腫瘤相關成纖維細胞對結直腸癌腫瘤微環境中免疫細胞調節作用的研究進展

危姍姍，徐逸昕，朱仔燕，陳皓南，阿不都沙拉木·亞力昆，李繼坤

結直腸癌（colorectal cancer, CRC）是癌癥相關死亡的主要原因之一，其發病率和死亡率分別居全球腫瘤的第三位和第二位[1]。腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME）是決定腫瘤發生發展及治療效果、預后的關鍵因素，TME 主要由腫瘤細胞、浸潤性免疫細胞、腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）、 細胞 外基 質（extracellular matrix, ECM）和脈管系統等構成[2-4]。在各種TME 中，CAFs 是最豐富的細胞類型之一，在影響腫瘤惡性表型方面起著極其重要的作用，并且以CAFs 作為腫瘤治療的靶標也逐漸引起了人們的關注。

人們將TME 中的活化成纖維細胞定義為CAFs，其經典的生物學標志物為α-平滑肌動蛋白(α-SMA)和成纖維細胞活化蛋白(FAP)。CAFs 是腫瘤基質中的主要組成成分，其作用為分泌生長因子、炎癥配體和細胞外基質蛋白，促進腫瘤增殖和免疫抑制[5]。CAFs 的主要來源有：1）腫瘤激活鄰近的正常成纖維細胞，獲得肌成纖維細胞表型[6-8]；2)骨髓源性纖維細胞的募集[9-10]；3) 上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）[11]；4)內皮- 間質轉化（endothelial -to -mesenchymal transition, EndMT）[12]。

近年來，人們除了對CAFs 在促進腫瘤的發生和發展中的作用有了比較深入的認識以外，有關CAFs 與TME 中其他免疫細胞之間的相互作用以及對腫瘤免疫治療的影響也展開了許多研究。本文將就有關CAFs 對結直腸癌TME 中主要細胞成分的調節及影響腫瘤免疫治療的進展研究進行綜述。

1 TIME 中免疫細胞浸潤是影響腫瘤進展及免疫治療效果的關鍵因素

腫瘤免疫微環境 （tumor immune microenvironment,TIME）是近年來新提出的概念，據報道其與患者的免疫治療效果和臨床預后密切相關[13]。目前，隨著免疫治療的發展，治療惡性腫瘤的方式逐漸多樣化，但其發揮效應取決于TME 中的免疫應答狀態，包括免疫細胞的浸潤、細胞表面免疫檢查點的表達和相關基質的改變[14-15]。腫瘤實質中缺乏免疫細胞浸潤是導致患者不能從免疫治療中獲益的關鍵因素，進而導致惡性腫瘤的進展[16-17]。

2 CAFs 對結直腸癌TME 中T 細胞的影響

在各種類型的免疫療法中，免疫檢查點阻斷是基于單克隆抗體的療法，也是在臨床上應用于患者最多的方式之一。臨床上常用的免疫治療有：通過阻斷受體-配體相互作用、增強T 細胞的活化和功能，例如抗程序性死亡受體1（PD-1）和抗細胞毒性T 淋巴細胞抗原4（CTLA-4）。CAFs 影響結直腸癌TME 中的免疫狀態，從而導致抗腫瘤免疫抑制。以下就結直腸癌中CAFs 對T 細胞調控的具體機制進行闡述。

參與抗腫瘤免疫的細胞主要是細胞毒性淋巴細胞（cytotoxic lymphocytes，CTLs），而其中起最大殺傷作用的是CD8+T 細胞。CAFs 通過多種方式影響CD8+T 細胞的生物學功能。目前，靶向PD-1/程序性死亡配體1（PD-L1）和CTLA-4 的免疫檢查點抑制劑在多種惡性腫瘤被應用[18-20]。然而，大多數患者對于檢查點單藥治療無響應[21-23]，耐藥性產生的原因是全球研究者最為關注的熱點之一。對多種腫瘤的研究發現富含CAFs 的瘤種對抗PD-1 治療的療效較差。其機制之一在于CAFs 自身表達PD-L1 和PD-L2 或者促進CRC 細胞表面的PD-L3 和PD-L1表達，導致CD8+T 細胞對癌細胞的殺傷作用減弱[24-26]。另外，CAFs 通過限制CD8+T 細胞向腫瘤中心浸潤來減少免疫細胞對腫瘤的攻擊。例如，Kirsty 等[27]在MC38 小鼠體內研究發現，與低CAFs 的腫瘤相比，富含CAFs 的腫瘤對抗PD-1 治療的療效較差。他們用多種方法檢測了免疫細胞的定位，發現CAFs顯著改變了CD8+T 細胞的分布，促使CD8+T 細胞積聚在腫瘤邊緣而非腫瘤中心。一項針對CRC 患者的研究表明，CD70 陽性的CAFs 促進了調節性T 細胞募集和遷移，并顯著增加了這些抑制性免疫細胞對TME 的浸潤[28]。而另一項研究發現CD70 陽性CRC 患者的生存率較低[29]。

