影響實驗動物視網膜電圖結果穩定性的因素及對策

金昱，梁麗娜，李佳賢，周維，許凱

如今，中醫眼科學的研究不再局限于以經典校注、病證結合、辨證論治和臨床觀察為主的傳統模式，也發展出了運用設計良好的基礎實驗與臨床循證研究相結合的現代科研體系。中醫證候動物模型在中醫基礎實驗中已經有了很大發展，而動物光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）、眼底彩照等活體指標的應用讓中醫眼科學的基礎研究又向前邁進一步，其中，視覺電生理檢查是對眼功能活體指標的豐富。臨床常用的視覺電生理檢查項目包括視覺誘發電位（visual evoked potential，VEP）、視網膜電圖（electroretinogram，ERG）、多焦視網膜電圖（multifocal electroretinogram，mf ERG）和眼電圖（electro-oculography，EOG），ERG 又可分為閃光ERG 和圖形ERG。ERG 可用于研究各種視網膜疾病及其潛在機制，如視網膜色素變性、慢性高眼壓[1]、視神經病變[2-3]、青光眼[4]等，也可作為評判藥物及干預措施療效的重要指標、用于研究視網膜的基本生理學?？蛇M行ERG 實驗的物種多樣，包括嚙齒動物[5]、貓、狗、家兔[6]和非人類靈長類動物等。但該活體結果的采集在操作中具有較大難度，電極、麻醉狀態、刺激強度和持續時間等檢測條件的變化，使得ERG 產生的波形會出現基線不穩、雜波較多等情況，影響數據的準確性，對后續數據分析造成困擾，故檢測時常建議雙眼對照檢查，如何提高ERG 結果的穩定性這一問題亟待解決?；诖?，本文對眼科動物實驗中影響ERG結果穩定性的因素進行綜述，并論述相應的解決方案，現報道如下。

1 影響ERG穩定性的因素及解決方案

1.1 電極

劣質電極會產生不穩定或有噪聲的波形[7]。YIP YWY等[8]將帶有放大器的定制活性電極與標準惰性ERG 電極記錄下的電圖質量進行對比，對動物注射氯胺酮、甲苯噻嗪和乙酰托馬嗪麻醉，在所有超閾值刺激強度下，活性電極的暗適應a波、b波振幅較高，但僅在-3.25～-1.00 log cd.s.m-2范圍內差異有統計學意義；明適應也有相同趨勢，在-0.75～0.48 log cd.s.m-2范圍內差異有統計學意義。與惰性電極相比，活性電極的變異系數（coefficient of variation，CV）和重復系數（coefficient of repeatability，CR）較低，a 波、b 波參數的組內相關系數（intra-class correlation coefficient，ICC）較高，噪聲顯著降低，可在較低的刺激強度下記錄信號，即活性電極的重復性、重現性和可靠性均較好。

BAYER AU 等[9]使用成年C57 BL/6小鼠和Wistar大鼠進行ERG 檢測（Ganzfeld 或頻閃光刺激的暗適應及明適應），對便捷程度、角膜上皮損傷程度、參數的幅度、再現性、雙眼準確性和可靠性等方面進行評價。電極選用單極金絲隱形透鏡電極（contact lens electrode，CLE）、棉芯銀-氯化銀電極（cotton-wick silver-silver chloride electrode，CSCE）、DTL 纖維電極（DTL fiber electrode，DTLE）和圓形不銹鋼絲電極（stainless steel wire electrode，SSE），并觀察安裝電極的難易程度，使用熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）評估ERG 記錄后動物角膜的磨損情況。結果顯示，CLE 電極具有較大的暗視振幅和振蕩電位，并且在分析測試-再測試數據時，顯示出最佳的一致性。然而，安裝CLE 電極所需時間最長。使用SSE 電極會導致小鼠角膜磨損最嚴重，而CLE 電極則幾乎不會造成大鼠角膜損傷，并且允許長時間操作。因此，使用CLE電極可以獲得較大的振幅和更高的再現性，但正確放置電極在角膜上的位置非常重要。國際臨床視覺電生理學會（international society for clinical electrophysiology of vision，ISCEV）編寫的《ISCEV 全視野臨床視網膜電圖標準（2015年）》[10]建議電極的位置與角膜或附近的球結膜接觸。研究[11]顯示，振幅隨電極距離角膜頂點的距離增大而減小。1 項臨床試驗[12]招募了13 名年齡在13～64 歲之間的正常對照受試者（視力均為1.0），當DTLE放置在結膜囊深處時，閃爍光反應降低約20%～25%；在角膜上時，差異范圍為8%～27%；在結膜穹窿中時，差異范圍為10%～25%。故研究者認為，應確保在多次記錄中將電極放置在相同位置，記錄期間盡量保持其穩定且不移動，而電極本身放置位置對ERG的診斷準確性影響較小。

