腫瘤代謝標志物在肺癌液體活檢中的研究進展

鄒詩施 李寧 張天宇 耿慶

肺癌是目前世界發病率第二位、死亡率第一位的癌癥[1]。肺癌病死率降低的重要策略是早期篩查和診斷。液體活檢是在腫瘤實質之外對血液等體液進行的一種微創活檢。目前進行液體活檢的有效生物標志物有循環腫瘤細胞、無細胞DNA、外泌體miRNAs（microRNAs）等，利用生物標志物的生物特性，可輔助疾病早期診斷，并對患者病情進展和治療效果進行判斷，從而達到精準治療腫瘤的目的。代謝重編程是肺癌重要的表型變化，以適應肺癌能量供應及蛋白表達。代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后的一門新學科，主要研究包括碳水化合物、氨基酸、核苷酸、羧酸和脂類等在內的代謝底物和產物。代謝組的復雜性遠低于基因組或蛋白質組，代謝物既是細胞的構建組成部分，也是參與細胞內信號傳遞的介質，最接近地反映了當前表型的狀態，并告訴我們在生物體中到底發生了什么。目前，一些“經典”癌癥生物標志物被提出用于肺癌檢測。細胞角蛋白19片段（cytokeratin fraction 21-1,CYFRA 21-1）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）和神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）等通常在肺癌患者中的診斷敏感性為42%，特異性為83%[2]。因此，以代謝為中心的肺癌標志物在肺癌早期診斷、疾病分期、治療效果、預后判斷中具有極大的潛力[3]。

1 肺癌主要代謝途徑變化

1.1葡萄糖代謝 20世紀20年代，奧托·沃伯格觀察到腫瘤細胞葡萄糖攝取大大增加，丙酮酸鹽轉化為乳酸，而不考慮氧氣的可用性或稀缺性，這一過程被稱為“Warburg效應”。研究[4]表明，糖酵解代謝途徑過剩及代謝產物的累積抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤增殖與遷移能力。3-磷酸甘油酯（3-phosphoglyceride,3-PGA）通過結合磷酸甘油脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase,PHGDH）橋接葡萄糖水平變化與p53蛋白介導的細胞凋亡。同時，肺癌細胞在葡萄糖耗竭時表現出彈性的能量適應機制，如線粒體磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2（phosphoenolpyruvate carboxykinase 2,PCK2）介導的糖異生[5]、單羧酸轉運蛋白1（monocarboxylate transporter-1,MCT1）介導的乳酸攝取及能量代謝[6]。

1.2氨基酸代謝 氨基酸參與肺癌的能量代謝、生物合成、氧化還原平衡等代謝途徑。生糖氨基酸為三羧酸循環提供燃料。研究[7]表明，與非腫瘤區域相比，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中腫瘤區域的生糖氨基酸顯著增加，其中包括丙酮酸前體［絲氨酸（serine,Ser）、甘氨酸（glycine,Gly）、蘇氨酸（threonine,Thr）、丙氨酸（alanine,Ala）和酪氨酸（tyrosine,Trp）］、α-酮戊二酸前體［谷氨酸（glutamic acid,Glu）、谷氨酰胺（glutamine,Gln）和脯氨酸（proline,Pro）］和琥珀酰輔酶A前體［纈氨酸（valine,Val）、異亮氨酸（isoleucine,Ile）和甲硫氨酸（methionine,Met）］。肺癌細胞Gln攝取及分解增加，Gln酶將Gln轉化為Glu和氨，轉化為糖代謝及核苷酸生物合成的底物。Gly作為單碳代謝的單碳源，促進癌癥細胞的增殖。同時，谷胱甘肽合成過程中，Gly與Glu發揮重要作用，并維持氧化酶和抗氧化酶之間的穩態，是維持腫瘤的高間充質細胞狀態的關鍵步驟[8]。

