非小細胞肺癌免疫治療療效相關生物標志物研究進展

鄭健宏，田琳，趙沛妍，李慧，程穎,4

0 引言

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者約占肺癌患者的87%，但其中僅有16%的患者診斷時分期為Ⅰ期[1]，約80%的NSCLC患者確診時已處于中晚期，遠處轉移患者的5年生存率不到5%[2-3]。以免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）為代表的免疫治療深刻改變了晚期NSCLC臨床治療策略，相較于傳統的組織活檢，近年來血液檢查技術突飛猛進，并在療效預測中展示出相當的潛力。在免疫治療大背景下，尋找有效的療效預測生物標志物實現精準、個性化治療已迫在眉睫。

1 組織樣本

1.1 PD-1/PD-L1

目前多個程序性死亡受體1/配體1（PD-1/PD-L1）抑制劑單藥研究如：Checkmate-017/057、Checkmate-078、KEYNOTE-024、EMPOWERLungⅠ及Ⅱ期、POPLAR和Ⅲ期OAK[4]都表明：PD-L1腫瘤細胞陽性比例分數≥50%的NSCLC患者更能從免疫治療中獲益，PD-1/PD-L1可以作為免疫治療療效預測生物標志物。然而PD-1/PD-L1水平與免疫治療效果并非一定具有相關性，如Troiano等[5]研究發現PD-L1表達水平在口腔鱗癌中與ICIs反應及總生存期（OS）并不具備相關性。不平行的原因可能與抗體檢測標準不統一、PD-1/PD-L1表達具有動態性、不同部位樣本PD-L1表達存在異質性有關[6]。針對PD-L1表達的異質性及動態變化，液體活檢技術或許可以提供助力。Janning等[7]在一項NSCLC患者循環腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTCs）中PD-L1表達與免疫治療療效關系的研究中發現，隨著PD-1/PD-L1抑制劑的治療，腫瘤細胞中PD-L1表達發生動態變化，與單次活檢結果具有顯著差異，CTCs可以較好地反映腫瘤的異質性。Spiliotaki團隊[8]則充分利用液體活檢技術的便捷性，靈活監測NSCLC患者免疫治療過程中PD-L1、Ki67水平，及時調整臨床治療方案。伴隨液體活檢技術的不斷進步，未來PD-1/PD-L1將成為更“完美”的生物標志物。

1.2 腫瘤突變負荷

腫瘤突變負荷（tumor mutation burden, TMB）是指在一個特定腫瘤組織中相對的基因突變數量，理論上突變數量越多，越易激發機體免疫。多項研究提示高TMB與較長的無進展生存期（PFS）有關[9-10]?；谶@些研究成果，2019第1版美國國立綜合癌癥網絡指南將TMB列為納武利尤單抗單藥或雙藥聯合免疫治療NSCLC療效預測生物標志物。與此同時，POPLAR和OAK研究[4]回顧性分析發現血液TMB和組織TMB水平具有相關性，超過1 000例接受阿替利珠單抗治療的患者中，血液TMB≥16 mut/Mb的患者具有更長的PFS，血液檢測方法極大地拓展了TMB在臨床實踐中的應用。然而自“出道”以來，TMB卻飽受質疑，Reck等[11]在以OS作為主要終點的前瞻性研究中，TMB的療效預測作用未能得到充分證實。未來TMB若想成為可靠的療效預測生物標志物并廣泛使用，仍需克服包括截止值設定、統一分析方法在內的多個障礙。

1.3 DNA錯配修復及微衛星不穩定性

DNA錯配修復（mismatch repair, MMR）系統可識別并修復核苷酸堿基錯配，是基因組完整性的關鍵守護者。該系統是由多種MMR蛋白（MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS1、PMS2）構建而成，若其中一種或多種MMR蛋白表達缺失（deficient mismatch repair, dMMR），可以引起微衛星不穩定（microsatellite instability, MSI），若錯配修復系統中不顯示突變則被稱為錯配修復完整（proficient mismatch repair,pMMR），主要見于微衛星穩定（microsatellite stable, MSS）。文獻報道，MMR表達水平與預后密切相關，dMMR患者具有比pMMR患者更良好的預后[12]。臨床實踐中，可通過免疫組織化學檢測MMR蛋白表達情況來反映MSI狀態[13]。Le等[14]研究發現，無論腫瘤類型如何，MSI都與免疫治療的反應密切相關。2017年FDA首次基于生物標志物數據批準帕博利珠單抗用于MSI-H、dMMR晚期實體瘤治療。盡管MSI是一種較為廣泛的癌癥表型[15]，但在肺癌中的發生率較低，一項納入480例肺腺癌患者的研究發現，僅有0.8%（4/480）的患者表現出MSI-H，主要見于有吸煙史的Ⅰ期患者[16]。另一項研究結果表明，存在dMMR的NSCLC組織內有大量的免疫細胞浸潤，且T淋巴細胞表面的免疫檢查點分子PD-1/PD-L1高表達。因此，針對此類NSCLC患者采用免疫檢查點抑制劑治療，尤其是抗PD-1/PD-L1治療獲益的可能性更大[17]。即使目前dMMR及MSI-H在NSCLC免疫治療中的研究有限，但是二者作為免疫治療的生物預測標志物仍然值得關注。