解決方案參考如下，（1）選擇高質量的電極：使用定制的活性ERG 電極，其噪聲較少，可以記錄較低刺激強度下的反應，產生更大的信號幅度且具有可重復性。目前，美國Diagnosys 公司的ESPION 型視覺電生理檢測系統已應用于臨床[13-14]，可以進行多種檢測，包括VEP、mfERG。其動物實驗中[15]可以根據不同的實驗需求使用不同的電極，碗狀電極能夠緊貼角膜表面，而且無需接地線，簡化了實驗操作流程。（2）合理放置電極：在記錄過程中，要確保電極每次的位置固定并緊密貼合角膜，避免空泡，減少噪聲和不穩定性。同時，要注意保護角膜，可以使用玻璃酸鈉滴眼液、羧甲基纖維素鈉滴眼，以減輕電極對角膜損傷并降低干擾。

1.2 介質的應用

在大鼠ERG 記錄中，常使用玻璃酸鈉滴眼液或0.9%氯化鈉溶液等導電液介質來提高導電性，減少金屬電極對角膜上皮的損傷。然而，在實際操作中，過量使用玻璃酸鈉滴眼液可能會影響電信號。戴旭鋒等[16]將大鼠分為干燥組、適量組和過量組，適量組滴加了少量玻璃酸鈉滴眼液，但保持角膜基本干燥；過量組滴加了大量玻璃酸鈉滴眼液，使整個結膜囊充滿。實驗設置暗適應ERG 的刺激強度為3.0 cd·s·m-2，單次閃光刺激持續時間5 ms，刺激之間間隔1 min，通頻帶設置為1～100 Hz，觀察了b 波峰時和幅值。結果顯示，干燥組的電圖基線不穩定，適量組和過量組的基線相對穩定，但過量組中有2 只大鼠出現波形阻滯情況。b 波峰時3 組之間的差異無統計學意義。在幅值方面，干燥組和適量組沒有明顯差異，但過量組的波幅較另外2 組降低，差異有統計學意義。

解決方案參考如下，玻璃酸鈉滴眼液的使用確實可以降低干擾，但過量使用會影響ERG 振幅大小。因此，在ERG 檢測過程中，導電液的使用量以保持球結膜和瞼結膜微微濕潤為宜。

1.3 電噪聲與次聲

來自環境或其他設備的電噪聲會干擾電生理檢測，導致波形不穩定或有噪聲，如邱萍等[17]給予實驗組大鼠8 Hz、130 dB 的SPL 的次聲暴露，并在各個時間點進行電生理檢測，次聲壓力艙艙內各空間點次聲的頻率和聲壓級水平保持一致，該電激勵式次聲壓力艙系統為研究者自主研制。對照組每日置于次聲艙中不接受次聲暴露。結果顯示，在次聲暴露1 d后電生理改變以a波為主，而在4 d、7 d的電生理檢查中，b 波的下降反超a 波，暴露時間進一步延長，振蕩電位（oscillatory potentials ，OPs）波的振幅異常成為主要變化，說明次聲在不同的暴露階段對視網膜各層的影響不一。

