黏多糖貯積癥Ⅱ型的基因診療

陳國慶 張惠文

上海交通大學醫學院附屬新華醫院 上海市兒科醫學研究所兒科內分泌遺傳代謝病研究室（上海 200082）

1 黏多糖貯積癥Ⅱ型概述

黏多糖貯積癥Ⅱ型（mucopolysaccharidosis type Ⅱ，MPS Ⅱ）是MPS 中唯一一種X 連鎖隱性遺傳病。MPS Ⅱ發病率約為1.07/10 萬，是我國和其他東亞地區最常見的MPS類型，約占所有MPS的一半。該病于1917年由Hunter醫生首次描述，故又稱為Hunter 病[1]。MPS Ⅱ是由編碼艾杜糖‐2‐硫酸酯酶（iduronate 2‐sulfatase,IDS）的IDS基因變異所導致，該酶催化硫酸皮膚素（dermatansulphate，DS）和硫酸乙酰肝素（heparansulphate，HS）的2‐硫酸基團水解。艾杜糖‐2‐硫酸酯酶缺陷導致這兩種糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）無法正常水解，在組織中形成病理性堆積，累及多器官并影響生理功能，此為MPSⅡ發病的主要病理生理機制。

根據患者有無神經系統癥狀，MPS Ⅱ型主要分為兩種類型，即有神經系統癥狀的嚴重型和無神經系統癥狀的輕型。共同臨床癥狀和體征包括面容粗糙、骨骼畸形和關節僵硬、生長遲緩所致矮身材、呼吸道感染和呼吸困難、爪形手和心臟損傷等。聽力減退是該病的特征性表現之一[2]。至少三分之二患者有腹股溝疝和臍疝、肝脾腫大[3‐5]。嚴重型患者發病早，有認知障礙和重度行為障礙，智力落后較為嚴重。癥狀進展較快，通常在生命第二個或第三個十年早期死于該疾病。輕型患者主要以皮膚，骨骼改變為主，一般不累及中樞神經系統，可活到40～50歲或更久。常見死亡原因是呼吸衰竭或心力衰竭[6]。

2 黏多糖貯積癥Ⅱ型診斷與基因診斷

MPSⅡ的確診需要結合臨床癥狀、實驗室檢查，酶活性測定和基因檢測進行綜合診斷。出現MPSⅡ典型癥狀、新生兒篩查陽性或有家族史的疑似患兒需要進一步檢測IDS活性和尿GAGs。IDS活性低于正常水平具有確診意義。大多數患兒酶活性完全缺乏，部分輕型患兒酶活性為正常水平的0.2%～2.4%。對于尿GAGs 水平升高伴IDS 活性缺乏且其他溶酶體硫酸酯酶活性正常的患者，應進行基因檢測以進一步診斷。

IDS基因位于染色體Xq 28，包含9 個外顯子和8 個內含子，編碼550 個氨基酸。IDS基因是MPS Ⅱ的唯一致病基因，但是IDS基因變異的異質性與MPSⅡ患者臨床表現的異質性高度相關。截至2023年11月，已報告了1 223種不同的IDS基因變異，其中大片段或整個基因缺失、基因重排約占MPSⅡ型的19%～25%，小變異或微小病變（包括插入、缺失、重復等）約占MPS Ⅱ型的75%～80%。外顯子9 的p.R468W/Q是我國熱點變異，常導致重型MPSⅡ，而p.R443X和p.G374G突變常與MPSⅡ輕型相關[7]。

在距離IDS基因著絲粒遠端約20kb的位置，存在一個假基因IDSP1，其外顯子2、3和內含子2、3、7的堿基組成和IDS基因高度同源，可產生IDS-IDSP1重排。IDS-IDSP1重排不單是MPSⅡ的重要遺傳學病因，也給IDS基因變異的診斷帶來挑戰。Sanger測序和多重連接依賴的探針擴增（MLPA）無法鑒別序列變異位于IDS基因或IDSP 1基因，必須采用等位基因特異性檢測方法對基因組或者RNA 序列進行分析，才能得到可靠的診斷[8]。

