高通量測序技術在藥用植物微生物多樣性研究中的應用進展

韓霞，方佳麗，孟沈坤兒，朱曉堯，李楠，溫海虹

(溫州大學 生命與環境科學學院，城市水污染生態治理技術國家地方聯合工程研究中心，浙江省水環境與海洋生物資源保護重點實驗室，浙江 溫州 325035)

藥用植物是一類具有預防和治療疾病效果的植物，具有極高的藥用價值和經濟效益[1]。在人類抗爭疾病的長期歷史進程中，藥用植物發揮著至關重要的作用。中草藥在我國有著悠久的發展歷史，《神農本草經》、張仲景《傷寒雜病論》、李時珍《本草綱目》等都是我國歷史文化的瑰寶。藥用植物作為我國中藥的重要來源，約占總量的90%，而80%藥用植物為野生資源[2]。但由于目前野生藥用植物被無序開發和生境變化，導致野生藥材嚴重稀缺，再加上人工培育存在諸多問題，從而導致藥用植物遠不能滿足市場的需求。

植物與微生物是一個息息相關的共生功能體。對于藥用植物來說，與其相關的有益微生物可以促進藥用植物的生長發育；抵抗高低溫、干旱、鹽漬等非生物脅迫；蟲害、病害、雜草等生物脅迫以及影響次級代謝產物的生成和積累。因此，藥用植物微生物很可能是植物健康和生產力的重要驅動因素。

隨著生物技術的不斷進步，尤其是高通量測序技術的迅猛發展，對藥用植物微生物多樣性的研究從微觀形態學水平進入到了DNA測序水平。利用高通量測序研究藥用植物微生物多樣性對于提升藥物產量和品質具有重大意義。

1990年，2個科研團隊首次報道了從復雜環境樣品中獲得的一些16S rRNA序列，這是第一次打開地球上神秘的、未知的微生物世界的大門[3-4]。經過多年的探索，科學家又于1998年提出宏基因組(metagenome)的概念[5]，使微生物群落研究由特定基因克隆(16S rRNA、18S rRNA和ITS)向群體中全部微生物基因信息作為研究對象的轉變。從2000年開始二代測序方法不斷發展起來，將微生物群落高通量測序分析帶入全新的階段。2005年，454焦磷酸測序[6]，使微生物群落的分析由基于DNA的組學技術向高通量測序技術進階；隨著Illumina測序平臺的問世，之后高達10余種序列組裝算法以及各種軟件的不斷成熟，至此微生物群落研究飛速發展[7]。第三代測序平臺是基于單分子水平的檢測，具有長讀長優勢[8]。隨著DNA測序技術的發展，研究人員發現，那些未獲培養微生物的數量和種類遠遠超過了已獲培養的，這展現了微生物的巨大多樣性[9]。

藥用植物具有豐富多樣的微生物菌群，這些微生物在其生長發育、遺傳、代謝功能中發揮著不可忽視的作用。因此，通過對藥用植物微生物進行深入系統地研究可以加快對未培養微生物的開發和利用，提供關于其生理穩定性和功能的關鍵信息。目前，對藥用植物微生物的高通量測序分析研究中大多采用二代和三代高通量測序技術。本文將簡述高通量測序技術并介紹該技術近年來在藥用植物微生物研究中的應用進展以及其使用高通量測序技術將要應對的挑戰。

