佛手多糖對1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞損傷的保護作用研究

陳進炫,龔舒,劉天開,龔記熠,乙引*,劉文華*

1(貴州師范大學 生命科學學院,貴州 貴陽,550025)

2(肇慶學院 生命科學學院,廣東 肇慶,526061)

佛手又名佛手柑、五指柑、福壽柑等,為蕓香科柑橘屬植物佛手的果實,具有藥食兩用價值,主要產于我國的廣東、廣西、四川、浙江、福建等地,其主要活性成分有多糖類、揮發油類、黃酮類、香豆素類等[1]。不同產地的佛手多糖在種類、單糖組成及結構等方面存在差異,這可能與土壤、氣候和栽培條件等因素有關[2]。研究顯示,川佛手多糖的單糖組分為鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,而金佛手和建佛手多糖的單糖組分均為甘露糖、葡萄糖和半乳糖[3]。廣佛手多糖由D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖組成[4]。佛手多糖具有免疫調節[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等生物活性。

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種中樞神經系統退行性疾病,主要以中腦黑質致密部多巴胺能神經元變性、死亡為病理特征。帕金森病的發病機制尚未完全明確[8],研究表明,氧化應激、線粒體功能障礙、細胞自噬等因素都參與了帕金森病的致病過程[9]。帕金森病多發于中老年群體,我國老齡化不斷加劇,預計到2030年,全國帕金森病人數高達500萬[10]。目前還沒有能完全根治帕金森病的藥物。研究表明,很多中藥活性成分對帕金森病有較好的預防治療效果,而且具有低毒、副作用小等優點。因此,對中藥活性成分預防和治療帕金森病的效果進行深入研究,具有重要的實際意義[11]。

表1 干酪成熟過程中風味物質的變化Table 1 Changes of flavor compounds during cheese ripening

目前,植物多糖對PD細胞模型和動物模型的保護作用已有不少報道[12-14],但未見有佛手多糖對PD細胞模型的保護作用方面的報道。因此,本實驗采用被廣泛使用的1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridine ion, MPP+)誘導人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞損傷為PD細胞模型,探究佛手多糖對神經細胞的保護作用及其機制,為緩解帕金森病的發生發展提供理論依據,同時也能更好地開發和利用佛手資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SH-SY5Y細胞株,武漢大學保藏中心;佛手,廣東省肇慶市德慶縣莫村鎮(2020年);無水乙醇,廣東廣試試劑科技有限公司;AB-8大孔樹脂,鄭州勤實科技有限公司;纖維素酶、果膠酶,上海源葉生物科技有限公司;木瓜蛋白酶、MPP+,上海麥克林生化科技股份有限公司;DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶,美國Gibco公司;磷酸鹽緩沖溶液(PBS),大連美侖生物技術有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),天津市富宇精細化工有限公司;噻唑藍(methye thiazdye telrazlium, MTT)、Hoechst33258染色液、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光液,上海碧云天生物科技有限公司;蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)抗體、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, p-Akt)抗體、磷酸化細胞外調節蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2, p-ERK1/2)抗體、細胞色素c(cytochrome c, Cyt-c)抗體、美國Cell Signaling Technology公司;β-肌動蛋白(β-actin)抗體,美國Santa Cruz Biotechnology公司;Goat anti-Rabbit IgG二抗,美國Merck Millipore公司;其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A鼓風干燥箱、HWS-12恒溫水浴鍋,上海一恒科學儀器有限公司;800A多功能粉碎機,永康市紅太陽機電有限公司;TDL-80-2C低速離心機,上海安亭科學儀器廠;SQP電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;RE-3000旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;Smart-Q30純水機,上海和泰儀器有限公司;ELx800酶標儀,美國Bio-Tek公司;FRESCO 21高速冷凍離心機、HEARACELL 150i CO2培養箱,美國Thermo Fisher公司;Eclipse Ts2 FL倒置熒光、Eclipse TS100F正置熒光顯微鏡,日本Nikon公司;ChemiDocXRS+化學發光成像分析系統,美國Bio-Rad公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的制備