MPS Ⅱ為X 連鎖隱性遺傳病，主要累及男性患者。但依然有罕見的女性病例被報道。女性MPS Ⅱ通常由非隨機X染色體失活或X染色體異常重排所致[9‐12]，是引起女性MPSⅡ發生的主要原因[13]。

3 黏多糖貯積癥Ⅱ型常規治療

目前臨床上針對MPS Ⅱ的主要治療方法包括對癥治療、酶替代治療（ERT）和造血干細胞移植（HSCT）。對癥治療主要包括：①神經系統，交通性腦積水和脊髓壓迫可采用減壓手術治療。出現癲癇發作時用抗驚厥藥物治療。腕管綜合征可行外科減壓手術。腦積水可植入心室分流器。②骨骼系統，物理治療和康復鍛煉可以一定程度改善關節僵硬。關節嚴重畸形時可行關節置換術以改善功能。③呼吸系統，發生睡眠呼吸暫?？捎煤喴缀粑鞒掷m終末正壓治療，氣道狹窄可行氣管切開。④心血管系統，定期心電圖、心臟超聲檢查。心臟瓣膜病引起相應反流或狹窄可行瓣膜置換術。⑤其他，定期檢查眼底，及早發現視神經病變。反復中耳炎可行咽鼓管置換術[14‐15]。

ERT是輕型MPSⅡ的標準治療方法。該療法可顯著降低患者肝臟和脾臟內GAGs 的貯積，臨床可觀察到肝脾體積明顯減少，尿液中GAGs排泄減少。但靜脈輸注的酶在體內半衰期很短，需要兩周一次定期靜脈輸注，反復輸注酶有較低增加免疫反應產生的風險，影響療效[16]。由于血腦屏障的存在，現有ERT 技術無法將替代酶輸入大腦，不能改善關鍵的神經系統癥狀。盡管通過工程酶穿過血腦屏障[17‐18]和替代給藥途徑（鞘內或側腦室內）[19]來改善組織靶向性的方法正在開發研究，現階段尚無法在臨床應用。此外，ERT價格昂貴。從可及性和治療的便利性角度，ERT目前均有難以克服的困難。

與需要反復輸注的ERT 不同，HSCT 可為患者持續提供酶,與ERT相比，移植的細胞可通過血腦屏障，早期行HSCT 可有效預防中樞和外周癥狀的出現，但由于臨床診斷時間一般相對較晚，從發病到診斷的平均年限達3.5年，嚴重影響了HSCT的治療效果[20‐21]。供體適配性也是一大難題，大部分移植后患者存在移植物抗宿主?。℅VHD），需免疫抑制劑控制[22]。

4 基因治療

基因治療是指將正常外源基因通過一定方式導入靶細胞以糾正或補償異?；蛞赃_到治療目的的手段?；蛑委熆赏ㄟ^體內和體外途徑實現。體內基因治療需要將攜帶治療基因的病毒載體引入患者體內，使用的病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒（AAV）載體，采用的基因組編輯技術主要為鋅指核酸酶（ZFN）技術、轉錄激活效應因子核酸酶技術和CRISPR/Cas9技術三大類[23]。目前，只有ZFN和CRISPR/Cas9用于MPS的臨床前研究，其中CRISPR/Cas9更多用于MPSⅡ的動物模型構建[24]。體外基因治療包括在實驗室培養患者細胞，將攜帶目的基因的病毒載體轉導入細胞并回輸入患者體內[25]。體外基因治療主要使用逆轉錄病毒和慢病毒載體[26]。在大多數MPS中，將酶水平恢復到正常值的大約10%就足以抑制GAGs在器官中的堆積[27]?；蛑委熤饕獌烖c是可提供長期、持續的療效而無需連續給藥。為了改善MPS 的神經癥狀，基因療法也可以直接遞送載體至中樞神經系統（CNS）[28]。