眾所周知，轉化生長因子-β（TGF-β）是調節CAFs 分化的重要因子，而NOX4 是TGF-β 信號通路下游的靶點之一，并也參與了CAFs 分化[30]。反之，CAFs 也可促進TGF-β 的分泌和活化，從而抑制CD8+T 細胞的增殖和細胞毒性[31]。同時，CAFs 也可以通過PD-L2 和FASL 的表達誘導CD8+T 細胞凋亡[32]。根據Kirsty 等[27]的報道，使用TGF-β 抑制劑能同時增加對照組和富含CAFs 組的CD8+T 細胞浸潤，在體內應用NOX4 抑制劑后，可以降低腫瘤中CAFs 的水平，腫瘤邊緣的CD8+T 細胞開始由腫瘤邊緣向腫瘤中心浸潤，從而引起富含CAFs 的MC38小鼠腫瘤的體積減小。NOX4 抑制劑能使CRC 對抗PD-1 治療再敏感；與抗PD-1 單藥治療相比，用NOX4 抑制劑/PD-1 抗體的組合治療富含CAFs 的MC38 腫瘤，可以增加CD8+T 細胞的浸潤，縮小腫瘤體積，延長小鼠的存活時間。此外，有研究發現CAFs 分泌的Wnt2 蛋白信號通路相關基因在TGFβ 信號傳導中高度富集，從而加強了CRC 的侵襲和遷移[33]。

FAP 是一種膜結合絲氨酸蛋白酶，同時其也是CAFs 的主要標志物[34]。越來越多的證據表明，FAP 是另外一個可能導致免疫檢查點阻斷耐藥的因素[35-37]。Chen 等[38]報道，含有FAP 高表達CAFs（CAF2）的腫瘤對抗PD-1 治療的反應較差，而FAP 低表達的CAFs 則不會誘導腫瘤產生抗PD-1 的耐藥性。另外，用FAP 抑制劑治療可顯著消除CAF2 誘導的抗PD-1 耐藥性。在富含CAF2 的腫瘤中，免疫抑制因素，如骨髓來源抑制細胞(MDSC)浸潤和PD-L1 表達異常升高。高FAP 表達的CAFs 通過上調CCL2分泌、募集髓系細胞、降低T 細胞活性等方式促進CRC 腫瘤免疫微環境中的免疫抑制[38-39]。上述研究表明CCL2 是FAP 高表達CAFs 誘導的CRC 免疫抑制的主要介質，生存分析發現高FAP 表達患者的總生存期較短。另有研究提示FAP 高表達的CAFs分泌的ECM 與CD8+T 細胞浸潤減少有關[40-41]。

CD73 是一種外核苷酸酶，通過與外核苷-ATP-酶、CD39 等協同產生細胞外腺苷（ADO）[42-44]。腺苷是TME 中一種有效的細胞外免疫抑制信使[45]，通過細胞外ADO 腺苷能受體（A2a）施加免疫抑制[46-47]。已有研究發現CD73 在腫瘤中的過表達通過增強腫瘤細胞的侵襲性和抑制抗腫瘤免疫來促進腫瘤進展，而TME 中CD73 的重要來源之一是CAFs。Yu等[48]使用來自人CRC 和小鼠腫瘤模型中分離出來的CAFs 進行比較，發現與TME 中的其他細胞成分相比，CD73 在CAFs 上的表達和生物活性更高。在缺氧等應激條件下，CD73 與其他外核苷酸酶（如CD39）一起產生高濃度的ADO，通過與其激活的受體A2a 結合，影響腫瘤細胞和免疫細胞中的生物途徑，從而影響腫瘤進展和免疫抑制[49]。而CRC 中的A2a 受體在T 細胞上表達，由ADO 激活后產生腫瘤免疫抑制作用。反之，TME 中ADO 升高還可以通過A2b 受體介導的途徑上調CAFs 上的CD73，從而刺激ADO-A2b-CD73 回路，進一步增強免疫抑制。人結直腸癌TME 中高水平的CD73 表達與CAFs豐度，增強免疫抑制和預后不良呈正相關[48]。此外，有研究提示CAFs 可上調T 細胞上CD39 的表達，而T 細胞反過來上調CAFs 上CD73 的表達，由此加重抗腫瘤免疫抑制[50]。

