以及高脂飲食誘導的肝脂肪變性小鼠肝組織STING的表達增加,STING的敲除緩解了炎癥狀態,減少了肝細胞中脂質的沉積,表明STING在NAFLD炎癥的發生中具有重要作用[25-27]。同時,另有研究表明STING的激活還參與了mTORC1調控的脂滴自噬降解,STING1直接參與mTORC1的形成,此過程依賴自噬相關蛋白SQSTM1[28]。以上結果都證實了mTOR在炎癥促進脂質積累中發揮了重要作用,反過來從單純的脂肪變性到肝臟炎癥的具體機制還有待進一步研究。

3 總結

關于NAFLD的發病機制,近年來取得了許多研究進展,包括表觀遺傳、肝細胞內的信號通路、肝臟內的細胞互作等;隨著對NAFLD研究的逐漸加深,越來越多的證據表明NAFLD患者廣泛合并代謝紊亂特征。mTOR作為調控代謝的樞紐,在NAFLD發展過程中的重要作用被不斷揭示:一方面,mTOR調控細胞脂質的合成與分解,加重脂質累積;另一方面,自噬作為一種細胞降解途徑,被感知細胞營養而激活的mTOR抑制,導致脂噬的減少,進一步加重脂質負擔,促進NAFLD的發生。炎癥是促使NAFLD發展的關鍵因素,多項研究證實mTOR還參與了炎癥因素導致的脂質代謝紊亂。此外,多篇研究指出mTOR在NAFLD向肝細胞癌進展的過程中也發揮了關鍵作用[29-30]。綜上所述,以mTOR為靶點有望成為NAFLD治療的新切入點。