4.1 采用腺相關病毒（AAV）載體的基因治療

4.1.1 臨床前研究 目前，AAV 是基因治療中應用最廣泛的病毒載體之一。AAV是一種無包膜病毒，直徑約25nm，屬于細小病毒科。AAV包含一個相對較小的單鏈DNA基因組，約為4.7kb[29]。AAV載體可轉導入全身各處細胞，在不分裂細胞中能提供長期的基因表達。AAV載體主要缺點為轉導后病毒載體產生的免疫原性和載體包裝容量小[30]。向小鼠、大鼠靜脈注射AAV 9 后可穿過血腦屏障，靶向神經元和神經膠質細胞；顱內或鞘內注射時，AAV9能在多個腦區穩定表達。盡管AAV 9 穿透血腦屏障的特性尚未在靈長類動物上得到證實[31‐32]，但其仍被認為是最有可能改善CNS癥狀的AAV類型。

2006 年，Cardone 等[33]通過控制肝臟特異性啟動子TBG，向2 月齡MPS Ⅱ小鼠尾靜脈注射AAV2/8TBG‐IDS病毒載體。TBG啟動子是由人甲狀腺結合球蛋白（TBG）啟動子和微球蛋白增強子組成的啟動子，用于肝臟特異性外源基因轉錄表達。3～4月齡模型鼠與同齡野生型小鼠相比出現明顯外觀差異，包括顱骨短，脫發和腳趾增粗；在大腦不同區域（海馬、丘腦、小腦和腦干）檢測到細胞空泡化。在長達7 個月的時間里，治療組小鼠的血漿和組織IDS活性均恢復到正常水平，大腦中IDS酶活性雖然比野生型小鼠低，但較模型鼠高約800倍。酶活性升高促使肝、脾、肺、腎、肌肉和大腦中堆積的GAGs被降解，尿液中GAGs水平正?；?。2009年，該小組在出生第二天的IDS‐KO 新生小鼠中通過顳靜脈注射攜帶人IDS cDNA的AAV 2/5 型載體，該載體通過巨細胞病毒啟動子（AAV2/5CMV hIDS）轉錄翻譯，并可在骨骼肌和肺等多種組織有效轉導。該研究發現治療后神經退行性變、星形膠質細胞增生和神經炎癥得到了明顯改善或完全糾正。在治療組小鼠大腦中未檢測AAV載體基因拷貝數，而在小鼠肝臟中檢測到，表明中樞神經系統癥狀的改善是由于IDS酶穿過血腦屏障發揮作用[34]。

2016 年，Motas 等[35]研究小組向2 月齡小鼠腦池內注射了帶有CAG啟動子和IDS基因的AAV9載體。CAG啟動子由巨細胞病毒增強子、雞β‐肌動蛋白啟動子和雞β‐肌動蛋白內含子組成，用于驅動IDS基因在載體中的高效表達。在注射4個月后，治療組小鼠大腦的IDS 酶活性顯著增加，達到野生型小鼠大腦IDS酶活性的40%。大腦各區域（分為5個區域對應嗅球、尾殼核、丘腦后復合體、中腦、小腦）GAGs 下降至正常范圍，神經膠質細胞胞質中的透明空泡明顯減少，神經炎癥消失。此外，載體還轉導至肝臟，肺和心臟等器官，表現出與大腦類似的IDS酶活性和GAGs變化。治療組小鼠行為缺陷被糾正，存活期顯著延長。

2017 年Laoharawee 等[36]通過鞘內注射、尾靜脈注射和腦室內注射將AAV 9 hIDS 注射入2 月齡MPS Ⅱ小鼠體內。對于腦室內注射治療組，注射后28 周內血漿中保持超生理水平IDS 酶活性（比野生型高160倍）；在注射后10個月，小鼠心、肺、肝、脾、腎中仍保持較高的IDS 酶活性（肝臟中IDS 酶活性最高，約為野生型166倍）。相反，在大腦各功能區（海馬、皮質、腦干、紋狀體、嗅球、小腦）和脊髓中只有低水平的IDS 酶活性（野生型的7%～40%）。此外，IDS酶在CNS的持續表達對預防2月齡的MPSⅡ小鼠的神經認知缺陷有突出作用，然而鞘內注射、尾靜脈注射處理的小鼠CNS中的IDS活性未出現明顯升高。而后該小組在小鼠神經功能缺損出現后，側腦室注射編碼人IDUA 或IDS 的AAV 9 載體到5～6 月齡MPS I和MPSⅡ小鼠中。除了升高IDS酶活性和降低GAGs，小鼠認知功能得到部分恢復，表明基因轉導可糾正已發生的神經功能障礙[37]。

