貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶對切達干酪成熟特性及生物活性的影響

劉同吉,王藝會,薛瑞,任青霞,楊貞耐

(北京工商大學,北京老年營養與健康教育部重點實驗室,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京,100048)

傳統上制作干酪所使用的凝乳酶主要從小?；蛐⊙虻确雌c動物的皺胃中提取。凝乳酶不僅能促使牛乳凝結,而且在干酪成熟中發揮重要作用[1]。隨著干酪消費的不斷增長,尋求不同來源凝乳酶滿足干酪產業的發展已成為我國乳制品行業發展的新挑戰[2]。通常大多數植物來源的凝乳酶被證明不適用于干酪的生產,這類凝乳酶因具有較強的蛋白水解能力而導致干酪產量下降,并在干酪成熟過程中產生苦味和質地缺陷[3];同時酶的生產可能受到植物栽培和氣候變化等因素的限制。微生物來源的凝乳酶具有來源廣泛、易于獲得、生產成本低等優點,這使得微生物凝乳酶成為最具潛力的凝乳酶制劑[4]。

不同微生物來源凝乳酶的蛋白水解特性差異較大,其在干酪成熟過程中對乳蛋白的水解程度不同,導致干酪的品質特性不同[5]。ZHAO等[6]研究發現,與利用商業凝乳酶制作的切達干酪相比,利用從傳統發酵米酒中分離出的微生物凝乳酶所制作的切達干酪水分含量更低,且在成熟60～90 d后干酪變得更柔軟,揮發性化合物濃度更高。利用解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶制備切達干酪和馬蘇里拉干酪,其在干酪成熟過程中的適度蛋白水解,使干酪保持質構和功能特性[7]。用芽孢桿菌spp.P45凝乳酶生產的藜麥粉奶油干酪,具有高保水性[8]。微生物凝乳酶的蛋白水解活性不僅影響干酪的理化特性,而且通過酶解乳蛋白釋放不同的生物活性肽[9]。MUSHTAQ等[10]研究發現使用細菌凝乳酶制作的干酪其抗氧化能力和金屬離子螯合能力顯著優于使用動物凝乳酶和植物凝乳酶制作的干酪,這與微生物凝乳酶水解蛋白釋放的活性肽有關。

本研究前期從中國傳統酒曲中篩選得到1株高產凝乳酶的細菌菌株,經鑒定命名為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)YH-1(CGMCC No.25636),該菌株產的凝乳酶的比酶活為5 762.724 SU/mg,經LC-MS/MS鑒定,確定該酶為一種金屬蛋白酶,該酶通過裂解κ-酪蛋白中Lys 21-Ile 22和Tyr 30-Val 31處的肽鍵導致牛乳凝固[11]。擬利用貝萊斯芽孢桿菌YH-1發酵制備的凝乳酶應用于切達干酪加工,研究干酪成熟過程中各項理化指標、游離氨基酸含量和揮發性風味物質等,以及干酪生物活性包括抗氧化活性、降血糖活性和金屬螯合能力的變化,目的在于進一步研究不同微生物來源凝乳酶應用于干酪加工的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛奶(脂肪3.2%,蛋白質3.06%,乳糖4.33%),北京三胖奶牛場;商品發酵劑(R-704)和凝乳酶(Stamix 1150),科漢森有限公司;氯化鈉和氯化鈣均為食品級。

1.2 貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶的制備

制備方法參考ZHAO等[12],略有修改。將貝萊斯芽孢桿菌YH-1在YPD培養基中30 ℃培養48 h,離心(10 000×g, 4 ℃, 30 min),收集上清液。在4 ℃條件下向粗酶液中緩慢加入(NH4)2SO4使其飽和度達到60%。在低溫條件下(4 ℃)靜置12 h后離心(10 000×g,30 min)取上清液,對上清液進行鹽析處理,收集沉淀后用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH=6.8)溶解,在4 ℃冰箱里透析48 h(透析袋8 000～14 000 Da),每8 h換一次水,冷凍干燥得到粗酶。將粗酶溶解于Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH=6.8)中,然后通過DEAE-FF陰離子交換柱純化凝乳酶,上樣量為5 mL,再用含NaCl的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫(0～1 mol/L),流速為3 mL/min,最后收集具有高蛋白酶活性的餾分,經脫鹽、超濾后制備純化凝乳酶。

