原料乳和牧場環境中嗜冷菌多樣性及蛋白酶水解特性研究

胡少震,代良超,張書文,呂加平,李蓮瑞,逄曉陽*

1(塔里木大學 生命科學與技術學院 動物科學與技術學院,新疆 阿拉爾,843300)

2(中國農業科學院農產品加工研究所,北京,100193)

3(沈陽農業大學 食品學院,遼寧 沈陽,110866)

隨著冷鏈技術在原料乳運輸中的廣泛應用,嗜熱菌和嗜溫菌生長受到抑制,而嗜冷菌在冷藏過程中繼續生長,逐漸成為優勢菌[1]。常見的嗜冷菌包括假單胞菌屬,不動桿菌屬(Acinetobacter),腸桿菌屬(Enterobacter),芽孢桿菌屬(Bacillus),沙雷氏菌屬(Serratia),黃桿菌屬(Chryseobacterium)等[2-3]。這些菌株在生長對數期會分泌耐熱酶,該酶具有較強的熱穩定性,即使經過主流加熱工藝135 ℃處理,仍有20%～40%的殘留[4]。其中,殘留的耐熱蛋白酶緩慢作用于乳蛋白,使UHT乳在貨架期內出現蛋白水解、風味劣化等質量問題[5],給消費者健康和企業聲譽造成不良影響。

高溫處理可以殺死原料乳中的微生物從而保證乳產品的安全性,但原料乳中原始微生物種類和數量對UHT乳的質量有很大的影響[6]。假單胞菌是主要產蛋白酶嗜冷菌,在生長對數期分泌由aprX基因編碼的金屬蛋白酶,該酶在不同假單胞菌株中表達量也不同,即使同一屬菌株由于分離源不同也有明顯的差異性[7]。因此,明確不同牧場嗜冷菌污染分布及假單胞菌蛋白酶活力,對于提高UHT乳的質量,延長貨架期,具有重要的指導意義。

然而,中國地區原料乳及牧場環境中嗜冷菌的多樣性和蛋白水解活性的分析尚未得到廣泛的研究。本研究的目的是調查嗜冷菌在中國不同地區分布情況,分析嗜冷菌產蛋白酶性能以及蛋白酶與是否攜帶aprX基因的相關性。這是一次大范圍對中國地區原料乳及牧場環境中嗜冷菌多樣性及蛋白水解活性進行研究。研究結果對中國地區牧場嗜冷菌污染防控及其耐熱酶在產品中的殘留抑制提供了參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

營養肉湯培養基、MPC瓊脂培養基、蛋白胨鹽溶液,北京奧博星生物技術有限責任公司;TAE(50×)緩沖液,北京酷來搏科技有限公司;蛋白酶K,美國默克公司;瓊脂糖,北京廣達恒益科技有限公司;GeneGreenI核酸染料、細菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;Trans2K?Plus Ⅱ DNA Marker,北京全式金生物技術股份有限公司;TaqPCR MasterMix,北京金百特生物技術有限公司;偶氮酪蛋白(azocasein),美國Sigma公司;所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

全波長酶標儀,瑞士Tecan公司;臺式高速離心機,美國Sigma公司;恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;微型旋渦振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;pH計,法國梅特勒公司;核酸電泳儀,北京市六一儀器廠;凝膠成像儀,上海勤翔公司;PCR儀 ThermoFisher公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋,UHT殺菌機,上海申安醫療器械廠;無菌試驗臺,哈爾濱市東聯電子技術有限公司;水浴鍋,寧波新芝科技有限公司;UHT殺菌機,北京西奧德數控設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集

從中國寧夏回族自治區、黑龍江省、河北省、廣東省某規?；翀?分別在夏季(2022年6月)、冬季(2021年12月)采集原料乳和環境樣品8次。將50 mL離心管、采樣袋于121 ℃滅菌20 min,TMR飼料、牛舍墊土、青儲飼料各取500 g于無菌采樣袋,前三把奶、正常乳、運奶車奶樣、冷藏罐奶樣在擠出30 min之內取50 mL至無菌離心管中,飲用水取50 mL至無菌離心管中,采集后在48 h內冷鏈運輸到實驗室進行嗜冷菌的分離。

1.3.2 樣本處理

在超凈臺中將采集的樣品用無菌蛋白胨鹽溶液按10倍梯度連續稀釋5次,不同濃度的樣品分別均勻涂布在MPC瓊脂培養基上,將培養皿倒置在6.5 ℃恒溫培養箱中培養7～10 d[8]。

