D-乳酸對免疫低下小鼠的免疫調節作用

杜心茹,李海濤

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214000)

免疫應答是人體免疫系統的關鍵防御機制,對生命健康至關重要。免疫穩態通過T淋巴細胞介導的細胞免疫和B淋巴細胞介導的體液免疫進行調節。營養不良、化療和壓力等多種因素可導致免疫低下,免疫低下與各種疾病發展密切相關,如化療、放療和免疫抑制劑所致的免疫低下會增加癌癥的風險[1]。因此,尋求預防和緩解免疫低下的有效策略至關重要。

酸奶中富含多種具有免疫調節活性的物質,在調節機體免疫方面具有較大的潛力[2]。以往關于酸奶的免疫調節作用研究大多聚焦于益生菌、蛋白質或維生素等[3-4],然而,D-乳酸作為酸奶中乳酸菌發酵的重要代謝產物卻很少受到關注。乳酸包含D-乳酸和L-乳酸兩種光學異構體,廣泛存在于傳統發酵食品中,如酸奶、泡菜等[5]。在酸奶生產過程中,保加利亞乳桿菌可以將90%的丙酮酸轉化為D-乳酸[6]。研究普遍認為,人體內只存在可以快速代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶,而不存在D-乳酸脫氫酶,因此血漿D-乳酸濃度升高會導致酸中毒[5]。然而,最新研究對D-乳酸的安全性和有效性進行了全面評估,證明小鼠每天攝入2 000 mg/kg的D-乳酸并不影響其正常生長發育,且與L-乳酸相比,D-乳酸由于其藥代動力學優勢而具有更強的抗炎特性[7]。此外,D-乳酸在酸奶預防小鼠結腸炎相關結直腸癌中具有重要作用,對腸巨噬細胞具有一定的免疫調控潛力[8]。因此,D-乳酸很可能是一種潛在的食品營養因子。

本文利用環磷酰胺建立免疫低下模型,通過分析小鼠體質量、免疫器官指數、遲發型變態反應程度、骨髓形態、外周血細胞數量、免疫細胞核轉錄因子、血清細胞因子水平等指標,評估D-乳酸對免疫低下小鼠的免疫功效,為緩解免疫低下提供新思路,并為傳統發酵食品的生理功效和D-乳酸的進一步開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級Balb/c雌性小鼠,體質量(20.0±2.0) g,6周齡,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 試劑與儀器

D-乳酸鈉、環磷酰胺、鹽酸左旋咪唑,Sigma-Aldrich;5%和20%(體積分數)綿羊紅細胞,南京森貝伽生物科技有限公司;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;外周血淋巴細胞提取試劑盒,北京索萊寶生物科技有限公司;免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)M、白細胞介素(interleukin, IL)-2、IL-4試劑盒,南京建成生物工程研究所。

實時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;全自動血液細胞分析儀,深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司;流式細胞分選儀,美國BD公司;落地式離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗分組

6周齡SPF級Balb/c雌性小鼠飼養于江南大學實驗動物中心,許可證號為SYXK(蘇)2021-0056。動物實驗通過江南大學實驗動物管理與動物福利倫理委員會批準,倫理編號為JN.No20220315c0900425[012]。小鼠飼養屏障環境為:溫度21～25 ℃,相對濕度50%～60%,12 h晝夜循環。適應性飼養7 d后,將實驗動物隨機分為空白組、環磷酰胺模型組、鹽酸左旋咪唑陽參組及D-乳酸低、中、高劑量組,每組各7只。除空白組外,其余各組每天腹腔注射80 mg/kg bw的環磷酰胺,建立免疫低下小鼠模型,空白組腹腔注射等量的生理鹽水,連續3 d。從第4天開始,陽參組給予小鼠灌胃40 mg/kg bw鹽酸左旋咪唑,D-乳酸低、中、高劑量組分別灌胃75、150、300 mg/kg bwD-乳酸鈉溶液,空白組和模型組灌胃等量的蒸餾水,每日觀察各組小鼠狀態,連續治療15 d后,按照動物福利原則處死小鼠并取材,檢測各項指標。