氨基酸對腫瘤細胞增殖與凋亡有介導作用。癌癥患者血漿苯丙氨酸濃度升高，這可能與苯丙氨酸羥化酶活性失調有關[9]。苯丙氨酸是一種必需氨基酸，它不僅調節和控制物質代謝，而且通過Fas受體介導的細胞死亡受體途徑、Rho/ROCK途徑或顆粒酶B信號介導的凋亡途徑介導細胞凋亡[10]。以聚苯丙氨酸為介質的納米顆粒是靶向肺癌等腫瘤的良好藥物載體[11]。氨基酸參與腫瘤微環境的免疫調節。吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO）是一種關鍵的色氨酸分解代謝限速酶，可將色氨酸代謝為犬尿氨酸。IDO的激活會損害抗原依賴性T細胞的激活，并導致免疫耐受和免疫逃逸，從而促進腫瘤的發展和轉移[12]，可作為肺癌極具潛力的免疫治療靶點。精氨酸不僅促進癌細胞生長增殖，同時促進T細胞受體表達及T細胞活化，具有抗腫瘤效應。NSCLC中癌細胞通過精氨酸琥珀酸合酶1（argininosuccinate synthase 1,ASS1）利用瓜氨酸合成精氨酸，多余的精氨酸被轉移至腫瘤浸潤淋巴細胞，作為抗腫瘤免疫的燃料[13]。

1.3脂質代謝 脂質代謝能滿足腫瘤分裂過程中對膜合成和能量產生的迫切需求，從而維持參與癌癥細胞生長和轉移過程。脂質的攝取和儲存增加以及參與其代謝的蛋白質和酶的表達增強發生在各種癌癥中。在NSCLC中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變誘導脂肪生成，激活PI3K/AKT/mTOR通路，并抑制磷脂酸磷酸水解酶1入核。甾醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element-binding protein,SREBP）由此易位進入細胞核，并作為轉錄因子參與脂質代謝的不同基因的轉錄，如脂肪酸合成相關的AcCoA羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACC）、三磷酸腺苷-檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase,ACLY）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1（stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1）以及膽固醇合成和攝取相關的HMGCoA還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGCR）和低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor,LDLR）[14]。脂肪酸在肺癌中含量增高，然而不同脂肪酸對肺癌發生發展中具有多樣性。單不飽和脂肪酸和膽固醇通過調節細胞膜的穩定性和流動性，有助于EGFR信號的激活，同時EGFR直接磷酸化SCD1的第55位酪氨酸（Y55）位點，促進單不飽和脂肪酸產生[15]。ω-3多不飽和脂肪酸（omega-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3 PUFA）是抗腫瘤免疫的重要營養調節劑。然而ω-6 PUFA可產生花生四烯酸，增加炎癥及腫瘤發生。ω-6/ω-3比值高提示肺癌高風險。

1.4鞘脂代謝 神經酰胺是鞘脂代謝的中心分子，可作為復雜鞘脂如鞘氨醇-1-磷酸、鞘磷脂、神經酰胺-1-磷酸和葡糖基神經酰胺的前體。鞘磷脂除在細胞膜中的結構作用外，對癌癥細胞的生長、增殖、存活、遷移、侵襲和轉移也很重要。癌癥細胞中通過鞘磷脂合成酶和鞘磷脂酶催化使得神經酰胺/鞘磷脂平衡向鞘磷脂合成增加傾斜[16]。同時，神經酰胺合成酶基因、鞘氨醇激酶2、葡萄糖神經酰胺合酶等鞘脂代謝關鍵酶在腫瘤細胞中增加。具有高β-1,3-N-乙酰葡糖胺基轉移酶5（beta 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 5,B3GNT5）或低半乳糖-3-氧磺基轉移酶1（galactose-3-Osulfotransferase 1,GAL3ST1）表達的NSCLC患者預后不良，B3GNT5調控的乳糖/新乳糖系列糖脂/硫酸酯鞘脂代謝平衡可作為確定癌癥生長和進展中鞘脂代謝重編程的檢查點[17]。鞘脂代謝和鞘脂信號通路的失調可能成為早期NSCLC的一種新興治療策略[18]。

1.5甘油磷脂代謝 膽堿攝取和代謝的關鍵酶膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase,ChAT）和膽堿激酶α（choline kinase α,ChoKα）在肺癌組織中的表達增加，通過11C-膽堿PET/CT成像能夠可視化癌癥病變[19]。人類NSCLC患者的血漿乙酰膽堿（acetylcholine,ACh）水平和腫瘤ChAT表達與EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）治療的反應和無進展生存率相關，這與通過ACh毒蕈堿受體3依賴性的Wnt信號通路相關[20]。