4.1.2 臨床研究 在上述臨床前研究的基礎上，REGENXBIO 公司在2018 年啟動了通過腦室注射RGX‐121 治療MPS Ⅱ神經系統癥狀的臨床試驗（NCT03566043）。RGX‐121是一種帶有hIDS基因的重組AAV血清9型病毒載體。這是一項Ⅰ/Ⅱ期劑量遞增研究，對象為4個月到5歲的兒童。截至2023年2月，已有15名受試者參加了3個不同劑量組（分別為1.3×1010、6.5×1010和2.0×1011基因組拷貝數/腦質量）[38]。受試者對RGX‐121耐受良好，無藥物相關嚴重不良事件發生。在給藥后約8周～兩年時間內，受試者腦脊液中GAGs顯示出一致的降低，下降幅度呈劑量依賴性，所有劑量組均在給藥48周時接近正常范圍；神經發育測試較入組時有明顯提高[39]。試驗后續會對試驗者進行為期5年的隨訪和長期觀察記錄（NCT04597385）。另外還有對嚴重型MPSⅡ兒童（5～18 歲）的單劑量隊列研究，受試者將接受單劑量（6.5×1010基因組拷貝數/腦重量）的RGX‐121，通過腦室內注射給藥。在最初24周（研究初期）主要關注是否產生不良反應。在初期研究結束后，受試者將繼續接受RGX‐121治療后共計104周的安全性和療效評估（NCT04571970）。

另一項臨床試驗旨在通過一種靜脈輸注攜帶hIDS的新型AAV‐HSC16載體（HMI‐203）評估安全性和療效并和接受標準ERT治療的患者療效作比較（NCT 05238324）。AAV‐HSC 16 載體是從人CD 34+細胞中分離出的造血干細胞AAV變種。與其他血清型相比，這種載體在異體移植受體中能更穩定地表達[40]?；加蠱PS Ⅱ的成年男性將接受單劑量HMI‐203的靜脈注射。計劃分為3個不同劑量組，每組由3 名受試者組成。第一個劑量組每個受試者間隔60天給藥，第二組和第三組的后續受試者間隔21天給藥以審查安全性和有效性。該試驗將持續5年，目前仍在招募志愿者[41]。

4.2 采用慢病毒載體的基因治療

體外基因治療通過收集患者體細胞并從中獲得誘導多能干細胞（iPSC）[42]，使用慢病毒載體轉導入iPSC 中，再自體移植回患者體內，提供穩定的基因表達并將缺失的基因傳遞給不分裂細胞，例如神經元[43]。Wakabayashi等[44]成功地將這種方法應用于MPSⅡ小鼠模型。他們向8～9周齡小鼠移植含有IDS基因慢病毒載體的造血干細胞。在小鼠接受移植后，大腦皮層，肝和心臟中觀察到IDS酶活性增加和GAGs水平降低。此外，自噬相關底物（如p62）在大腦中下降到正常范圍。與MPS Ⅱ小鼠相比，移植小鼠中沒有出現神經元功能的惡化。

2022 年，Miles 等[45]設計了用慢病毒載體轉導的造血干細胞，該載體攜帶由MNDU 3 啟動子調控的人類IDS基因，MNDU3啟動子由骨髓增生性肉瘤病毒長末端重復序列U3區域去除負調控區生成，驅動IDS基因轉錄表達。將造血干細胞通過尾靜脈輸注6～8周齡MPSⅡ雄性小鼠。治療組小鼠顴弓變薄，血漿和組織（包括回腸、盲腸、結腸、脾、肺、腎、心、眼和脊髓）中出現超生理水平的IDS酶活性，足以使GAGs 處于正常值。在Barnes 迷宮和條件性恐懼實驗中治療組小鼠表現優于野生型小鼠。值得注意的是，治療組小鼠大腦中的IDS 酶水平恢復到野生型小鼠的10%～20%，足以降解腦中堆積的糖胺聚糖并防止神經認知功能缺陷的出現。