1 高通量測序技術簡介

高通量測序(high-throughput sequencing，HTS)，又稱為“下一代測序”(next-generation sequencing，NGS)或“深度測序”(deep sequencing，DS)，其特點為能一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等[10-11]。它是相對于一代Sanger測序技術和焦磷酸測序技術革命性的轉變，是一種新型技術，主要包括Roche 454焦磷酸測序平臺、Illumina Solexa合成測序平臺以及ABI SOLiD連接法測序平臺，這些也被稱為第二代測序技術[12]。它在保持高靈敏度和高精準度的同時，提高了測序速度并大大降低了測序成本?；贜GS的擴增子測序技術是目前在研究中最常用，也是文獻報道最多的微生物高通量測序手段。它的原理是基于微生物基因組的特征性序列(如細菌的16S rDNA，真菌的18S rDNA和ITS等)進行分析微生物群落組成和多樣性。但二代測序平臺有讀長的限制，在實際檢測中無法使用高通量測序技術對擴增子整個基因全長進行測序。伴隨著三代測序技術的進步，克服了二代測序讀長短的劣勢。因此，利用三代測序技術平臺，以Pacific Bio[13]為主進行長片段的擴增和序列讀取成為擴增子測序發展的活躍領域。由于三代測序具有成本低、周期短、通量高、精度準，讀長長等優勢，使得微生物基因序列全長測序成為可能，從而顯著提高了基于Sanger測序和NGS測序技術所達不到的高水平物種鑒定的準確性、清晰度，以及對樣品中微生物群落的高還原度。目前，高通量測序研究已檢測到數萬個分類操作單元(OTU)。大部分OTU在不同的分類水平上，甚至在門水平上都無法確定其分類地位，這也凸顯了基于微生物擴增子的高通量測序方法在量化并評估微生物多樣性方面的重要意義。微生物群落在驅動多種生態系統功能和生態過程方面發揮著核心作用，目前有越來越多的研究傾向于高通量測序技術分析微生物多樣性。轉錄組測序[14](transcriptome sequencing，RNA-Seq)是指利用高通量測序技術進行cDNA測序，能夠全面快速地獲取某一物種某一狀態下的幾乎所有轉錄本。它具有無需參考物種基因組信息，仍可以進行轉錄組測序的優勢。其測序結果可以反映特定條件和特定時間點的基因表達情況，對于挖掘其功能基因具有重要意義。另外，宏基因組測序[15]是利用二代測序技術或三代PacBio高通量測序平臺對特定環境下微生物群體基因組進行高通量測序，在分析微生物遺傳多樣性、種群結構、進化關系的基礎上，可進一步探究微生物群體功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系，發掘潛在的生物學意義。與傳統微生物研究方法相比，宏基因組測序技術規避了絕大部分微生物不能培養、痕量菌無法檢測的缺點，因此，近年來在微生物學研究中得到了廣泛應用。與二代測序方法相比，三代宏基因組采用PacBio SMRT測序的長讀長可以輕松覆蓋基因區間或基因特異性區域，減少部分拼接錯誤，更真實反映菌群的復雜組成，有效提高微生物群落鑒定的分辨率，為深入功能研究奠定基礎。

綜上，隨著NGS技術不斷發展和成熟，尤其到了第三代測序技術，憑借其低成本、高通量、簡流程和高靈敏性等特點，在微生物研究領域快速廣泛地應用，成為當前探究微生物群落中的成員鑒定和理解微生物功能作用機制的有效手段，為微生物多領域的研究提供新的想法和途徑。

2 高通量測序技術在藥用植物微生物研究中的應用

2.1 物種和群落結構多樣性

16S rDNA/18S rDNA/ITS/是微生物系統分類學研究中最適用和最常用的標志[16]。運用高通量測序技術檢測藥用植物中微生物(原核生物16S rDNA，真核生物18S rDNA和ITS)功能基因等特定區段，可以獲得藥用植物微生物物種豐度、物種分類、群落組成和進化關系。這些基因序列均包括可變區和保守區，保守區序列可以反映物種間的親緣關系，而可變區序列則能體現物種間的差異。通過對這些序列可變區域的測定和比對可以探究并揭示藥用中的優勢物種、稀有物種及一些未知的物種，能真實地反映藥用植物的微生物群落的組成情況。藥用植物是已被用作治療各種疾病的傳統草藥。然而，對這些植物的需求增加凸顯了保護瀕危物種的重要性。下一代測序(NGS)技術的重大進步加快了藥用植物的研究。