稱取21 mg無水葡萄糖,定容于100 mL容量瓶,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mL于試管中,分別加入1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.5 mL純凈水,另一個試管加入2.0 mL去離子水作為空白組,各試管中加入6%(質量分數)苯酚1.0 mL,搖勻,加入5.0 mL硫酸,搖勻,靜置5 min,放入沸水浴加熱15 min,立即冷卻至室溫,490 nm測吸光度,繪制標準曲線。得葡萄糖標準曲線方程y=11.669x+0.014 9,其中R2=0.999 1。

1.3.2 佛手多糖的提取

參考章斌等[15]的方法,并稍加修改:佛手片烘干,粉碎,過100目篩,5倍95%(體積分數)乙醇浸泡過夜(脫脂),過濾,烘干,酶提取[酶用量1.5%(質量分數),料液比1∶30,提取溫度50 ℃,提取時間2 h],90 ℃滅酶10 min,抽濾濃縮,離心,取上清液,Sevage法除蛋白,活性炭去色素,80%乙醇沉淀,無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,烘干,去離子水重溶,離心,80%乙醇沉淀,無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,烘干,測定多糖得率。

1.3.3 佛手多糖的純化

本研究使用AB-8大孔樹脂對佛手粗多糖進行純化,參考楊波等[16]的方法,并稍作修改。以大孔吸附樹脂AB-8為填料,佛手粗多糖溶于去離子水,上樣濃度為6 mg/L,先用300 mL去離子水進行洗脫,再用300 mL 40%乙醇洗脫,流速為1 mL/min,洗脫液體積為600 mL,50 mL/管進行收集,苯酚-硫酸法進行檢測跟蹤,濃縮,醇沉,烘干備用。

1.3.4 佛手多糖純度測定

稱取20 mg佛手粗多糖置于100 mL容量瓶中,用去離子水定容至刻度線,取1 mL多糖溶液按照1.3.1節的方法測定吸光度,計算純度。

1.3.5 細胞培養與分組

將SH-SY5Y細胞接種于含10%(體積分數)血清的DMEM完全培養基中,在恒溫37 ℃、5%(體積分數)CO2的培養箱中培養。每天觀察細胞生長狀況,待細胞長到80%以上即可傳代,取對數生長期的細胞進行實驗。將細胞分為對照組、模型組(加入1 mmol/L MPP+)和佛手多糖組(20、40、60、80、100 mg/L),佛手多糖(溶于PBS)預處理6 h,然后加入1 mmol/L MPP+處理細胞48 h。

1.3.6 細胞存活率的檢測

以每孔細胞數1×104將細胞接種于96孔板中,每組5個重復,在恒溫37 ℃、5% CO2的培養箱培養24 h后,各組給予相應的藥物處理。加藥48 h后,每孔加20 μL MTT(5 mg/mL),在培養箱繼續孵育4 h,吸盡舊培養基,每孔加入DMSO 150 μL,放置37 ℃、200 r/min搖床下振蕩30 min,用酶標儀在490 nm處測定吸光度值(A值)。細胞存活率計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.7 Hoechst33258染色

將細胞接種于6孔板(接種前放入蓋玻片),每孔細胞數約3×105,在恒溫37 ℃、5% CO2的培養箱培養24 h后,佛手多糖組加入80 mg/L佛手多糖,對照組及模型組加入相同體積PBS,6 h后佛手多糖組和模型組加入1 mmol/L MPP+,對照組加入相同體積PBS。繼續培養48 h后,每孔加入Hoechst33258染色液5 μL,放入培養箱孵育20 min,用PBS洗滌2次,取出蓋玻片,置于載玻片中,在熒光顯微鏡下隨機選取視野拍照。

1.3.8 細胞ROS水平的檢測

按1.3.7節分組處理細胞,培養48 h后,吸去細胞培養基,每孔加入10 μmol/L DCFH-DA 熒光染色液1 mL,放入培養箱中孵育20 min,用DMEM完全培養基清洗細胞3次,最后加入1 mL DMEM完全培養基,在熒光顯微鏡下隨機選取視野拍照,隨后使用Image J軟件計算熒光強度。