1.3.2 體質量和免疫器官指數

在小鼠造模前稱其體質量,記為初始體質量;在小鼠造模后稱其體質量,記為造模后體質量;在D-乳酸灌胃15 d后稱其體質量,記為終末體質量。小鼠處死后,取脾臟和胸腺,分別稱重。將免疫器官質量與體質量的比值定義為免疫器官指數,單位為mg/g。免疫器官指數按公式(1)計算:

(1)

1.3.3 遲發型變態反應

遲發型變態反應是一種體內細胞免疫檢測方式,當致敏的T淋巴細胞與抗原再次接觸時,引起T淋巴細胞的激活,受刺激部位出現明顯腫脹,腫脹程度表明T淋巴細胞的免疫應答水平[9]。在給藥第11天,將0.2 mL 5%(體積比)的綿羊紅細胞注射到小鼠腹腔內,使用游標卡尺測量右后足跖的厚度。第4天后,將20 μL 20%(體積比)的綿羊紅細胞注入到右后足跖。在第二次注射后的24 h內,測定足跖的厚度。同一部位測量3次,取平均值。厚度的增加量作為評估遲發型變態反應程度的指標[10]。

1.3.4 骨組織形態學

摘除小鼠股骨,小心去除肌肉組織,將小鼠股骨組織在4%多聚甲醛中固定24 h后,經脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片步驟完成標本的制作。標本經過烤片、二甲苯脫蠟、復水、蘇木精-伊紅(H&E)染色、脫水、透明及中性樹膠封片后,在切片掃描儀下觀察[11]。

1.3.5 骨髓細胞凋亡檢測

無菌條件下摘除小鼠股骨,小心去除肌肉組織,無菌注射器插入骨髓腔內,使用DMEM培養基(胎牛血清10%,青霉素100 U/mL,鏈霉素0.1 mg/mL)提取骨髓細胞,將液體樣品收集到無菌離心管中離心,計數備用[12]。按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作說明[13],取5×104個細胞,用195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞,分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻。室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min,立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率,細胞凋亡率按公式(2)計算:

(2)

1.3.6 外周血細胞計數

末次灌胃第1天,小鼠眼眶后靜脈叢取血。麻醉小鼠并進行眼部消毒,用毛細管輕輕穿刺小鼠眼眶下方的靜脈血管,取50 μL全血于EDTA抗凝管中。完成取樣后,用干凈棉球輕輕壓迫取樣處,幫助止血,確保小鼠恢復到正常狀態。將樣本充分混勻,立即采用全自動血細胞分析儀對血細胞進行計數。

1.3.7 外周血淋巴細胞提取

末次灌胃第2天,小鼠眼眶后靜脈叢取血,方法同1.3.6節。取適量全血于EDTA抗凝管中,充分混勻。采用小鼠外周血淋巴細胞分離液試劑盒,無菌條件下分離外周血淋巴細胞,按照操作說明,使用與血液等體積的組織稀釋液稀釋全血,加入適量分離液,離心后小心吸取白膜層細胞,用PBS洗滌并重懸2次后,離心去上清,將淋巴細胞分離出來備用[14]。

1.3.8 免疫細胞核轉錄因子表達

按照Trizol說明書提取外周血淋巴細胞的總RNA,使用逆轉錄試劑盒將RNA轉化為cDNA。使用實時定量PCR系統評估基因表達水平,引物序列見表1。通過將目標基因與β-actin進行比較,并使用2-ΔΔCt方法對目標基因進行相對定量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.9 血清細胞因子水平

將新鮮全血在室溫條件下靜置1 h,4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min。吸取上清液即為血清,采用ELISA試劑盒測定血清中細胞因子IL-2、IL-4、IgM的含量。

1.4 數據統計分析

使用Graphpad Prism 8.0軟件進行數據分析和繪圖,采用均值±標準差表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),并認為P<0.05差異有統計學意義。以符號數目區分顯著性等級,其中,與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1。

2 結果與分析

2.1 體質量

如表2所示,各組小鼠初始體質量無統計學差異,環磷酰胺造模3 d后,與空白組相比,各組小鼠的體質量均顯著降低(P<0.01)。實驗15 d后,與模型組相比,陽參組小鼠的終末體質量得到顯著恢復(P<0.01),而D-乳酸低劑量組小鼠的終末體質量無明顯變化,D-乳酸中高劑量組小鼠的終末體質量得到顯著恢復(P<0.05)。研究結果表明中高劑量D-乳酸可以恢復環磷酰胺所致的小鼠體質量下降。

