桑葚花色苷對PC12細胞氧化損傷的保護作用

朱曉晗,鐵芳芳,歐陽健,王洪倫,殷軍港*

1(煙臺大學 生命科學學院,山東 煙臺,264005)

2(中國科學院藏藥研究重點實驗室,西北高原生物研究所,青海 西寧,810008)

3(青海省藏藥研究重點實驗室,青海 西寧,810008)

氧化應激是指機體內氧化與抗氧化系統不平衡引起的一種損傷狀態,從而導致活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多[1]。機體在氧化應激狀態下可引起炎癥反應、細胞凋亡、自噬和神經元功能障礙,這與阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森病(Parkinson′s disease,PD)和亨廷頓氏病(Huntington′s disease,HD)等神經退行性疾病(neurodegeneration disease,NDD)密切相關[2]。機體在受到外部有害刺激H2O2作用時,ROS的產生增多,并且細胞氧化還原穩態遭到破壞時,抗氧化酶如還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)等活性降低[3],而丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量激增[4],過度積累的MDA將間接導致凋亡蛋白的過表達從而引發細胞凋亡。

細胞內ROS水平增加能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)介導的信號通路,進一步起到改變細胞增殖、分化、凋亡等多種作用[5]。ROS也可以激活c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)信號通路,其活性通常參與細胞凋亡的進展,JNK的活化可以導致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活化和基因表達,也會增加Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)與B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的比值,導致神經元死亡[6]。此外有研究表明ROS的積累會導致機體內的核因子E-2-相關因子(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)的表達水平降低[7],Nrf2是一種轉錄因子,可調節基因穩定性和轉錄活性,當機體遭受氧化損傷時Nrf2易位到細胞核,增強下游基因的轉錄水平從而達到一定的抗氧化效果[8]。因此有效激活MAPK、JNK、Nrf2等信號通路有助于研究一些天然抗氧化物的作用機制。天然產物一直是治療NDD的新藥的主要來源,在近年的研究中近90%來源于天然化合物[9],如燈盞花素[10]、姜黃素[11]、人參皂苷[12]、黃芩素[13]可以抑制細胞內ROS的積累,提高抗氧化酶活性。目前許多研究表明飲食中添加一些天然抗氧化產物可以有效維持機體內抗氧化平衡[14],因此開發一些具有抗氧化活性的具有藥食同源的功能性食品并闡明其作用機制具有十分重要的意義。

桑葚(Fructusmori)屬于?？茖僦参锏墓?又名桑果[15],是一種藥食同源的食品[16],其不僅含有多種營養成分,如維生素、有機酸、胡蘿卜素、礦物質等,同時也富含花青素和酚類等化學成分[17]?；ㄇ嗨厥且环N天然色素,屬于二苯基色原酮類成分,對腫瘤、炎癥、心腦血管疾病等多種疾病具有預防和治療作用[18]。此外花青素具有很強的抗氧化活性,可以通過抵抗細胞內的氧化應激水平從而對對神經細胞起到保護作用[19],從而有效預防和改善神經退行性疾病。矢車菊素類衍生物是桑葚中花色苷的主要存在形式,其主要成分是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷(cyanidin-3-O-rutinoside,C3R)[20]。C3G可以保護細胞免受氧化損傷、抑制結直腸癌細胞的增殖以及改善糖脂代謝障礙[21-23],C3R具有抵抗鏈脲佐菌素 (streptozotocin,STZ)誘導胰島β細胞凋亡的作用[24]。雖然已有研究證明,桑葚花色苷具有顯著的神經保護作用,但是其物質基礎和相關作用機制尚不明確?；诖?本論文通過H2O2誘導建立大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)氧化損傷模型來考察桑葚花青素中的2個主要單體化合物的C3G和C3R對H2O2誘導的氧化損傷保護作用及其潛在機制,從而為桑葚花色苷的神經保護作用的研究提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C3G、C3R由實驗室自制,純度均在90%以上,結構如圖1所示。

a-C3G;b-C3R

PC12細胞株,中國科學院上海細胞庫;噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT),北京索萊寶科技有限公司;DCFH-DA熒光染料,美國Sigma公司;SOD、GSH檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;MDA、CAT檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;JNK、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)、Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bax,美國CST公司;兔二抗,武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀,美國BioTek公司;激光共聚焦顯微鏡,德國Leica公司;Tanon 5200化學發光成像系,上海天能科技有限公司;電泳儀,美國Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 C3G、C3R溶液制備

將冷凍干燥后的C3G、C3R粉末用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成100 mmol/L儲備液,使用時用含各種氨基酸和葡萄糖的培養基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)稀釋1 000倍得到濃度為100 μmol/L C3G、C3R溶液,隨后進行等比稀釋即可。