1.3 儀器與設備

干酪加工實驗設備,自制;7090A-7000型氣相色譜-質譜聯用分析儀,美國Aglient公司;CR21GⅢ冷凍離心機,日本Hitachi公司;CT3型質構儀,美國Brookfield公司;Kjeltec8100型凱氏定氮儀,美國FOSS公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 切達干酪制作工藝

切達干酪制作參考WANG等[13]的方法,略有修改。利用同批次的生牛乳制作3組干酪,每組制作3個平行樣品。分別使用混合酶[YH-1凝乳酶30%(質量分數)和商品酶70%(質量分數),干酪B]和YH-1凝乳酶(干酪C)制作的切達干酪作為實驗組,以商品酶制作的干酪(干酪A)作為對照組。

工藝流程如下:

原料乳→巴氏殺菌(65 ℃,30 min)→32 ℃加入發酵劑(1.5%)→32 ℃發酵30 min→加入凝乳酶(10 000 SU/L)及CaCl2(0.005 g/100 mL)→32 ℃凝固45 min→切割,靜置5 min,39 ℃排乳清(pH=6.1～6.2)→保持凝塊溫度在36 ℃,至pH=5.2～5.3,15 min翻一次面→入模擠壓成型→鹽水(20% NaCl)浸泡20 min→擦干表面水分,壓模過夜→真空包裝→4 ℃成熟12周

1.4.2 切達干酪理化指標

干酪得率計算方法如公式(1)所示:

(1)

依據GB 5009.3—2016測定干酪水分含量;根據GB 5009.6—2016的方法測定干酪脂肪含量;根據AOAC 920.123 (2001) 凱氏定氮法測定干酪蛋白質含量;干酪鹽含量參照邱婷等[14]方法測定。pH值測定方法如下:將6 g樣品溶解在6 mL的溫水中(45 ℃),孵育30 min后離心(6 000×g,10 min),去除脂肪,取下層溶液進行測定。

1.4.3 切達干酪微生物指標測定

將5 g干酪溶解在45 mL的無菌水中,磁力攪拌1 h后用無菌生理鹽水梯度稀釋,稀釋后的樣品溶液涂布在M17固體培養基上,培養48 h后進行計數。

1.4.4 pH 4.6可溶性氮與12%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性氮含量的測定

根據GUO等[15]方法,稍微改動。將20 g干酪溶解在40 mL的無菌水中,調節溶液pH至4.6后進行孵育(40 ℃,1 h),離心(6 000×g,10 min)后取出下層溶液,定容至100 mL,取出10 mL放入凱氏定氮消化管中測定樣品的氮含量。

取上述pH 4.6可溶性氮溶液,加入10 mL的TCA(12%),混勻后室溫靜置1 h,離心(6 000×g,10 min)取10 mL溶液進行消化測定。

1.4.5 干酪質構的測定

用質構分析儀測定干酪樣品的質構參數。測試前將樣品在25 ℃下放置30 min。質地剖面分析(texture profile analysis,TPA)參數為:探頭型號TA3/100,下降速度5.0 mm/s,測試速度1.0 mm/s,形變百分量50%,觸發力0.2 N,間隔時間0 s。

1.4.6 干酪揮發性風味物質的測定

參照王亞東等[16]方法。用GC-MS法測定干酪風味。將5 g磨碎后的干酪加到30 mL萃取瓶中,在50 ℃的水浴鍋中平衡20 min,固相微萃取40 ℃吸附40 min后插入進樣口解析(250 ℃,10 min)。

1.4.7 干酪游離氨基酸含量的測定

依據ZHAO等[6]方法處理樣品:在樣品中加入800 μL乙腈水(體積分數為50%),振蕩后超聲30 min再靜置60 min,離心(12 000×g,10 min)取上清液過0.22 μmol/L濾膜后上機檢測和用50%乙腈水稀釋50倍上機檢測。