表2 D-乳酸對免疫低下小鼠體質量的影響Table 2 Effect of D-lactate on the body weight of immunosuppressive mice

2.2 免疫器官指數

如圖1所示,與空白組相比,模型組小鼠的脾臟指數和胸腺指數均顯著減小(P<0.001)。實驗15 d后,與模型組相比,陽參組小鼠脾臟指數(P<0.01)和胸腺指數(P<0.01)顯著增加,D-乳酸低、中、高劑量組小鼠脾臟指數(P<0.05)和胸腺指數(P<0.01)均有不同程度的增加。以上結果說明D-乳酸可以提高免疫低下小鼠的免疫器官發育指數。

a-脾臟指數;b-胸腺指數

2.3 遲發型變態反應

如圖2所示,與空白組相比,模型組小鼠足跖腫脹程度顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽參組小鼠足跖腫脹程度顯著增加(P<0.001),D-乳酸中劑量組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)小鼠足跖腫脹程度均顯著增加。以上結果說明D-乳酸可以劑量依賴性地提高免疫低下小鼠的遲發型變態反應程度。

a-空白組;b-模型組;c-陽參組;d-低劑量組;e-中劑量組;f-高劑量組;g-足跖腫脹程度

2.4 骨髓結構形態

如圖3所示,空白組小鼠的骨髓組織結構清晰,其中成骨細胞(箭頭所示)和髓樣細胞(三角所示)數量眾多,緊密排列。與空白組相比,環磷酰胺模型組的骨髓組織結構混亂,成骨細胞和髓樣細胞數量明顯減少,排列松散。與模型組相比,陽參組骨髓組織結構得到改善,成骨細胞和髓樣細胞數量得到恢復,D-乳酸攝入后也有相似的結果,特別是中高劑量的D-乳酸可以明顯恢復骨髓組織結構與成骨細胞和髓樣細胞的數量。以上結果說明,D-乳酸可以恢復免疫低下小鼠的骨髓形態結構。

2.5 骨髓細胞凋亡

如圖4和圖5所示,空白組的細胞凋亡率為(1.45±0.22)%,而與空白組相比,模型組的細胞凋亡率顯著上升(P<0.000 1),為(12.50±1.08)%。與模型組相比,陽參組的細胞凋亡率顯著降低(P<0.01),為(7.30±0.85)%,D-乳酸中劑量組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)的細胞凋亡率顯著降低,分別為(8.80±0.49)%和(8.11±0.64)%。以上結果說明,D-乳酸可以改善免疫低下小鼠的骨髓細胞凋亡。

a-空白組;b-模型組;c-陽參組;d-低劑量組;e-中劑量組;f-高劑量組

圖5 D-乳酸對免疫低下小鼠骨髓細胞凋亡的影響

2.6 血細胞計數

如圖6所示,與空白組相比,環磷酰胺模型組小鼠的外周血白細胞、淋巴細胞和紅細胞數量顯著減少(P<0.001),血紅蛋白濃度沒有明顯變化。與模型組相比,陽參組白細胞數量(P<0.001)、淋巴細胞數量(P<0.001)和紅細胞數量(P<0.01)顯著增加,D-乳酸灌胃后,各劑量組的白細胞和淋巴細胞數量恢復至空白組水平,而各組間紅細胞與血紅蛋白濃度均無顯著變化。以上結果說明,D-乳酸可以恢復免疫低下小鼠血液中的白細胞和淋巴細胞數量,而對紅細胞數量和血紅蛋白濃度無顯著影響。

a-白細胞數;b-淋巴細胞數;c-紅細胞數;d-血紅蛋白

a-T-bet mRNA相對表達量;b-GATA3 mRNA相對表達量

2.7 免疫細胞核轉錄因子表達

如圖7所示,與空白組比較,模型組T-bet,GATA3 mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.000 1)。與模型組比較,陽參組的T-bet和GATA3 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.000 1),D-乳酸中高劑量組的T-bet mRNA相對表達量顯著升高(P<0.001),只有D-乳酸高劑量組GATA3的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。以上結果說明,D-乳酸可以部分恢復免疫低下小鼠的免疫細胞核轉錄因子表達水平。