1.6嘌呤代謝 嘌呤是生物體內豐富的底物，是細胞增殖的關鍵原料，也是免疫調節的重要因素。黃嘌呤氧化還原酶（xanthine oxidoreductase,XOR）是一種關鍵的限速酶，通過將次黃嘌呤轉化為黃嘌呤和將黃嘌呤轉化成尿酸來控制嘌呤分解代謝的最后兩步。它在催化過程中產生活性氧。XOR表達在不同癌組織中具有異質性，正常肺內XOR低表達，由于對嘌呤代謝的需求增加和炎癥反應的激活，肺腺癌中XOR表達顯著增加[21]。同時作為嘌呤代謝的終產物，血漿尿酸高水平與不良預后相關[22]。

2 肺癌代謝標志物的作用及進展

2.1可作為肺癌早期診斷標志物 在腫瘤進展過程中，T細胞活化存在著有氧呼吸向有氧糖酵解的代謝轉換。一項研究[23]通過測量外周血單核細胞細胞外環境的相對酸化水平，揭示免疫系統細胞的代謝活性譜，作為疾病狀態的指標，并可排除慢性阻塞性肺部疾病的影響，在癌癥I期，檢測的特異性提高到94.0%，檢測的敏感性提高到97.3%。

血漿游離氨基酸譜可評估肺癌風險，提高肺癌早期檢出率[24]。癌細胞內可見多胺生物合成和攝取增加、分解代謝減少。Singhal等[25]通過識別和定量癌癥患者和對照組中的血漿樣本中的亞精胺/亞精胺N1-乙?；D移酶-1（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SSAT1）介導的多胺通路，發現多胺代謝合成所需氨基酸精氨酸、鳥氨酸下降，代謝產物精胺、亞精胺及二乙酰精胺含量明顯上升。Huang等[26]利用激光解吸/電離聯合質譜（laser desorption ionization mass spectrometry,LDI-MS）分析血清代謝組學，確定了一個由7種代謝物和相關途徑組成的生物標志物組，用以診斷早期肺腺癌，由組胺、半胱氨酸、脂肪酸（18:2）、尿嘧啶、尿酸、3-羥基吡啶酸（3-hydroxypicolinic acid,HPA）、吲哚丙烯酸（indoleacrylic acid,IA）組成，靈敏度為70%-90%，特異性為90%-93%。僅HPA、IA在肺癌患者中含量下降，其影響肺癌發生發展的潛在機制尚未闡明?；谏鲜鲑|譜平臺，血清代謝組學聯合蛋白質腫瘤標志物及影像學建立三模態模型，更有效地診斷早期肺腺癌[27]。

肺癌患者中的膽堿代謝、鞘脂代謝與甘油磷脂代謝表現出早期的代謝紊亂。Wang等[28]基于液相色譜串聯質譜的靶向脂質組學建立脂質代謝標志物組合，可作為預測肺癌的獨立因素。與癌旁肺組織相比，肺癌組織中5種磷脂酰膽堿（phosphocholine,PC）16:0_18:1、PC 18:0_18:1、PC 18:0_18:2、PC 16:0_22:6和PC 16:0_18:2及1種甘油三酯（triglyceride,TG）16:0_18:1_18:1表達升高，3種溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidyl choline,LPC）16:0、LPC 18:0和LPC 20:4的表達降低，其特異性為95.65%，敏感性為90.70%，曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.9843?；|輔助激光解吸/電離聯合質譜成像進一步驗證肺癌組織中的脂質原位表達。在I期NSCLC的血漿樣本中，以LPC a C26:0、LPC a C26:1、PC aa C42:4、PC aa C34:4為代謝標志物組合，AUC為0.903[29]。除PC aa C34:4外，肺癌組代謝物均上升，這可能與磷脂酰膽堿的?；溠由爝^程有關，?；滈L度增加是肺鱗狀細胞癌最常見的特征之一。另一項研究[30]利用全定量靶向質譜分析靶向138種代謝物，LPC 20:3、PC-ae C40:6在健康對照組和I/II期NSCLC之間分別顯著上升與下調。除此之外，聯合β-羥基丁酸、檸檬酸和富馬酸的代謝物標志組合AUC可達0.898。一項針對女性非吸煙肺腺癌患者的研究[31]發現了一個由3種脂質組成的血清脂質生物標志物組，包括FA（20:4）、FA（22:0）和溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine,LPE）（20:4），AUC為0.99。其中，僅多不飽和脂肪FA（20:4）在肺癌患者中下降，這可能與ω-3 FA的抗腫瘤效應有關。一項研究[32]分析478例肺癌患者與370例良性腫瘤患者的血液中篩查47個氨基酸和肉堿指標，肉堿將長鏈脂肪酸帶入線粒體進行氧化并轉化為?；鈮A，?；舛緣A譜可以反映脂肪酸代謝狀況及肺癌等疾病的發展。鳥氨酸和棕櫚基肉堿代謝生物標志物對早期肺癌的診斷具有重要意義（AUC為0.81，精確度為75.29%，靈敏度為74%）。