UPLC-Qtrap-MS方法:色譜柱 (BEH Amide Column, 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)柱溫40 ℃,流速0.25 mL/min;流動相:A-水(0.1%甲酸),B-乙腈(0.1%甲酸);運行12 min,進樣4 μL。

質譜條件:ESI離子源;氣簾氣35 arb;碰撞氣7 arb;離子噴霧電壓4 500 V;離子源溫度450 ℃;離子源氣體55 arb;離子源氣體55 arb。

1.4.8 干酪生物活性的測定

1.4.8.1 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參照AYYASH等[17]方法,制備不同成熟期干酪的多肽樣品(按上述1.4.4節方法得到的pH 4.6可溶性蛋白溶液,過0.22 μm濾膜)測試多肽樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.4.8.2 抗氧化活性的測定

分別對干酪不同成熟階段取樣制備的多肽樣品測定其DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除能力。

DPPH自由基清除率參考FAN等[18]方法。

采用ABTS測定試劑盒測定多肽樣品對ABTS陽離子自由基的清除能力,ABTS陽離子自由基吸光度測定波長為734 nm或405 nm。

1.4.8.3 金屬鐵離子螯合能力的測定

按MIAO等[19]方法將樣品溶解于pH 6.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液,取250 μL樣品,加入25 mmol/L的硫酸亞鐵溶液20 μL,37 ℃水浴30 min,取出后加入2.5 mmol/L 的菲啰嗪溶液15 μL 進行混合,10 000 r/min離心10 min,于562 nm處測定其吸光度。用無離子水作為空白對照。鐵離子的螯合能力計算如公式(2)所示:

(2)

式中:B0為對照組的吸光度(使用水代替樣品);B1為樣品的吸光度。

1.5 數據處理

每個干酪樣品至少3次平行實驗,結果用x±s表示,采用方差分析檢驗各樣本間的顯著性差異,P<0.05,差異顯著,采用Origin 2020作圖。

2 結果與分析

2.1 干酪的理化指標

由表1可知,干酪A和干酪B的得率、總蛋白含量以及氯化鈉含量之間沒有顯著差別(P>0.05),而干酪C的得率和脂肪含量略低于干酪A,蛋白質含量高于干酪A,這可能是由于YH-1凝乳酶水解蛋白質后,蛋白網絡被破壞,部分脂肪流失,干酪的得率也隨之下降[20]。

表1 切達干酪的得率及主要組成成分比較Table 1 Comparison of the yield and main components of Cheddar cheeses

2.2 切達干酪成熟過程中的pH、水分及微生物變化

如圖1-A可知,在成熟期間干酪整體的pH值呈下降趨勢,這可能是由于貯藏期內干酪中酪蛋白水解產生大量游離的氨基和羧基,導致質子釋放到周圍的介質中,使pH值降低。另外,成熟期間脂肪分解所產生的游離脂肪酸同樣會使干酪pH值降低[21]。干酪C的pH值始終低于干酪A和干酪B,可能是因為YH-1凝乳酶的蛋白水解作用可以增強干酪中乳酸菌的代謝活動,其產酸能力增加。如圖1-B可知,干酪C的水分含量在成熟期內顯著低于(P<0.05)干酪A和干酪B。在成熟前期,3組干酪的水分含量有上升的趨勢,且在第8周水分含量最高,可能是因為干酪中殘留的蛋白酶破壞了蛋白質的網狀結構,使干酪中的弱結合水轉變為游離水[22]。由于干酪C的pH較低且接近酪蛋白的等電點,這促進了干酪中蛋白質與蛋白質的相互作用,進一步使蛋白質基質的持水能力降低,從而導致奶酪的水分含量下降[23]。圖1-C結果表明,3組干酪的活菌數均呈先上升后下降的趨勢。前3周乳酸菌數量明顯增加,這可能是由于干酪中的乳酸菌在干酪成熟初期可以利用乳糖進行生長繁殖。在干酪成熟后期,B組的活菌數顯著高于(P<0.05)A組和C組,可能是因為混合凝乳酶的水解產物更有利于乳酸菌的生長。