1.4 腫瘤新抗原

腫瘤新抗原（tumor-specific antigens, TSA）是腫瘤細胞因基因組突變而產生的腫瘤特異性抗原，TSA產生與DNA損傷修復基因及抗原呈遞基因的突變受損有關[18]。與一般抗原相比，TSA更具腫瘤特異性，是個性化及精準治療的理想靶點，且針對TSA的治療，后續發生結腸炎、腎功能損害等自身免疫毒性的比例更低[19]。Rizvi等[20]在使用PD-1抗體治療NSCLC患者研究中發現了與TSA的三個相關：一是獲得持久性臨床受益的患者與TSA高負荷相關；二是PFS的改善與TSA高負荷相關；三是腫瘤耐藥性與TSA突變丟失相關?；赥SA特異性、少毒性等突出優勢，TSA可作為免疫治療療效預測的有效指標之一，圍繞TSA的免疫治療策略研究也已成為臨床熱點。

1.5 腫瘤浸潤淋巴細胞

腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）是腫瘤間質中的異質性淋巴細胞，包括T細胞、B細胞及NK細胞等，是機體淋巴細胞侵入到腫瘤組織中，并對腫瘤起識別、抵抗和攻擊作用的細胞群體[21]。一篇綜述中提到兩項關于TIL的研究[22]，一項對410例肺癌患者進行的回顧性研究發現，腫瘤浸潤T淋巴細胞豐度高的患者經免疫治療后具有較長的無疾病進展期和總生存期。在另一項研究中，研究者根據淋巴細胞浸潤程度，將腫瘤分為炎癥型（高淋巴細胞浸潤型）、沙漠型（低免疫細胞浸潤型）、排除型（免疫豁免型）和抑制型4種免疫類型，其中免疫炎癥型患者免疫治療臨床獲益更大，而免疫沙漠型則無明顯治療效果。這些研究結果證明高TIL可能是NSCLC療效預測及預后的有效生物標志物。與此同時，NSCLC免疫微環境中的浸潤型淋巴細胞亞群可能會隨著腫瘤的發生、發展而改變，且目前TIL沒有統一的檢測方法，針對這些局限性還需要深入研究。

2 液體樣本

與組織樣本活檢相比較，血液等液體樣本具有易獲取、創傷小、可多次取樣等特點，可以連續評估患者病情變化。鑒于組織樣本在預測ICIs反應方面存在的局限性，增加循環生物標志物作為聯合證據或將進一步提高免疫治療療效的預測作用，對患者病情判斷也更為精準。

2.1 循環免疫細胞

2.1.1 TCR免疫重排 T細胞抗原受體（T cell receptor, TCR）是T細胞識別外來抗原并與之結合引起機體免疫應答的特異性受體，可表達于成熟的T細胞表面。健康人群未受到疾病或抗原壓力的作用，TCR呈現多克隆狀態，疾病狀態下，TCR可選擇性重排列，呈現單克隆或寡克隆狀態，引起重排的原因可能與疾病或抗原增加導致某種T細胞亞群選擇性擴增有關。在一項探討初治NSCLC患者治療前后免疫功能變化的研究中發現，相較健康人群，NSCLC患者的TCR免疫組庫多樣性較低，且腫瘤直徑大（3 cm為截斷值）的患者免疫組庫多樣性更低。經治療后，NSCLC患者外周血TCR免疫組庫發生重建，治療前TCR多樣性高和治療后TCR多樣性增加的患者具有更長的PFS[23]。該研究提示我們可以通過分析腫瘤患者的TCR庫判斷免疫系統對腫瘤的殺傷情況，TCR免疫組庫對腫瘤的免疫治療療效預測及預后判斷具有一定價值。Han等[24]通過對外周血PD-1+CD8+T細胞中TCR多樣性和克隆性的研究也證實了TCR免疫組庫多樣性可作為預測臨床療效的指標之一。其機制可能是具有更高多樣性的TCR庫為機體提供了更多識別TSA的機會，體內更高比例的T細胞被激活，參與免疫系統對腫瘤的殺傷，從而提高免疫反應，獲得更好預后。He等[25]針對TSA開展了個性化免疫治療研究：利用患者體內天然存在的Tas細胞的TCR改造T細胞，改造后的T細胞精準靶向其腫瘤中的TSA，可以有效的治療自體腫瘤。這種用Tas-TCR改造的TCR-T細胞是個性化免疫治療極具前途的藥物，同時也再次證明TSA可作為免疫治療療效預測的有效指標。