解決方案參考如下，通過使用高質量的電纜并正確連接設備，將電噪聲降至最低。檢測時應無電噪聲源，如熒光燈等。

1.4 麻醉藥物

麻醉是許多動物實驗的必要過程，針對不同的實驗操作可以選擇不同的麻醉方式。846 合劑又稱速眠新注射液，是鹽酸二氫埃托啡和氟哌啶醇、賽拉唑、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的復方制劑，有鎮靜、催眠、肌松、鎮痛等綜合作用。侯豹可等[18]對比觀察了4 種麻醉藥物（速眠新846、烏拉坦、戊巴比妥、氯胺酮）對大鼠視覺電生理的影響，藥物均能達到全麻的效果，誘發出ERG 和VEP 的波形，但麻醉效果和波形存在差異。速眠新組進入全麻狀態時間短，肌肉松弛作用好，麻醉持續時間較長，操作過程中狀態較穩定，大鼠麻醉后眼球突出明顯，有利于放置角膜電極。烏拉坦、戊巴比妥麻醉起效時間長，肌肉松弛作用一般。烏拉坦麻醉后，大鼠眼瞼不能完全張開，眼球不突出，放置角膜電極時可能存在困難。同時，該藥對生理狀態的影響較大，實驗后2～3 d 大鼠仍處于頻繁昏睡狀態。使用氯胺酮麻醉效果不佳，肌肉松弛作用差，麻醉持續時間不長，長時間檢查時需補藥。對于電生理數據（暗適應ERG 光強為3.5 cd·s·m-2），烏拉坦的b 波潛伏期最長，氯胺酮最短；速眠新組OPs O2波幅值最高，戊巴比妥組最低；明適應ERG 和20 Hz 閃爍反應氯胺酮組b 波幅值最高，閃光視覺誘發電位烏拉坦組大鼠P100潛伏期普遍較長，氯胺酮組大鼠普遍較短。在小鼠實驗中[19]，當注射2.5 mg/kg 或5.0 mg/kg氟哌啶醇時，ERG 沒有顯著變化，注射量超過20 mg/kg 時b 波的振幅會顯著降低。與該結果類似的是，GJ?RLOFF K等[20]采用分級劑量的芬太尼（0.05～4.00 mL/kg）對家兔進行麻醉，推薦誘導全身麻醉的劑量為0.50～1.00 mL/kg，1.00 mL/kg接近致死劑量。另有研究者探究氯胺酮與烏拉坦對家兔視覺電生理的影響[21]，二者在暗適應OPs 波的比較中未見明顯差異，但氯胺酮暗適應b 波潛伏期和a 波幅值較低，O2幅值、明適應b波幅值和30 Hz閃爍反應P2幅值均較高。

解決方案參考如下，麻醉狀態不佳會影響動物的自主呼吸節律，肌肉無法放松，對電生理波形穩定性非常不利。麻醉方案應針對動物物種及個體進行優化，在整個記錄過程中監測麻醉深度。文獻[18]報道稱采用速眠新846 全麻狀態時間短，肌松作用好，麻醉持續時間較長，大鼠麻醉后眼球突出明顯，有利于加裝角膜電極，在進行電生理檢查的過程中較穩定。動物麻醉加入肌肉松弛劑、鎮靜劑的復合麻醉劑利于實驗者操作及檢驗過程的平穩進行。

1.5 刺激光頻率和光強度

在蛙眼及人眼中，去除視桿系統對視錐系統的抑制，明適應閃光ERG 的幅值增高[22]。有研究[23]將大鼠明適應10 min 后（背景光強37.00 cd·s·m-2），記錄不同刺激頻率和不同刺激光強下的ERG 數據，發現低頻（≤10 Hz）時視桿系統的活動會夾雜在電生理反應中，隨頻率的升高而減少；但頻率≥25 Hz 時，波形不再穩定且幅值較低。改變刺激光強度，波幅會有規律性改變，在低于3.5 cd·s·m-2時，呈正相關。因此，該研究者認為在明適應閃爍ERG 檢查中，應用15～20 Hz 光頻率、3.5 cd·s·m-2的刺激光強度分離出的視錐系統功能較好。該研究團隊[24]通過改變不同通頻帶和不同光強刺激，探討小鼠ERG 的OPs 檢查最適合的通頻帶及閃光強度，先在不同通頻帶下記錄OPs，找出小鼠最適宜指標，在此基礎上，改變光強度，再次記錄OPs。結果顯示，在通頻帶75～300 Hz時，OPs幅值和潛伏期最為穩定；OPs幅值與光照強度呈正相關，而O2波的潛伏期呈縮短趨勢，在2.0 cd·s·m-2（標閃）光強條件下相對穩定。