A-pH值;B-水分含量;C-活菌數

2.3 pH 4.6可溶性氮及12%TCA可溶性氮的變化

干酪蛋白的初級水解可以用pH 4.6可溶性氮質量分數來表示,pH 4.6可溶性氮含量越高,表明實驗干酪的初級蛋白水解水平較高[24]。由圖2-A可知,在成熟期間,所有實驗組干酪的pH 4.6可溶性氮含量總體呈上升趨勢,在第8周時,干酪C的pH 4.6可溶性氮含量開始迅速增加,顯著高于(P<0.05)干酪A和干酪B。在第12周,干酪A、干酪B和干酪C的pH 4.6可溶性氮質量分數分別為24.8%、23.45%和25.9%。該結果表明YH-1凝乳酶對切達干酪乳蛋白的分解能力較強。12%TCA可溶性氮反映干酪蛋白的二次水解,可代表游離氨基酸和小分子肽(2～20個殘基)的含量[25]。另外,12%TCA可溶性氮的增加與凝乳酶水解蛋白能力有關,凝乳酶水解蛋白能力越高,干酪在成熟過程中會產生更多的12%TCA可溶性氮[26]。3組干酪的12%TCA可溶性氮在0～12周呈上升趨勢,干酪A由3.45%上升至7.15%,干酪B由3.4%上升至7.8%,干酪C由3.65%上升至7.2%,且在第12周B組干酪的12%TCA可溶性氮含量顯著高于(P<0.05)A組和C組。該結果表明混合凝乳酶對干酪的蛋白水解作用產生更多的游離氨基酸和小分子肽。

A-pH 4.6可溶性氮;B-12%TCA可溶性氮

2.4 切達干酪成熟過程中質構的變化

在成熟期間,干酪C的硬度、彈性、咀嚼性和膠著性總體上低于干酪A和干酪B,且在整個成熟期內干酪C的硬度都顯著高于(P<0.05)干酪A和干酪B,可能是因為干酪C脂肪和水分含量較低造成的(見表1)。LI等[27]研究發現低脂干酪的硬度、膠黏度和咀嚼性高于全脂干酪,因為脂肪可以作為一種柔軟的填充物鑲嵌入酪蛋白網絡中[28]。在成熟過程中,由于酪蛋白的不斷水解,3組干酪的硬度、咀嚼性和膠著性呈現下降趨勢(圖3)。由于干酪中蛋白酶的作用,干酪中總酪蛋白組分和酪蛋白單體組分(αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和αs2-酪蛋白)含量不斷下降,酪蛋白網絡結構坍塌,干酪的硬度、內聚性與彈性隨之降低。通過相關性分析發現隨著酪蛋白和大片段肽鍵的斷裂,蛋白質網絡結構逐漸減弱,質構特性也隨之改變,其質構特性與可溶性肽和完整酪蛋白隨時間的變化趨勢相似[29]。另外,實驗結果表明混合凝乳酶干酪的質構特性與商品凝乳酶干酪沒有顯著性差異(P>0.05)。

A-硬度;B-彈性;C-咀嚼性;D-膠著性

2.5 游離氨基酸含量的變化

在干酪成熟過程中,游離氨基酸含量與殘留凝乳酶的活性有關。殘留的凝乳酶會繼續水解干酪中的酪蛋白,產生小分子的肽,并進一步水解生成氨基酸。從表2可知,成熟12周干酪的游離氨基酸含量均高于新鮮干酪,說明干酪在成熟過程中蛋白質深度水解作用加強。3組干酪中,干酪B中的游離氨基酸含量相對較高,其次是干酪C,干酪A中的相對較少。在8種人體必需氨基酸中,干酪B的纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸的含量最多,干酪C的蘇氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和異亮氨酸含量最多;在一些非必需氨基酸中,干酪B的脯氨酸、酪氨酸和谷氨酸含量最多,干酪C的絲氨酸、丙氨酸和天門冬氨酸含量最多。實驗結果表明,用YH-1凝乳酶和混合凝乳酶制成的干酪,相比于對照組能產生更多的游離氨基酸。游離氨基酸對干酪的滋味和香味都有促進作用[30]。