劉蓬蓬等[17]首次通過基于Illumina MiSeq 平臺的第二代高通量測序技術對中藥黃芪中傳統培養法和非培養法未檢測到的及痕量內生細菌的種類進行宏基因組測序分析，準確、科學地探析了黃芪中內生細菌的多樣性，為篩選目的功能菌種并進行微生物純種或混合菌種發酵提供科學依據。另外，李瑩等[18]基于Illumina MiSeq第二代高通量測序技術對野生甘松和人工栽培甘松的藥用部位(干燥根及根莖，為漢藏藥材)的內生細菌的16S rDNA V4～V5區進行序列測定，分析了甘松根際細菌和根及根莖內生細菌群落分布和多樣性，篩選出核心功能微生物混合菌群，該研究對改良仿野生培育甘松土壤的微生物環境具有理論指導意義。劉麗等[19]運用高通量測序技術研究了3種類型一年生霍山石斛菌根真菌，深入了解其群落多樣性、差異性及結構組成，為指導霍山石斛合理采收及應用提供依據。Wang等[20]提出用高通量測序技術指導傳統培養分離藥用植物內生菌的策略。利用高通量測序技術對藥用植物內生菌結構組成和多樣性進行整體了解，確定宿主的優勢內生菌。然后根據各優勢內生菌的特性模擬微生物原有生境然后設計合適的培養基進行分離培養，最后對分離菌株進行功能研究。2022年，Zuo等[21]利用高通量測序法分析了3種石斛品種(霍山石斛、鐵皮石斛、串珠石斛)成熟期根際土壤中的微生物群落。在該研究中，研究人員從3種石斛屬植物中總共獲得了240 320個序列和11 179個OTU。該研究填補了石斛根際微生物群落的知識空白，為后續微生物功能挖掘和生物肥料研究提供了理論依據。高通量測序技術還應用在其他藥用植物，如三七[22-23]、人參[24]、丹參[25]、北沙參[26]等微生物群落的多樣性研究中。這些將為研究者全面認識藥用植物微生物物種和結構多樣性提供參考。

2.2 功能多樣性

藥用植物具有豐富多樣和良好生物活性的次級代謝產物，如人參當中的人參皂苷、石斛中的多糖和生物堿、靈芝當中的三萜和多糖以及丹參當中的丹參酮等都被用作藥用成分。研究發現，這些有活性的次級代謝產物的合成與藥用植物微生物息息相關[27-29]。但這些次生代謝產物在植物體內含量較低，且絕大多數的生物合成途徑并不完全清晰。再加上藥用植物并不像模式植物那樣具有完整的基因組信息和清楚的遺傳背景。所以需要通過基于藥用植物微生物轉錄組進行高通量測序，挖掘其內在活性成分生物合成相關的功能基因并分析其基因表達規律和功能調控機制。Wang等[30]對鐵皮石斛根際和內球體樣本進行16S rRNA擴增子測序和宏轉錄組測序，解析了鐵皮石斛微生物群落多樣性和代謝功能多樣性。并通過多種數據庫分析表明，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、遺傳信息處理和環境信息處理等代謝途徑顯著富集，猜測這些可能與鐵皮石斛在逆境中的生存有關。Zhong等[31]利用高通量轉錄組測序技術揭示了藥用植物甘草微生物-代謝產物的綜合調節模式。解析了野生型和栽培型烏拉爾甘草主要藥性物質甘草苷和甘草酸的影響因素，分析了甘草根部代謝產物、基因表達與微生物群落之間的相關性。發現野生甘草的差異表達基因數量(DEG)高于栽培甘草的DEGs數量。而且功能富集分析表明，這些DEGs在與次級代謝產物(如類黃酮、苯丙烷和二萜)合成相關的功能方面顯著富集，可能積極促進萜類和黃酮類化合物的合成和積累。Jo等[32]利用三代全長轉錄組測序技術對人參的根、莖、花和葉4種組織進行研究，產生了超過135 000個轉錄本，平均長度3.2 kb。該團隊成功鑒定了與三萜皂苷合成，植物激素信號通路(包括生長素和細胞分裂素)等有關的特定全長基因，同時也鑒定了轉座子為人參轉錄活性研究提供了依據。Li等[33]團隊利用三代PacBio RS Ⅱ平臺Iso-Seq方法對黃芪葉和根組織進行轉錄本測序，在葉中共得到27 975個轉錄本，在根中共得到22 343個轉錄本。除了得到更長的轉錄本、鑒定了新的同源異構體(isoform)以外，還鑒定了參與黃芪苷、膽鈣素和毛蕊異黃酮苷生物合成的基因潛在的轉錄本。目前為止已經對很多藥用植物進行了轉錄組測序研究，高通量測序技術憑借在沒有獲得物種的基因組信息的情況下仍可以進行轉錄組測序這個優勢，被廣泛應用在直接研究藥用植物微生物功能多樣性中。