2.1.2 Tregs細胞 調節性T細胞（regulatory T cells, Tregs）具有免疫抑制作用，與惡性腫瘤患者的低免疫水平相關，其可以在腫瘤微環境中通過細胞之間的直接接觸和旁分泌釋放抑制性的細胞因子，負性調節機體免疫反應，從而避免自身免疫疾病的發生，維持免疫穩態。De Simone等研究發現，腫瘤相關Tregs細胞表面表達特異性分子，如白介素1受體2（interleukin-1 receptor type 2, IL1R2）、PD-L1/PD-L2和趨化因子受體8（chemokine receptor 8, CCR8），發揮免疫抑制作用，與患者的預后呈負相關[26]。然而也有研究表明，Tregs高水平與患者更長的生存期有關。Koh等[27]研究發現，在晚期NSCLC患者中，Tregs細胞頻率較高患者的PFS和OS較長，特別是抗PD-1治療后，Tregs細胞高頻率患者與低頻率患者相比，PFS和OS存在較明顯的差異?？筆D-1治療后Tregs水平升高的原因可能與防止機體免疫系統被激活而造成長期過度免疫有關。此外，Tregs可通過釋放轉化生長因子-β（TGF-β）發揮免疫調節作用，de Miguel-Perez等[28]研究發現TGF-β與ICIs無反應及較短的PFS和OS有關，且TGF-β可通過提高PD-L1表達從而促進腫瘤的免疫逃逸。以上證據表明Tregs和TGF-β聯合可能作為NSCLC免疫治療療效預測生物標志物。

2.2 細胞因子與可溶性蛋白

2.2.1 IL-6及IL-8細胞因子 IL-6及IL-8細胞因子是一種半衰期較短的可溶性小分子信號蛋白，參與機體免疫增殖、分化、效應功能調節等幾乎所有類型的細胞反應，對于免疫系統抗腫瘤作用至關重要。IL-6由T、B淋巴細胞及單核細胞產生，是一種同時具有促炎性和抗炎性的細胞因子，不僅介導機體炎性反應和抗感染，還與部分惡性腫瘤的發展轉移相關。在一項入組125名患者的臨床研究中[29]，首次證明外周血IL-6水平可以預測晚期NSCLC患者ICIs治療反應。IL-6低水平（＜13.1 pg/ml）患者客觀緩解率和疾病控制率明顯高于IL-6高水平的患者，且PFS和OS也顯著延長。Keegan等[30]則利用單分子陣列技術，精確定量47名NSCLC患者抗PD-1治療過程中血清和血漿細胞因子水平，發現IL-6水平的降低與PFS的改善有關，IL-6的變化程度在最佳總體反應類別之間不同（P=0.01），并與C反應蛋白（CRP）水平的變化相關。該研究再次證實血漿IL-6的降低與抗PD-1治療改善NSCLC的預后相關，同時也證明血漿IL-6水平和CRP水平變化具有相關性。