2.8 血清細胞因子水平

如圖8所示,與空白組相比,模型組小鼠血清中IL-2,IL-4,IgM質量濃度顯著降低(P<0.001)。與模型組相比,陽參組IL-2,IL-4,IgM質量濃度顯著增加(P<0.001),D-乳酸中劑量組(P<0.01)和高劑量組(P<0.001)的IL-2質量濃度顯著升高,D-乳酸中高劑量組的IL-4質量濃度顯著升高(P<0.05),D-乳酸高劑量組的IgM水平顯著升高(P<0.05)。上述結果表明,D-乳酸可以改善免疫低下小鼠的血清細胞因子水平。

a-IL-2質量濃度;b-IL-4質量濃度;c-IgM質量濃度

3 討論

環磷酰胺是一種廣譜的化療藥物,通過代謝產物的交聯作用來烷基化DNA和蛋白質,影響癌細胞增殖的能力。環磷酰胺在殺死腫瘤細胞的同時會對機體免疫系統產生毒副作用,影響免疫器官發育,導致體重減輕和骨髓抑制等[15]。骨髓抑制往往伴隨著骨髓結構紊亂,血細胞數量減少、功能減弱,血清細胞因子分泌異常等現象,從而進一步削弱機體免疫能力[16]。

本文主要從D-乳酸改善骨髓抑制的角度,為緩解環磷酰胺所致的免疫低下尋求一種有效的策略。

酸奶通常含有約0.7%的D-乳酸,體質量80 kg成人的酸奶每日推薦攝入量為150～200 g,相當于給小鼠每日口服D-乳酸劑量為150 mg/kg[7]。本文探究了不同劑量的D-乳酸對環磷酰胺所致的免疫低下小鼠的免疫調節作用。結果顯示,中高劑量D-乳酸治療顯著恢復了白細胞和淋巴細胞的數量,對紅細胞和血紅蛋白含量沒有顯著影響,這與徐光沛等[17]研究結果一致,表明D-乳酸在短期內并未對紅細胞和血紅蛋白含量產生顯著影響,可能與紅細胞的生長周期較長有關。因此,D-乳酸緩解環磷酰胺所致的骨髓抑制與白細胞數量的提高有關,在短期內與紅細胞和血紅蛋白含量可能沒有直接關系。

淋巴細胞是白細胞的一種,T-bet和GATA3分別為輔助性T淋巴細胞(helper T cell,Th)1、Th2的特異性核轉錄因子,分別調控機體細胞免疫和體液免疫功能及相關細胞因子(IL-2, IL-4)的產生[18]。將小鼠外周血淋巴細胞分離提取作進一步研究,發現中高劑量的D-乳酸可以顯著恢復淋巴細胞核轉錄因子T-bet的mRNA表達量,而只有高劑量的D-乳酸可以顯著恢復核轉錄因子GATA3的mRNA表達量。因此,D-乳酸恢復骨髓抑制可能與促進T淋巴細胞向Th1分化有關,在提高細胞免疫功能方面具有顯著的作用,這與遲發型變態反應實驗結果恰好吻合。

本研究利用環磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,從多個方面對D-乳酸緩解環磷酰胺所致的小鼠免疫低下進行初步研究,包括體質量、免疫臟器指數、遲發型變態反應程度、骨髓抑制等。結果表明,D-乳酸在免疫器官、免疫細胞和免疫活性分子等方面均顯示出改善效果,在中高劑量下尤為顯著,且不同劑量D-乳酸體現了改善免疫低下小鼠不同免疫指標的潛力。盡管本研究探索了D-乳酸對免疫低下的改善作用,但其調控機制需進一步探究。未來工作可采用流式細胞術、免疫磁珠等,分型鑒定免疫細胞,進一步探討D-乳酸與其受體的關系,有助于更全面地了解D-乳酸在免疫功能調控中的作用途徑以及其在免疫治療中的潛在應用前景。