2.3 遺傳(基因)多樣性

藥用植物在基因水平上攜帶的各類遺傳物質和遺傳信息的總和是藥用植物微生物多樣性的本質和最終反映。傳統微生物全基因組測序首先需要經純培養，獲得分離單一物種的DNA后才能進行全基因組測序。但是環境中存在著大量的不可培養微生物，而宏基因組可以對生境中所有DNA直接測序，通過生物信息學分析處理能夠大大減少分離及純化菌株的工作。藥用植物微生物宏基因組高通量測序數據表明，不同藥用植物種群間以及同一植物不同部位的遺傳物質和基因表達具有巨大的差異[34-35]。這些差異對于藥用植物未知和抗性基因篩選、藥用活性成分代謝通路的解析、遺傳多樣性的研究和種質資源保護等方面具有重要意義。目前在二代和三代測序技術的結合下，研究者對藥用植物微生物基因組研究有了新思路。Kui等[22]基于高通量宏基因組測序首次開展了三七在不同種植模式下的微生物結構和功能的研究，測序產生103.6 Gb的數據，得到1.64億個單基因。該研究進一步對不同種植模式的三七根際微生物的核心功能進行分析，超過35%的單基因通過比對KEGG數據庫，共注釋了16 396個功能通路，這些通路主要與41個KEGG(2級)通路有關。該項工作為研究三七等人參屬植物與根際微生物互作，栽培和育種提供了新的思路。Dong等[36]采用宏基因組高通量測序技術，分析了人參根際土壤真菌群落多樣性及組成的變化，闡述了人參栽培模式對根際微生態的影響，為克服連作障礙提供策略。Wei等[37]應用宏基因組測序技術對不同區域的澤瀉屬中草藥的根際微生物組的結構和功能進行了比較分析。重點關注了其結構和功能以及參與原甾烷三萜(protostane triterpenes)生物合成的基因。并且了解了主要的門是變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門。芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、厭氧黏細菌(Anaeromyxobacter)和假雙頭斧形菌屬(Pseudolabrys)是不同地區潛在功能差異的主要因素。這項工作填補了澤瀉根際微生物組的知識空白，為研究其有益微生物提供了寶貴的參考。Guo等[38]利用宏基因組測序技術對低中高3個水分處理(Group1、Group5和Group9)下的三七根際土壤微生物進行功能比較?；贙EGG、CAZy、CARD、ARDB、VFDB、NR、QS、PHI、P450等數據庫注釋結果證明，土壤水分變化會引起三七根際土壤微生物功能基因發生顯著改變。該研究在大量田間和溫室試驗的基礎上，綜合利用三七根際土壤微生物高通量測序、宏基因組學和微生物培養組學等方法揭示了土壤水分通過調節土壤中有益和有害微生物菌群的平衡來影響三七根腐病發生的機制。因此，該研究為通過土壤水分管理來控制土傳病害提供了新的策略。

由此可見，宏基因組高通量測序技術能夠使我們更大程度地了解和掌握藥用植物微生物的基因多樣性和遺傳背景信息，這對于藥用植物活性成分生物合成途徑的解析都具有極大的價值。

3 總結與展望

隨著現代分子技術的發展，高通量測序技術能夠以一種綜合的方式研究微生物群落，能更具體地研究微生物群落的組成和分類特征及其功能特性?？紤]到二代測序和三代測序結合使用在解析藥用植物活性成分的生物合成途徑和功能基因調控機制，以及藥用植物的多樣化分析和系統進化探究等重要方面上發揮的潛力，該技術有望成為探究藥用植物與微生物之間關系的重要技術手段。這將把藥物植物微生物基因組水平的研究帶入新的高度，展現出不可替代的作用。然而，高通量測序技術的應用仍面臨以下方面的挑戰：一是微生物的高通量測序會伴隨海量數據的產生[39]，處理這些海量數據需要與更多學科交叉研究，如數學、計算機學和信息學等；二是目前各種高通量測序技術在實驗流程及分析過程中會出現方法間的偏差和未標準化等問題[40]，還需要進一步探討和改進。因此，在選擇使用高通量測序時，也要注意其局限性。

綜上所述，雖然高通量測序存在數據分析難，技術方法偏差等問題，但因其有低成本、超高通量、簡流程、高靈敏度和精度等特點，使其在藥用植物微生物多樣性研究中的應用具有優越性。因此，高通量測序是一個認知藥用植物微生物多樣性預測的有效技術手段。