目前尚不清楚膽固醇代謝在肺癌發生時的作用。一項2006-2015年大型前瞻性動態隊列研究[33]中，中國唐山市開灤隊列分析984例肺癌及121,513例非肺癌患者，結果顯示肺癌患者中表現出高敏C反應蛋白（high sensitivity Creactive protein,hsCRP）升高（＞3 mg/L）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）降低（＜120 mg/dL）。另一項研究[34]結合代謝組學與轉錄組學發現不論肺癌分期如何，油酸、膽固醇、肌醇在肺癌患者中下調。INPP5A、MAP2K2、CAMK1D、GABARAPL1和NDUFS4/8等相關調控基因主要通過Ca2+信號參與候選生物標志物相關的生物途徑，其中絕大多數與肺癌增殖密切相關。其中，從膳食中負調節膽固醇攝入的鈣/鈣調節蛋白依賴性蛋白1D（calcium/calmodulin-dependent protein 1D,CAMK1D）與肺癌的增殖有密切關系。作為膽固醇的代謝產物，脫氧膽酸可在早期肺癌患者術后觀察到明顯上升，提示癌癥與膽固醇代謝的潛在聯系[35]。

2.2可預測肺癌進展 肺腺癌的病理進展是逐步演變的。在進展為浸潤性肺腺癌之前，正常肺組織從非典型腺瘤性增生（atypical adenomatous hyperplasia,AAH）到原位腺癌（adenocarcinomain situ,AIS）、微小浸潤性腺癌（minimally invasive adenocarcinoma,MIA），最后進展為浸潤性腺癌（invasive adenocarcinoma,IAC）。與AAH的血清樣本對比，AIS中可觀察到天冬酰胺增加、胱氨酸減少，AIS+MIA組中可觀察到胱氨酸和纈氨酸的減少，AIS+MIA+IAC組中可觀察到3-氯酪氨酸和磷膽堿的上升、12:0-肉堿和Glu的降低。同時，通過對不同預后IAC患者進行代謝分型，發現膽汁酸代謝的失調與不良預后高度相關。膽汁酸代謝的失調主要體現在代謝產物膽汁酸、甘膽酸、牛黃脫氧膽酸和脫氧膽酸的進展性上升[36]。脂質代謝譜在早期及晚期肺癌中也會出現變化，一項研究[37]通過基于新型PbS/Au層狀襯底的LDI-MS方法對健康對照組、早期肺癌組與晚期肺癌組進行脂質代謝譜分析，發現與對照組相比，早期肺癌組中花生四烯酸、N-棕櫚酰亮氨酸、PC（26:0）和鞘磷脂（sphingomyelin,SM）（d18:1/14:0）下調，PC（36:4）、PC（38:3）、PC（38:4）、SM（d20:1/20:4）和SM（d17:1/24:1）上調；但在晚期肺癌組中脂質變化并沒有擴大差異，而是趨向恢復，提示脂質變化可能具有適應性。

研究[38]顯示，最初的原發性癌癥（initial primary lung cancer,IPLC）幸存者發生第二次原發性癌癥（second primary lung cancer,SPLC）的風險增加了4-6倍。波士頓肺癌研究[38]對82例SPLC和82例匹配的IPLC對照組的血清樣本進行非靶向代謝組學研究。5-甲硫腺苷（5-methyl thiophene acryloyl,5-MTA）和苯乙酰谷氨酰胺在SPLC病例中的水平比IPLC對照組增加了大約1.5倍，提示基于代謝組學的風險分層可能有助于區分SPLC風險。5-MTA是一種由多胺途徑合成的含硫核苷，也是嘌呤和甲硫氨酸回收途徑中的中間體，5-MTA在肝癌細胞中表達降低，5-MTA的回補可通過抑制DNA合成及鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）活性抑制腫瘤細胞的增殖[39]。苯乙酰谷氨酰胺是苯乙酸鹽和Gln的二肽產物，天然存在于人類尿液中，是鑒別惡性腫瘤的良好代謝標志物[40,41]。磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）38:5及PE 40:5可作為區別多原發性肺癌與肺內轉移的敏感標志物。PE 38:5靈敏度為0.95、特異性為0.92，PE 40:5特異性為1、敏感性為0.90，在肺內轉移患者中較多原發性肺癌患者升高[42]。