1.3.9 線粒體膜電位的檢測

按1.3.7節項分組處理細胞,48 h后,吸去培養基,用1 mL PBS洗滌1次,各組分別加入1 mL完全培養基,避光條件下,加入1 mL的JC-1染色工作液,搖勻,放入培養箱繼續培養20 min。孵育結束后,吸走培養基,用提前預冷的1× JC-1染色緩沖液,洗滌2次,最后加入1.5 mL基本培養基,置于倒置熒光顯微鏡,隨機選取視野拍照,并使用Image J軟件測定各組細胞的紅綠熒光強度。

1.3.10 Western blot檢測p-Akt、Akt、p-ERK和Cyt-c蛋白表達水平

將細胞接種于6 cm培養皿,每皿細胞數約1×106,按1.3.7節分組處理細胞,培養24 h后,吸去細胞培養液,PBS清洗1次,每皿加入細胞裂解液300 μL,放于冰上,置于4 ℃搖床振蕩30 min,將細胞轉移至EP管,13 000 r/min離心10 min后,吸取上清液。取少量上清液,用BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白含量。余下樣品加適量5×loading buffer,沸水浴5 min,冷卻后,將蛋白樣品加入泳道,進行電泳,先恒壓80 V電泳 1 h,再恒壓100 V電泳至底部,隨后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜(250 mA,100 min)。轉膜完成后將膜置于5%奶粉或1×Tris緩沖鹽吐溫混合液(tris buffered saline tween,TBST)中封閉1 h,加一抗(p-Akt,Akt,p-ERK1/2,Cyt-c,β-actin,體積比1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜3次,每次10 min,然后加二抗(1∶3 000)孵育1 h,1×TBST洗膜3次后加ECL發光液顯影,于化學發光成像系統成像及分析,使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 佛手多糖的提取、純化

通過復合酶提法對佛手粗多糖進行提取,由苯酚-硫酸法測定得佛手粗多糖得率為(4.86±0.50)%,純度為(44.46±4.64)%。與王琴等[17]的文獻相比,多糖得率提高了1.68%,但純度降低了21.4%,這可能是蛋白質等雜質去除不夠干凈[17]。經過AB-8大孔吸附樹脂對佛手粗多糖的純化,佛手多糖純度達到(60.81±1.41)%,純度提高了16.35%。

2.2 佛手多糖對MPP+損傷的細胞存活率的影響

如圖1所示,SH-SY5Y細胞經MPP+作用后,細胞存活率明顯下降(P<0.01)。經佛手多糖預處理后,細胞的存活率顯著上升(P<0.01),在20～100 mg/L濃度內呈先上升后下降的趨勢,佛手多糖組細胞存活率均高于模型組(50.58%),最高達62.24%。故選擇80 mg/L的佛手多糖濃度進行后續實驗。

圖1 佛手多糖對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的 保護作用

2.3 佛手多糖對MPP+誘導的細胞形態的影響

通過Hoechst33258染色后可見(圖2),對照組細胞呈現出均勻的低強度熒光,模型組中部分細胞呈現出高強度的顆粒狀藍色熒光,出現細胞破碎、細胞核皺縮等細胞凋亡現象,佛手多糖組細胞的形態和對照組接近,熒光強度較模型組的低。

a-對照組;b-模型組;c-佛手多糖組(80 mg/L)

2.4 佛手多糖對MPP+誘導的細胞活性氧水平的影響

如圖3所示,與對照組比較,MPP+組細胞內二氯熒光素信號顯著增強,綠色熒光強度大,表明細胞內活性氧水平顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,佛手多糖組的熒光強度明顯降低,細胞內活性氧水平顯著減少(P<0.01)。以上結果表明,佛手多糖能夠抑制MPP+所導致的SH-SY5Y細胞活性氧水平增加。