4.3 基因組編輯技術

ZFN由DNA識別域和DNA剪切域兩部分組成。DNA剪切域由核酸內切酶Fok I組成，當兩個Fok I結合到一起時就能對DNA進行剪切?；谶@個原理，鋅指核酸酶成功實現了DNA 的定位和剪切，再結合外源導入的目的基因以及細胞自帶的DNA 修復系統，便可實現基因編輯[46]。此前已有使用鋅指核酸酶在白蛋白基因座靶向插入人凝血因子Ⅷ和因子Ⅸ，糾正血友病A，B 小鼠模型凝血功能障礙。白蛋白基因在肝細胞中的表達水平非常高，而且肝臟相對于其他組織進行基因導入和體內編輯的可操作性更強[47]。在此基礎上，Laoharawee等[48]給6～9周齡的雄性MPSⅡ小鼠注射了3種遞增劑量的AAV2/8載體（分別為2.5×1011，5×1011和1.5×1012基因組拷貝數/鼠），利用ZFN 在白蛋白基因座內含子1處靶向插入IDS基因。各劑量組MPSⅡ小鼠肝、脾、腎、肺、心和肌肉中IDS 酶活性升高和GAG 含量均明顯降低，腦中GAGs沒有明顯的下降。其中，高劑量組MPS Ⅱ小鼠認知功能沒有進一步惡化?；谂R床前研究中表現出較好的療效，第一項基于基因編輯的體內基因療法的多中心Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗在MPS Ⅱ患者中啟動（NCT03041324）。該試驗通過靜脈輸注給予受試者SB‐913（ZFN1、ZFN2、攜帶hIDS的AAV2/6），將IDS基因靶向置入受試者肝細胞基因組中，在高表達內源性白蛋白基因座的控制下發揮作用。試驗包括三組不同劑量（分別為5×1012，1×1013和5×1013vg/kg），共招募9名志愿者[49]。在治療后16 周，中劑量組受試者的尿中HS 和DS 較基線有所下降（尿GAG下降51%，硫酸皮膚素下降32%，硫酸類肝素下降61%）；然而，未檢測到血漿IDS 活性的升高[50]。截至治療后36 周，受試者較入組前血漿中沒有顯著IDS 酶升高和uGAG 的下降。目前，這項試驗已于2022年10月終止，在為期10年的長期隨訪研究（ST‐IVPRP‐LT01，NCT04628871）中繼續監測該藥的安全性。

CRISPR/Cas 9 技術目前尚未在MPS Ⅱ模型上進行相關報道，2018 年Schuh 在MPS I 模型小鼠采用攜帶CRISPR/Cas9質粒和陽離子脂質體進行基因治療，血清中出現持續6個月的α‐L‐艾杜糖醛酸酶活性增加，肺和心臟中GAGs減少[51]。

5 總結

基于ERT和HSCT的MPSⅡ特異性治療能夠顯著改善預后，但兩者都有一定局限?；蛑委熥鳛橐环N嶄新的療法，能夠長期提供缺陷酶的表達，通過交叉校正機制，經過基因修飾后的細胞能夠產生和釋放溶酶體酶，被其他細胞和器官吸收[52]。體外基因療法大多采用慢病毒載體，但目前仍然在臨床前研究階段，還需要進一步分析體外療法的療效和安全性。體內基因療法在取得一定進展的同時，也依然存在遞送和表達等問題。顱內注射給藥會導致大腦組織損傷以及有限的載體分布和不均勻的空間覆蓋，系統性AAV遞送（靜脈注射）又難以特異性靶向特定細胞類型。此外，人體內可能會存在傳統AAV的中和抗體或不能充分跨越生物屏障（如血腦屏障）。同時也要考慮到治療確診時間較晚的患者無法逆轉已經造成的損傷。早期診斷并發現癥狀前MPS患者，可能是未來提升基因治療效率中與技術開發同樣重要的環節[53]。