CAFs 還通過分泌大量含膠原蛋白的ECM 來調節的免疫細胞錨定和運輸、存活以及通過抑制免疫激活促進腫瘤的進展[51-53]。在含有密集堆積基質纖維的基質區域中，淋巴細胞位移減少，支持了ECM 沉積可能通過限制T 細胞運動來改變抗腫瘤免疫反應的觀點[54]。由于ECM 大量堆積使腫瘤中心含氧量減少從而導致CAFs 激活，產生上述CAFs影響免疫細胞的機制，進一步促進免疫抑制[55-56]?？傊?，CAFs 通過自身表達和分泌一致性免疫檢查點相關分子，以及促進腫瘤細胞表達免疫抑制物來促進CRC 免疫逃逸。

3 CAFs 對巨噬細胞、NK 細胞及其他細胞的影響

腫瘤相關巨噬細胞（tumor -associated macrophages，TAMs）作為TME 的重要成分在調節抗腫瘤免疫反應中起著關鍵作用。TAMs 在腫瘤微環境中存在兩種表型，分別執行不同的功能。M1 巨噬細胞能通過激活免疫系統、產生腫瘤壞死因子產生抗腫瘤作用，而M2 巨噬細胞通過分泌免疫抑制因子發揮免疫抑制和促進腫瘤作用[40,57]。CAFs 通過各種機制誘導單核細胞在CRC 中募集并分化為M2巨噬細胞。首先，CAFs 通過白細胞介素（IL）-8/CXCR2 途徑吸引單核細胞浸潤至CRC 中，并通過上調結直腸癌細胞中的VCAM-1 表達和CAFs 的IL-6 分泌來促進單核細胞與CRC 黏附；其次，癌細胞介導CAFs 分泌IL-6 和GM-CSF 誘導單核細胞向M2 巨噬細胞分化，促使CRC 侵襲能力增加，導致CRC 患者的預后不佳[58-59]。巨噬細胞與CAFs 協同抑制自然殺傷（NK）細胞的功能，保護CRC 細胞免受NK 細胞介導的殺傷[57]。

NK 是浸潤到TME 中的免疫細胞之一，對癌細胞有殺傷作用[60-61]。CAFs 分泌的TGF-β 可以抑制NK 細胞的活化和細胞毒性[62-63]，CAFs 還可產生高水平的促炎細胞因子PGE2，并且通過多種機制調節NK 細胞的功能[64-66]。Li 等[67]從結直腸癌標本中提取CAFs 細胞，并與NK 細胞共培養，發現CAFs產生高水平的PGE2，可以通過多種方式影響NK細胞的功能，從而產生免疫抑制，包括NK 受體活化，細胞毒性活性和細胞因子產生。CAFs 誘導的M2 巨噬細胞可抑制NK 細胞對癌細胞的殺傷功能，說明TAMs 和CAFs 在腫瘤微環境中發揮協同作用，CAFs 可以通過其他免疫細胞調節NK 細胞的功能[59]。另有研究表示，在CRC 中使用表皮生長因子受體（EGFR）抗體可以抵消CAFs 對NK 細胞的抑制作用[68]。

中性粒細胞最初是在炎癥和損傷修復中發現。近年來有研究發現腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neutrophils, TANs）亦是TME 的重要組成成分，并促進腫瘤的生長、侵襲和轉移[69-70]。TANs 參與先天性和適應性免疫調節，并受環境影響可分化為2 種不同表型，即N1 抗腫瘤亞型和N2 促腫瘤亞型中性粒細胞[71-72]。N1 和N2 之間的可塑性通過TGF-β 和干擾素-β 信號傳導調節，如CAFs 通過分泌TGF-β 來誘導N2 極化，抑制TGF-β 后N1 則表達免疫激活因子和趨化因子[73]。在CRC 中，通過PGE2/EP 信號傳導能促進CAFs 和TANs 的活性，從而對抗腫瘤免疫產生影響[74]。

4 小結

綜上所述，CRC 中的CAFs 主要通過以下方式影響抗腫瘤免疫：1）分泌大量ECM 限制CD8+T 細胞的移動；2）通過TGF-β 通路下游的靶點NOX4使腫瘤對抗PD-1 耐藥，具有FAP 高表達的CAFs的腫瘤對抗PD-1 耐藥，CAFs 分泌的CCL2 是其中的主要介質；3）CAFs 自身表達CD73 產生ADO 作用于T 細胞上的A2a 受體產生免疫抑制；4）CAFs可以通過上調結直腸癌細胞中的VCAM-1 表達以及分泌IL-6 來促進單核細胞與CRC 腫瘤細胞的黏附，并誘導M2 型巨噬細胞的極化。CAFs 和M2 協同抑制NK 細胞的功能。以上內容表明，CAFs 不僅可通過分泌多種細胞因子或代謝產物抑制免疫細胞的功能，促進腫瘤的發生發展，同時還可以塑造腫瘤外基質，阻止藥物及免疫細胞向腫瘤組織的深層滲透，從而降低抗腫瘤的治療效果。未來在臨床有望可以通過對CAFs 的干預聯合免疫治療，為結腸癌患者的治療帶來新思路。