解決方案參考如下，根據實驗室具體環境確定波形最穩定的光頻率及光強度，可參考文獻[23]中數據：大鼠應用15～20 Hz 頻率、3.5 cd·s·m-2強度的刺激光；小鼠視覺電生理檢查時[24]，其振蕩電位的閃光強度應為2.0 cd·s·m-2（標閃），通頻帶應為75～300 Hz。

1.6 眼球運動偽影

動物的眼球運動會導致電極移動，影響波形穩定。猜測是由于眼球運動影響角膜電極與角膜貼合緊密度，二者間產生空隙，導致信號傳導出現波動。

解決方案參考如下，為了最大限度地減少眼球運動造成的影響，檢測過程中穩定動物的頭部和眼睛至關重要，可以使用定制的頭部固定器或咬桿來達到固定目的。

1.7 信號放大不足

該因素屬于系統參數設置問題，如果信號放大不足，則記錄的波形可能過于微弱或嘈雜，無法進行分析。

解決方案參考如下，可以通過調整設備上的參數來優化放大信號，可能需要增加信號處理軟件中的放大倍數。實驗室應根據各自實驗環境調整具體參數，建立自身的最適宜、最穩定的參數指標。

1.8 時間節律

由于嚙齒類動物存在特殊的時間節律，有研究[25]選取昆明小鼠、BABL/C 小鼠和C57BL/6J小鼠，測量小鼠在6個時間區間（4:00～8:00、8:00～12:00、12:00～16:00、16:00～20:00、20:00～24:00、24:00～4:00）的ERG 數據，按照《ISCEV 全視野臨床視網膜電圖標準（2022 年）》[26]中的方案，記錄暗適應ERG、最大混合反應、明適應的數據。結果顯示，小鼠在夜間活動頻繁，進入麻醉狀態的時間明顯延長；ERG 也表現出較為規律的節律性，其中b 波幅值在20:00～24:00 達到最高，4:00～8:00 開始下降，在12:00～16:00 幅值最低。但明適應b 波和暗適應b波節律性相反。這可能與小鼠這一物種的活動規律有關，可見時間節律能影響小鼠視覺電生理檢查的穩定性。

解決方案參考如下，為了便于實驗的可重復性和各實驗結果之間的對比，小鼠電生理檢查時應考慮時間節律對視覺電生理的影響，在實驗設計時應盡量保證在同一時間段檢測ERG。

1.9 患視網膜疾病的動物

視網膜變性動物的視網膜細胞可能無法產生穩定的電信號，從而導致波形不穩定[27]。

解決方案參考如下，在患有視網膜疾病的動物模型[28]中，可能需要使用不同的記錄技術或調整記錄參數以獲得可靠的記錄。

2 小結

為提高數據的可靠性，在動物ERG 檢測的過程中，首先應確保周圍環境安靜，減少環境噪聲及電噪聲；麻醉藥物應在安全的同時保證實驗動物肌肉松弛，呼吸有節律，麻醉時間保證能夠完成ERG 檢測全過程。其次，連接設備時應確保電極與動物角膜緊密貼合，并盡量保證每次電極放置位置相同，導電液以角膜結膜濕潤為宜。在進行實驗前，根據實驗動物種類不同及具體實驗室環境，摸索最適宜的通頻帶、光照頻率及強度，分析相關的軟件參數，最大可能保證在同一時間段對實驗動物進行ERG 檢測。通過以上措施，可以提高動物視網膜電生理結果的質量和可靠性。此外，仔細分析和解釋記錄也顯得尤為重要。應結合具體實驗的評價指標，采用合理的分析方法得出結論。未來在中醫眼科學的基礎實驗中，研究者們要充分利用OCT、FFA、ERG 等活體指標來檢測視網膜功能，完善實驗操作步驟獲取最穩定可靠的結果，豐富基礎理論研究，推動中醫眼科學的進一步發展。