1.3.2 細胞培養與傳代

將PC12細胞接種在高糖DMEM培養基[10%胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS)]中,然后置于二氧化碳培養箱培養,細胞融合度達到80%左右時將原代細胞按1∶4分種傳代培養。

1.3.3 H2O2誘導的細胞氧化損傷模型建立

實驗每組設置6個復孔,細胞在96孔板培養24 h后,加入用DMEM培養基配制的10個不同濃度(0、50、100、200、400、500、600、700、800、1 000 μmol/L)的H2O2溶液,繼續培養12 h;隨后棄掉培養基,然后每孔加入100 μL DMEM和10 μL MTT,孵育4 h,棄掉上清液,各孔中加入100 μL DMSO,37 ℃振蕩10 min,490 nm處測量吸光度值,并根據公式(1)計算存活率:

(1)

1.3.4 檢測H2O2及C3G、C3R對細胞活力影響

細胞于96孔板培養24 h后,加入用DMEM配制好的不同濃度的(0、1、2、5、10、25、50、100 μmol/L)含有或不含有H2O2的C3G和C3R溶液,培養12 h;棄掉培養基,然后每孔加入100 μL DMEM和10 μL MTT,孵育4 h,棄去上清液,各孔中加入100 μL DMSO,37 ℃振蕩10 min,490 nm處測量吸光度值,并根據公式(1)計算存活率。

1.3.5 C3G、C3R對H2O2誘導PC12細胞內ROS含量測定

細胞于24孔板中培養24 h后,每孔加入不同濃度(25、50、100 μmol/L)且含有650 μmol/L H2O2的C3G、C3R干預12 h后,吸走培養基,每孔加入10 μmol/L的DCFH-DA探針孵育30 min,孵育結束后用PBS清洗3次,利用激光共聚焦顯微鏡進行拍照(激發波長Ex:504 nm、發射波長Em:529 nm)。

1.3.6 C3G、C3R對H2O2誘導PC12細胞內MDA含量以及抗氧化酶活性的影響

細胞接種于6孔板中培養24 h后,每孔加入不同濃度(25、50、100 μmol/L)且含有650 μmol/L H2O2的C3G、C3R干預12 h后進行MDA、GSH、CAT、SOD生化指標測定并計算MDA含量以及抗氧化酶(SOD、GSH、CAT)的含量,計算如公式(2)～公式(5)所示:

(2)

細胞GSH活性(U/mg蛋白)=

(3)

細胞過氧化氫酶活性(U/mg蛋白)=

(4)

細胞SOD活性(U/mg蛋白)=

(5)

1.3.7 C3G、C3R對H2O2誘導PC12細胞內抗氧化及凋亡蛋白表達量的影響

細胞接種于6孔板中培養24 h后,每孔加入不同濃度(25、50、100 μmol/L)且含有650 μmol/L H2O2的C3G、C3R干預12 h,隨后加入細胞裂解液裂解15 min后進行蛋白提取。蛋白定量變性后,進行電泳分離,隨后在冰浴下將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h,隨后加入對應一抗(JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、Tubulin、Nrf2、HO-1、Cleaved-Caspase-3、Caspase-3、Bax),4 ℃條件下孵育過夜,次日用1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記的二抗孵育1 h,隨后進行化學發光顯影。

1.4 數據處理

Westerm Blot以及熒光照片數據采用Image J軟件進行處理,采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行統計學分析。數據用平均數±標準差(x±s)表示,各組均數之間采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度C3G、C3R對細胞活力的影響

不同濃度的C3G、C3R作用PC12細胞12 h后,在1～100 μmol/L內對PC12細胞活力均在90%以上(圖2),說明C3G、C3R對細胞存活率沒有顯著影響。

a-C3G;b-C3R

2.2 PC12細胞氧化損傷模型建立

用不同濃度的H2O2刺激PC12細胞12 h后,結果如圖3所示,細胞活力隨著H2O2濃度的升高呈現下降的趨勢,當濃度在100 μmol/L時細胞活力急劇下降,細胞存活數量較少,而在650 μmol/L的濃度時細胞存活率由99.99%降至45.53%(P<0.01),因此最終選擇實驗H2O2濃度為650 μmol/L。