圖3 佛手多糖對MPP+誘導SH-SY5Y細胞ROS水平的影響 (熒光顯微鏡,

2.5 佛手多糖對MPP+誘導的細胞線粒體膜電位的影響

如圖4所示,對照組中的紅綠熒光比值為4.44,與對照組相比,模型組中紅綠熒光比值降低至0.72(P<0.01),而佛手多糖組的紅綠熒光比值顯著高于模型組,佛手多糖組為1.98(P<0.05),以上結果表明,佛手多糖能抑制MPP+導致的膜電位下降,從而減少線粒體損傷。

2.6 佛手多糖對p-Akt、p-ERK和Cyt-c表達水平的影響

如圖5所示,與對照組比較,模型組p-ERK1/2和p-Akt的表達水平均極顯著減少(P<0.01),Cyt-c蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。佛手多糖能顯著抑制MPP+引起p-ERK1/2和p-Akt的下降以及Cyt-c水平的增加。

a-蛋白免疫印跡中的蛋白表達水平(A-對照組;B-模型組;C-佛手多糖組(80 mg/L));b-p-Akt/Akt;c-p-ERK1/2/β-actin;d-Cyt-c/β-actin

2.7 作用機制

佛手多糖細胞保護作用機制如圖6所示。

3 結果與討論

MPP+是一種神經毒素,是PD模型常用的誘導劑,可經多巴胺轉運體轉運到多巴胺能神經元后,在線粒體中積累并產生大量ROS[18],隨后誘導Cyt-c從線粒體釋放到細胞質中,從而觸發Caspase級聯反應和細胞凋亡[19]。本研究結果顯示,MPP+使得細胞內ROS增加,Cyt-c從線粒體釋放到細胞質,經過佛手多糖處理后,細胞內ROS減少,Cyt-c釋放減少,說明佛手多糖可通過調節線粒體中ROS的產生和Cyt-c的釋放來抑制MPP+誘導的細胞凋亡。

ERK1/2是指細胞外調節蛋白激酶,是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員之一,參與細胞生長發育,細胞形態維持,細胞死亡等生理過程。ROS能激活ERK信號通路,可進一步激活蛋白激酶、轉錄因子等多種下游效應因子,調控基因表達,共同作用于神經系統,反過來對細胞起到保護作用[20-21]。ERK信號通路可通過三級酶促級聯反應激活,促使ERK轉變成p-ERK,從而發揮神經保護作用[22]。用1 mmol/L MPP+處理SH-SY5Y細胞,24 h/48 h后,細胞內p-ERK1/2表達水平均明顯下降[23-24]。本實驗得到相似的結果,經1 mmol/LMPP+作用后,細胞內p-ERK1/2水平明顯下降,而經佛手多糖處理后,p-ERK1/2的下降得到抑制,提示佛手多糖可能通過激活ERK信號通路,進而抑制細胞凋亡。

研究表明,Akt參與神經細胞存活、凋亡、自噬以及細胞增殖等過程[25]。另外的研究還表明,PI3K/Akt通路是細胞抗凋亡信號轉導機制的重要途徑,能夠避免細胞受多種凋亡信號刺激[26]。當PI3K被激活后,能夠催化PIP2轉化為PIP3,促進Akt發生磷酸化,磷酸化的Akt可以抑制多種凋亡蛋白的表達,進而發揮抗凋亡作用[27]。CAO等[23]研究顯示,MPP+能夠抑制Akt信號通路,使SH-SY5Y細胞中的p-Akt表達降低從而使細胞凋亡。李鵬等[13]研究發現,枸杞多糖能通過激活PI3K/Akt通路,抑制MPP+誘導的帕金森病模型細胞凋亡。本實驗結果顯示,MPP+處理SH-SY5Y細胞后,p-Akt表達水平顯著下降,經佛手多糖處理后,能夠顯著抑制p-Akt的下降,提示佛手多糖可能通過激活Akt信號通路,進而抑制細胞凋亡。

綜上所述,佛手多糖對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用,其機制可能是通過調節線粒體ROS的產生和Cyt-c的釋放,進而維持線粒體穩態,激活Akt信號通路和ERK信號通路,抑制細胞的凋亡,從而起到保護作用。本研究有助于闡明佛手多糖對細胞損傷的保護作用機制,為緩解帕金森病的發生發展提供理論依據。