除IL-6外，IL-8表達水平也與患者免疫治療療效相關。Kauffmann-Guerrero等[31]在一項納入29例晚期NSCLC患者的前瞻性研究中發現，與IL-8低水平組（截斷值為19.6 pg/ml）相比，IL-8高水平組PFS不佳（mPFS為4.0個月vs.19.7個月，P=0.03），提示IL-8高水平可能是晚期NSCLC患者免疫療效的負性標志物。另外一項納入38例晚期NSCLC患者的研究獲得了同樣的結論，IL-8低水平組與持久的臨床獲益（PFS≥6個月）相關[32]。此外，鑒于IL-8水平與腫瘤負荷具有一致性，且變化發生在患者影像學改變前，因此通過監測液體樣本IL-8水平能早期監測腫瘤負荷變化，可識別出患者腫瘤是否發生假性進展。綜上，外周血IL-6、IL-8基線及治療過程中的動態變化水平可作為預測NSCLC患者免疫治療療效的潛在標志物。目前，相關研究存在樣本量少、檢測方法缺乏統一標準等問題，因此基于細胞因子作為免疫治療預測標志物的研究仍需進一步驗證。

2.2.2 干擾素-γ與IL-10比率 干擾素-γ（IFN-γ）和IL-10是參與調節T細胞活性的兩種關鍵細胞因子。IFN-γ參與調節腫瘤微環境中多種免疫細胞功能，如促進輔助性T細胞1（Th1）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）、自然殺傷細胞（NK）、樹突狀細胞（DC）和巨噬細胞活性，促進抗原呈遞，促進CD4+T細胞的特異性活化，抑制CD4+CD25+T細胞的免疫調節活性[33]。IL-10則一方面激活NK細胞，增強細胞毒作用，另一方面又促進腫瘤細胞免疫逃逸。Giunta等[34]收集了18例連續接受PD-1治療的晚期黑色素瘤患者的外周血樣本，發現IFN-γ/IL-10比值在有響應患者中更高，無響應患者與有響應患者相比存在顯著差異，IFN-γ/IL-10比值較單獨檢測IFN-γ核酸水平更能預測抗PD-1療效。研究證明IFN-γ/IL-10比值與晚期黑色素瘤患者免疫治療反應之間存在相關性，究其原因，可能是這對具有相反作用的細胞因子之間相互平衡，顯示出了比單一細胞因子更真實的免疫調節特征。此外，有研究發現IFN-γ/IL-10比值可以作為區分腎移植排斥患者和非排斥患者的體外評判標準，排斥反應患者IFN-γ/IL-10比值升高，移植功能穩定的患者IFN-γ/IL-10比值降低，間接反映出IFN-γ/IL-10比值高與免疫功能增強有關。在肺癌領域，Limagne等[35]開展了一項前瞻性研究，使用納武利尤單抗治療轉移性NSCLC患者（n=61），并分別在治療前、治療15天和30天后分析髓系和淋巴系標志物，數據表明，CD8+T細胞產生IFN-γ的能力降低與骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSC）浸潤數目增多及T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3（TIM-3）表達升高有關。這一結果為PD-1聯合抗TIM-3或耗竭MDSC細胞治療以提高肺癌免疫治療應答率提供了參考價值。目前，將細胞因子比率作為潛在標志物的研究較少，研究的樣本量也較小，未來需要在更大的患者群體中加以驗證。

2.2.3 乳酸脫氫酶 沃伯格效應（Warberg effect）是腫瘤細胞特殊的代謝方式。即使在氧氣充足的環境中，腫瘤細胞仍會優先通過糖酵解途徑產生能量，使乳酸和丙酮酸二者濃度高于正常組織[36]。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）作為機體葡萄糖代謝通路的重要輔酶，腫瘤患者體內水平要顯著高于健康人群，LDH表達與腫瘤血管生成、免疫逃逸、細胞代謝息息相關。Van Wilpe等[37]研究提示糖酵解增強和低氧的微環境對抗腫瘤免疫治療具有負面影響，廣泛的文獻數據也證實了這一觀點，LDH抑制狀態下多種腫瘤細胞呈現出增殖減弱，如胰腺癌、宮頸癌、頭頸癌等。Kazandjian等[38]對4 914名轉移性非小細胞肺癌（mNSCLC）患者的臨床數據進行了匯總分析，結果表明無論mNSCLC患者采用何種治療方式，基線LDH水平都是重要的預后生物標志物。Amin等[39]在晚期黑色素瘤患者中進行了一項為期6周的誘導治療，聯合使用BRAF和MEK抑制藥物，結果顯示大多數患者的LDH可下降至正常水平。綜上，LDH水平可以作為療效預測生物標志物，在治療策略上，針對LDH水平升高的患者，同時抑制免疫檢查點及血管內皮生長因子，或許為可行之路[40]。由于LDH是一種胞漿酶，只有在細胞膜受損時才進入血液，因此血清LDH水平能否真實反映腫瘤LDH表達情況還需要進一步探索。