圖3 不同濃度H2O2對細胞活力的影響

2.3 C3G、C3R對H2O2損傷PC12細胞活力的影響

細胞存活率能夠直接反映外界刺激對細胞的影響,而細胞內氧化應激水平的上升可以進一步誘導細胞凋亡。如圖4所示,與正常組相比,H2O2組細胞活力下降至50%～60%。與H2O2組相比,1～25 μmol/L的C3G、C3R處理后,細胞活力沒有明顯提高。而50、100 μmol/L C3G、C3R能夠顯著提高細胞活力。細胞活力是衡量細胞氧化損傷的標志之一,細胞活力升高,細胞氧化損傷程度降低,說明C3G、C3R對細胞具有一定的保護作用,能夠緩解PC12細胞的氧化損傷。

a-C3G;b-C3R

2.4 C3G、C3R對H2O2損傷的PC12細胞中ROS含量影響

ROS包括羥自由基、單線態氧和超氧陰離子等,在正常生理狀態下,ROS的產生和清除處于動態平衡過程,機體在受到外部刺激時,體內有大量ROS產生,對細胞膜等造成一定的損傷,進而加劇細胞凋亡。細胞孵育DCFH-DA探針后,利用共聚焦熒光顯微鏡進行拍照。結果如圖5所示,與正常組相比,H2O2損傷后綠色熒光強度顯著上升(P<0.01),表明細胞內的ROS的含量明顯增加,說明細胞氧化損傷模型進一步建立成功。50、100 μmol/L濃度的C3G、C3R能夠顯著降低細胞內ROS的產生(P<0.01),有利于維持細胞內部的穩態,保護細胞膜、蛋白質、核酸等免受氧化損傷從而減少細胞凋亡,因此C3G、C3R可能通過降低ROS含量來減輕細胞膜以及胞內物質的氧化損傷,進一步發揮抗氧化作用。

2.5 C3G、C3R對H2O2損傷PC12細胞MDA含量和抗氧化酶的影響

機體自身存在兩大抗氧化體系(酶抗氧化體系和非酶抗氧化體系)來共同抵御外界氧化應激,機體在受到強烈的氧化損傷時,抗氧化體系無法維持穩定,細胞膜上的不飽和脂肪酸發生過氧化,MDA不斷積累,MDA可以反映細胞受氧化損傷的程度;當機體受到外部刺激時,自身的酶抗氧化體系也會發生改變,機體自身的抗氧化酶如GSH、SOD、CAT等能夠直接反映機體抵抗氧化應激水平的程度。如圖6所示,與正常組相比,H2O2損傷后MDA的含量增加,神經細胞被損傷(P<0.01),經C3G、C3R處理后,低濃度的C3G、C3R能顯著降低MDA水平,且C3G、C3R濃度越大,效果越明顯(P<0.01)。此外與正常組相比,H2O2損傷組的SOD活性顯著下降(P<0.01),C3R在50 μmol/L及以上濃度時能夠提高SOD活性(P<0.05),且呈現劑量依賴性;H2O2損傷后GSH和CAT活性也呈現下降的趨勢(P<0.01),C3G、C3R濃度大于50 μmol/L時,GSH和CAT活性均有所升高(P<0.05)。結果表明H2O2破壞PC12細胞的氧化還原水平,降低細胞內抗氧化酶的活力,使得PC12細胞內氧化動態失衡并產生大量MDA,導致細胞發生不可逆的氧化損傷,以上結果可以進一步說明細胞氧化損傷模型構建成功。而經過C3G、C3R處理后,可以顯著提高胞內抗氧化酶的活性,降低胞內MDA水平,使PC12細胞很大程度上緩解H2O2所造成的氧化損傷,同時能提高機體對抗外部氧化應激的調控能力。該結果與C3G、C3R能夠抑制H2O2所引起的細胞存活力降低和ROS水平增加的結果一致。

a-CAT;b-GSH;c-MDA;d-SOD

2.6 C3G、C3R對H2O2損傷的PC12細胞中JNK,ERK1/2蛋白表達的影響

ERK、JNK是MAPK家族中的主要成員,ERK主要調節細胞的增殖與分化,在神經系統中還會對突觸與學習記憶的形成起到重要作用;JNK主要在細胞增殖,凋亡等過程中發揮重要作用。結果如圖7所示,H2O2刺激后PC12細胞中JNK和ERK1/2磷酸化的水平增加(P<0.01),經過化合物處理后發現50 μmol/L及其以上濃度的C3G、C3R能顯著抑制p-JNK/JNK和p-ERK1/2與ERK1/2比值的增加(P<0.01),且隨著C3G、C3R濃度的增加,抑制效果越顯著。JNK在調控神經細胞凋亡方面有著重要作用,JNK磷酸化水平的增加可以刺激下游凋亡蛋白的過量表達,從而加速細胞凋亡,結果說明C3G、C3R可能通過調控JNK的水平來減少細胞凋亡從而提高細胞抵抗氧化應激的能力。