表2 切達干酪成熟過程中游離氨基酸的變化 單位:ng/mgTable 2 Changes of free amino acids in Cheddar cheeses during ripening

2.6 切達干酪成熟前后的風味變化

對3組切達干酪不同成熟時期的揮發性風味物質進行了SPME-GC-MS分析。3組干酪共檢測出39種風味物質,其中11種醇類、6種酮類、12種酸類、4種酯類、其他類6種。隨著成熟期的延長,風味化合物種類無明顯差別,附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036210)顯示了3組干酪在1、4、8、12周時揮發性風味物質質量比的變化。

醇類化合物是組成干酪中風味物質的重要成員,主要通過氨基酸代謝、甲基酮還原、乳糖代謝和亞油酸、亞麻酸降解等生化反應生成[31]。其中乙醇是3組干酪醇類風味物質的主要成分,3組干酪在成熟期內的乙醇含量呈現略微減少的趨勢,可能是由于貯存期內干酪中發生醇解和酯化反應,降低了乙醇的含量[32]。RICHOUX等[33]研究發現,乙醇限制了瑞士奶酪中乙酯的合成,在干酪中添加400 μg/g的乙醇后,乙醇與奶酪中的酸類物質發生酯化反應,生成乙酯等風味物質,證明了乙醇在干酪中含量的降低有利于其風味物質的增加。

酮類化合物的感知閾值低,可賦予干酪水果香味、花香味和霉味,主要通過多不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解和微生物代謝產生[34]。3組干酪中均檢出3-羥基-2-丁酮、2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、2-十三酮和2,3-丁二酮。其中3-羥基-2-丁酮由檸檬酸代謝生成,賦予干酪奶油香味,在整個成熟期間的含量:B干酪>C干酪>A干酪;由干酪中乳酸菌代謝生成的2-壬酮賦予了干酪水果味;由亞油酸氧化后生成的2-壬酮使干酪具有奶油味和桃香味等[16]。

脂肪酸類化合物不僅是干酪中主要的風味物質,也是酯類、醛類和甲基酮類等其他風味物質的前體物質,因此對干酪的風味的形成有著重要的作用[31]。其中辛酸、己酸、乙酸和癸酸在3組干酪中含量較高,這些短鏈的脂肪酸類化合物閾值較低,在較高的濃度情況下會產生令人不悅的風味,如酸敗、哈喇等味道[35]。第4、8、12周,干酪B和C的乙酸、丁酸和辛酸的含量均高于干酪A,說明混合凝乳酶對于干酪酸類風味化合物的貢獻較大。

酯類化合物是奶酪中常見的揮發性化合物,賦予干酪令人愉快的水果味,其風味可以降低因游離脂肪酸含量較高而產生的腐臭氣味。酯類化合物可以通過不同的反應形成,包括酯化反應和酯交換[32]。成熟過程中,3組干酪酯類化合物檢出含量較低,其中干酪B和C中共檢出4種酯類,干酪A中檢測出3種酯類。干酪A在第0周時酯類物質含量較高,隨著成熟期的延長,干酪B和C的含量均高于干酪A。

2.7 干酪成熟過程中揮發性風味物質的聚類分析

對不同凝乳酶干酪不同成熟期揮發性風味物質的含量變化進行熱圖分析,如圖4所示。不同凝乳酶制作的干酪風味物質存在差異。第1周的干酪A未和其他組別的干酪歸為一類,說明成熟初期干酪A的風味物質與其他干酪差別較大。隨著成熟時間的延長,干酪A(成熟4、8和12周)與干酪B(成熟1周)可聚為一類;成熟1、4和8周的干酪C可聚為一類;干酪B(成熟4、8和12周)與干酪C(成熟12周)可聚為一類。結果表明,分別用YH-1凝乳酶與商業凝乳酶所制作的切達干酪在風味成分上存在差異,而用2種混合凝乳酶所制作的干酪B在不同成熟時期可以分別與干酪A與干酪C聚類,說明YH-1凝乳酶有著部分代替商業凝乳酶制作切達干酪的潛力。