2.3 循環腫瘤DNA

外周血循環腫瘤DNA（ctDNA）是由腫瘤細胞凋亡、壞死或主動分泌至循環系統所致，與腫瘤組織DNA具有高度一致性。在NSCLC發生發展多個階段，ctDNA展現出包括療效評估、預后判斷、復發監測等多種價值[41]。在早期篩查階段，由于NSCLC的ctDNA半衰期通常為35分鐘[42]，因此ctDNA檢測可以實時反饋當前體內腫瘤負荷情況，實現腫瘤早診目標。在疾病進展期，相較于腫瘤組織樣本，ctDNA可以較易獲得，可用于檢測腫瘤分子特點，發現腫瘤分子異質性[43]。根治術后，如尚有微小病灶殘留，ctDNA作為分子表現形式可被檢測到，可作為監測疾病復發的指標，也可用于篩選術后輔助治療最佳獲益人群，對患者進行預后分層。在靶向治療、免疫治療過程中，ctDNA可作為生物標志物預測并評估療效，篩選可以長期獲益的患者群體[44]。相較于影像學變化，ctDNA應答時間更早（24.5 dvs.72.5 d）[45]，檢測外周血ctDNA情況可以對腫瘤治療療效盡早判斷，利于臨床醫生決策。此外，血漿ctDNA水平存在瘤種差別，在中樞神經系統原發惡性腫瘤及轉移瘤患者中，血漿ctDNA水平通常比非中樞神經系統實體瘤患者低，可能是由于血腦屏障限制了ctDNA和CTCs在血液中的循環[46]。此種情況下，非血液途徑ctDNA展示出了獨特優勢，如腦脊液ctDNA可用于診斷軟腦膜疾病，ctDNA與細胞游離DNA的比率要高于血漿等等。但同時也存在著難以獲得大量樣本或重復樣本、樣本收集處理缺乏統一標準等問題。

3 腸道微生物菌群

腸道微生物菌群因其編碼基因總量巨大而備受關注。2020年，腫瘤學年鑒雜志公布的一項研究數據表明[47]，NSCLC患者接受免疫治療期間同時使用抗生素（antibiotics, ATB）治療與未使用ATB治療的患者相比，OS顯著縮短（8.5vs.14.1個月，HR: 1.32, 95%CI: 1.06～1.63,P=0.01），同樣在阿替利珠單抗組中使用質子泵抑制劑（proton pump inhibitors, PPI）治療的患者與未使用PPI的患者相比，OS也顯著縮短（9.6vs.14.5個月，HR:1.45, 95%CI: 1.20～1.75,P=0.0001），產生明顯差異的原因可能與使用抗生素殺滅腸道菌群有關。Jin等[48]納入37名使用納武利尤單抗治療的晚期NSCLC患者，發現對治療有反應者的腸道菌群多樣性明顯高于無反應者，且成分穩定，與多樣性較低的患者相比，腸道菌群多樣性較高的患者PFS明顯延長。綜上，腸道微生物菌群可作為NSCLC免疫治療療效潛在生物標志物進行探索。由于現有的檢測手段無法深入到腸道菌群“屬”以下，因此，腸道菌群與免疫治療療效相互影響的機制還需要更深入的研究。

4 小結與展望

NSCLC免疫治療療效預測生物標志物主要包括組織樣本和液體樣本兩大來源，二者各有其優勢與不足。其中組織樣本作為傳統檢測來源，證據多、應用廣，目前仍是臨床檢驗的“金標準”，不足之處一是樣本來源受限，部分患者無法取得足夠的組織樣本進行檢測；二是腫瘤組織異質性強，存在明顯的動態表達差異，影響后續的療效預測及臨床用藥；三是除經典試驗外，目前組織標本缺乏更新穎、更深層次的研究。與組織樣本相比，液體樣本的優勢在于微創、便捷、易于動態監測，未來具有廣闊的研究前景和探索空間，不足之處一是液體檢測的標準操作程序還需進一步統一與規范；二是當前涉及液體標本的研究大多為回顧性或小樣本研究，存在一定的局限性。

在單個指標預測準確性不高的情況下，多項生物標志物聯合作為綜合證據或將提高預測效能與準確性，更好地篩選出對免疫治療有反應的患者。鑒于患者的個性化差異，合理的選擇生物標志物或者標志物組合進行療效預測，將幫助更多的NSCLC患者從免疫治療中獲益。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。