2.3可預測EGFR-TKIs耐藥性 代謝差異可能是NSCLC對EGFR-TKIs耐藥的重要環節。耐藥性細胞相對于糖酵解更偏向于氧化磷酸化，因此在合并二型糖尿病的肺癌患者中，二甲雙胍聯合奧希替尼可通過使細胞恢復糖酵解以減弱腫瘤細胞的藥物抗性[14,43]。獲得性EGFR-TKIs耐藥性肺癌患者中的Gln依賴性是異質性的，耐藥細胞系對細胞能量來源的依賴程度不同，與Gln代謝相關的代謝產物在抗性細胞中較高。針對Gln代謝途徑的調節可能導致耐藥性的逆轉。CB-839對Gln代謝的抑制可作為獲得性EGFRTKIs耐藥肺癌的治療工具[44]。Azuma等[45]在NSCLC患者接受程序性細胞死亡受體-1（programmed cell death-1,PD-1）抑制劑治療前后的血清樣本中分析血漿游離氨基酸和色氨酸代謝物。由Gly、組氨酸、Thr、Ala、瓜氨酸、精氨酸、色氨酸等組成的游離氨基酸譜可預測較好預后。3-羥基犬尿氨酸、鄰氨基苯甲酸、喹啉酸等色氨酸代謝物積累，表明減弱的抗腫瘤免疫并預測不良預后。同時，一項研究[46]在49例診斷EGFR基因突變并接受?？颂婺嶂委煹姆蜗侔┗颊咧?，根據無進展生存期進行藥物療效分層，分析其代謝差異，LPC 16:1、LPC 22:5-1和LPE 18:2在耐藥患者中減少，Cer 36:1-3、Cer 38:1-3、SM 36:1-2和SM 42:2在耐藥患者中增多，可能與ARID1A、ARID1B、BCR和RBM10四個同時突變的基因表型相關聯。

2.4可預測化療療效 代謝組學可預測肺癌患者化療的獲益程度?；谛酒x細胞儀平臺和熒光代謝探針，對32例IV期肺腺癌患者的胸腔積液中罕見的播散性腫瘤細胞進行代謝表型分析，發現糖酵解與線粒體呼吸的比值與患者化療藥物反應和預后呈正相關，是良好的預測因素。同時，研究[47]發現具有高糖酵解2-NBDG探針表達的細胞展現更多的間充質樣特征，而具有高線粒體呼吸探針C12R表達的細胞表現上皮細胞特征。在高N/R比率患者中，一種上皮-間充質轉化過程相關的酪氨酸激酶受體（tyrosineprotein kinase receptor,AXL）表達升高，針對AXL的藥物靶點可以調節藥物抗性。Tian等[48]針對354例使用一線培美曲塞加鉑雙聯用藥的肺腺癌患者，根據療效和生存結果，分析篩選出由7種代謝產物組成的潛在生物標志物模型，包括尿苷、十二烷?；鈮A、L-棕櫚?；鈮A、膽堿、二甲基甘氨酸、亞?；撬岷蜔燉０?，其中僅煙酰胺在疾病進展組下降，AUC為0.909。

3 總結與展望

肺癌代謝標志物在早期疾病診斷、疾病進展、療效監測及預后預測中具有巨大潛力。但是目前仍有一些問題與挑戰。首先，內源性代謝物具有相同的基本化學結構和交錯的代謝途徑網，因此代謝物的微小結構差異可能來自不同代謝通路改變，可預測不同的肺癌發生發展方向[49]。其次，檢測和鑒定所有代謝物來全面覆蓋代謝組仍然是一個挑戰，需要應用不同的檢測平臺以及開發代謝組數據庫。由于代謝組具有高度動態性，并且對各種內部和外部因素敏感，因此需要驗證獲得的信息以保證一致性和可重復性[50]。目前，通過代謝組學與基因組學、蛋白質組學結合，并通過整合分析獲得代謝物表型改變背后的深層遺傳信息，有利于進一步了解代謝物的作用。開發一種低成本、高通量、高準確率的代謝組學檢測應用于肺癌臨床診療中仍是極有希望的。

Competing interests

The authors declare no competing interests.