a-JNK蛋白免疫印跡圖;b-ERK蛋白免疫印跡圖;c-JNK蛋白定量分析;d-ERK蛋白定量分析

2.7 C3G、C3R對H2O2損傷的PC12細胞中Nrf2/HO-1通路蛋白表達的影響

Nrf2/HO-1通路在AD等神經退行性疾病中發揮重要作用,其機制與減少神經元凋亡、降低炎性因子水平和減輕氧化應激損傷相關。Nrf2已經被證實可以調節細胞氧化還原穩態和細胞自我保護,這與神經退行性疾病密切相關,可作為重要靶點。在正常情況下,Nrf2水平在細胞核中較低,在氧化應激下,ROS可以增加細胞核中Nrf2水平,細胞質中Nrf2的減少可引起線粒體功能障礙,進一步導致細胞凋亡。實驗結果如圖8所示,PC12細胞H2O2刺激后,Nrf2和HO-1蛋白表達量顯著下降(P<0.01),其激活的抗氧化信號通路受阻,而C3G、C3R作用后明顯上調了Nrf2蛋白的表達,其下游蛋白HO-1的表達水平也隨之上升(P<0.05),且濃度越高恢復效果越好。Nrf2的激活可以促進下游抗氧化因子的表達,HO-1主要催化血紅素分解代謝成亞鐵、一氧化碳和膽綠素,是一種重要的抗氧化酶,其中膽綠素還具有ROS清除活性,可以抵御過氧化物和自由基。此外有研究發現Nrf2還可以激活機體內的抗氧化酶(CAT、SOD、GSH)來起到抵御氧化應激作用。綜上表明C3G、C3R可能通過激活Nrf2的表達從而增加HO-1蛋白的表達以及抗氧化酶的活性從而發揮抗氧化作用。

2.8 C3G、C3R對H2O2損傷的PC12細胞中Caspase-3及Bax表達的影響

NDD患者通常伴隨著大腦中神經元的喪失,特別是在海馬體中,很大一部分是由細胞凋亡引起的,而線粒體作為凋亡途徑中的關鍵途徑,上游連接凋亡蛋白的表達,下游執行死亡命令。大量研究表明H2O2可以產生過量的ROS進入線粒體,破壞線粒體電子傳遞系統,以激活“內源性凋亡”或線粒體凋亡途徑,從而導致更多的ROS產生,Caspase家族蛋白和Bax蛋白是細胞凋亡機制中必不可少的蛋白,活化后的Caspase-3蛋白可以直接反映細胞的凋亡水平,Bax是Caspase-3的上游蛋白,其過量表達可以激活Caspase-3的表達,最終誘導細胞凋亡。實驗結果如圖9所示,H2O2刺激后Cleaved-Caspase-3以及Bax的表達量均呈現上升的趨勢(P<0.01),細胞凋亡水平增加,能夠說明外源性的刺激導致細胞發生氧化損傷,從而加劇細胞凋亡,提示細胞模型建立成功,此外C3G、C3R處理以后能夠明顯抑制細胞凋亡蛋白的表達,且在較高濃度時呈現良好的抗凋亡效果(P<0.01),進一步說明C3G、C3R可通過協助細胞抵御氧化應激對線粒體的損傷,降低細胞氧化損傷和提高機體抗氧化應激的調控能力,最終達到緩解細胞凋亡的結果。

a-Caspase-3蛋白免疫印跡圖;b-Bax蛋白免疫印跡圖;c-Caspase-3蛋白定量分析;d-Bax蛋白定量分析圖

3 結論與討論

本研究主要以桑葚中2種主要的花色苷為研究對象,用H2O2誘導PC12細胞12 h構建神經細胞氧化損傷模型,分別從細胞活力、ROS含量、MDA的水平,抗氧化酶SOD、GSH和CAT的活性、抗氧化蛋白以及凋亡蛋白等方面來探討其保護作用機制。研究發現C3G、C3R處理后,能夠顯著增加氧化損傷的PC12細胞內抗氧化酶和Nrf2的抗氧化活性,抑制JNK的磷酸化以及有害物質MDA水平,降低Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量,有效預防和逆轉了細胞凋亡。此外C3G、C3R在結構性質上存在差異,一方面C3R所帶有的蕓香糖苷的—OH數目要多于C3G所帶有的葡萄糖苷,另一方面C3R所帶的蕓香糖苷屬于二糖,極性大于C3G帶有的葡萄糖苷,這都是C3R抗氧化效果優于C3R的重要因素。

綜上,C3G、C3R改善H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷,其保護作用可能是C3G、C3R通過調控Nrf2/JNK信號通路來減輕H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷和凋亡(圖10),但這種抗氧化保護作用的具體分子生物學機制及其在體內的抗氧化機制還有待進一步的深入研究,另外該結果還暗示著C3G、C3R可能是預防NDD的一個有前景的候選天然藥物。

圖10 C3G、C3R對PC12細胞保護作用信號通路圖