圖4 切達干酪成熟過程中風味物質的熱圖分析

2.8 切達干酪成熟過程中生物活性的變化

3組干酪在成熟過程中生物活性的變化如圖5所示。對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用歸因于蛋白酶水解產生的生物活性肽,抑制α-葡萄糖苷酶被認為是通過減少碳水化合物水解來控制糖尿病的有效方法[36]。α-葡萄糖苷酶的抑制率(圖5-A)隨著成熟期的延長而逐漸升高,抑制率逐漸上升至60%以上,3組干酪的變化趨勢一致,無顯著性差別(P>0.05),由此說明YH-1凝乳酶不會影響干酪的降血糖活性。

圖5 切達干酪成熟過程中的生物活性變化

干酪B和C的DPPH自由基清除率(圖5-B)在第3周達到最大,分別為65.78%和62.12%,之后有所下降,干酪A在第四周達到最大,為56.86%,然后開始下降;3組干酪的ABTS陽離子自由基清除率(圖5-C)均處于上升趨勢,干酪C的ABTS陽離子自由基清除率在前8周顯著高于(P<0.05)A組,在第8周達到最大,為71.39%,A、B兩組在第12周達到最大,分別為65.36%和72.91%,說明干酪的成熟期以及不同的凝乳酶都會影響干酪的抗氧化活性,且YH-1凝乳酶組和混合凝乳酶組干酪的抗氧化活性優于商品酶組干酪。AYYASH等[17]研究了用牛奶和駱駝奶所制的干酪在成熟期間抗氧化活性的變化,發現在干酪在成熟第28天時,干酪的DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率顯著增加。趙笑等[7]研究發現對于DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率,細菌凝乳酶制作的干酪顯著優于對照組干酪,尤其是在干酪成熟的第4～8周,DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率最高分別為16.49%和78.38%。

干酪成熟過程中產生的多肽或氨基酸通過螯合作用,能夠提高鐵的生物利用率和吸收率[19]。如圖5-D所示,干酪A和B的鐵離子螯合能力均在第4周達到最大,分別為53.24%和56.11%,干酪C則在第12周達到最大,顯著高于(P<0.05)干酪A和干酪B,為60.06%。TIMON等[37]發現用微生物蛋白酶制作的干酪的抗氧化能力和金屬螯合能力顯著高于用動、植物蛋白酶制作的干酪,這與本實驗的結果相似。因此,用YH-1凝乳酶制作的切達干酪能有效地提高干酪的抗氧化能力和鐵離子螯合能力。

3 結論

本研究利用貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶及其部分代替商品凝乳酶制備切達干酪,比較了添加不同凝乳酶切達干酪的成熟特性及生物活性的差異。結果表明,與商品凝乳酶制備的干酪相比,利用YH-1凝乳酶制備的切達干酪具有更高的蛋白含量、更低的水分含量和pH值,干酪硬度增加。YH-1凝乳酶對切達干酪具有更強的蛋白水解作用,使干酪成熟過程中產生更多的游離氨基酸和揮發性風味物質,并且可以提高干酪抗氧化和螯合鐵離子的生物活性。此外,在成熟期內,混合凝乳酶干酪與商品凝乳酶干酪在理化和質構指標上相似,但前者游離氨基酸和揮發性風味物質以及生物活性更高。因此,為改善切達干酪的品質特性,同時提高干酪的揮發性風味物質含量和生物活性,可使用貝萊斯芽孢桿菌YH-1凝乳酶部分代替商品凝乳酶生產切達干酪。本研究為微生物凝乳酶在切達干酪中的應用提供了技術依據。