1.3.3 嗜冷菌的分離純化

選取嗜冷菌生長比較均勻的平板,將大小形態相異的單個菌落用無菌接種針挑入營養肉湯液體培養基。分離的嗜冷菌于28 ℃恒溫培養箱培養24 h,連續傳代2次,將生長至對數期的嗜冷菌用25%(體積分數)的甘油保存在-80 ℃冰箱,用于嗜冷菌的鑒定和酶活力研究。

1.3.4 嗜冷菌的鑒定

所有細菌在28 ℃下,于營養肉湯培養基中培養24 h。根據細菌基因組DNA試劑盒說明書提取DNA,采用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′),在反應體系(DNA模板1 μL;引物27F、1492R各1 μL;2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL;dd H2O 9.5 μL),在95 ℃ 5 min預變性,35 Cycles(95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s)進行變性、退火、延伸,72 ℃ 10 min進行再延伸,完成細菌的16S rRNA基因序列擴增[9]。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后,將有擴增條帶的進行PCR產物的純化,擴增產物送六合華大基因科技有限公司(北京,中國)完成測序分析。測序結果在MEGA軟件完成拼接,完整的堿基序列提交在National Center for Biotechnology (NCBI)數據庫進行序列BLAST比對,確定菌株的種名[10]。菌株的中文名稱來源中國典型培養物保藏中心(http://cctcc.whu.edu.cn/portal/dictionary/index)。

1.3.5 假單胞菌蛋白酶活力及熱穩定性評價

將1.3.3節中-80 ℃保存的假單胞菌接種到營養肉湯培養基中,28 ℃培養24 h進行活化。采用脫脂奶瓊脂平板法,將活化后的菌株進行蛋白酶可視化定性檢測[11],具體步驟如下:

(1)脫脂乳平板的配制:脫脂奶粉和瓊脂粉分別按照100 g/L,15 g/L用去離子水定容,115 ℃滅菌10 min,倒平板備用。

(2)菌液的接種:將平板用無菌打孔器打孔,吸取200 μL菌液于孔中,將平板正置于28 ℃培養箱中24 h,觀察是否有透明水解圈。

將有水解圈的假單胞菌采用偶酪蛋白法進行蛋白酶定量檢測[12],具體步驟如下:

(1)取1 mL菌液樣品、1 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)、2 mL底物于10 mL離心管中充分混勻,置于37 ℃恒溫培養箱下孵育2 h(空白對照:將樣液替換為磷酸鹽緩沖液pH=7.4)。

(2)孵育結束后加入4 mL的三氯乙酸(5%)溶液終止反應,室溫下放置30 min。

(3)將終止反應液于10 000 r/min,4 ℃條件下離心5 min。

(4)取200 uL上清液于96孔板中,于345 nm處測定吸光度。若離心后上清液中具有懸浮物,可用0.22 um的水系膜進行過濾。

(5)酶活力計算如公式(1)所示:

酶活力/U=(OD1-OD2)×100

(1)

式中:OD1為樣品在345 nm處吸光度,OD2為空白對照在345 nm處吸光度,其中一個酶活力單位(U)以345 nm下,每2 h增加0.01個吸光度值定義。

參照國內UHT乳主流工藝(135 ℃,5 s),計算在該處理條件下假單胞菌蛋白酶殘留率,其中殘留率計算如公式(2)所示:

(2)

1.3.6 假單胞菌株aprX基因檢測

采用引物aprX-F(5′-AAATCGATAGCTTCAGCCAT-3′)和aprX-R(5′-TTGAGGTTGATCTTCTGGTT-3′)對1.3.4節中保存的假單胞菌基因組進行aprX序列的擴增,PCR體系和循環參數參考1.3.4節,擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證是否攜帶耐熱酶基因[13]。

1.3.7 生物信息學分析

采用Excel對文中所需的表格進行制作。使用MEGA軟件對16S序列和aprX基因序列進行多序列比較[14]。把兩端有差異性序列去除統一化,采用NJ法基于核酸序列進行進化樹的繪制,最后將制作的進化樹提交至iTOL v6(https://itol.embl.de/)在線軟件進行物種標簽及物種豐富度的修飾。文中的雷達圖使用基因云在線軟件(https://www.genescloud.cn/login)進行繪制和修飾[15]。

2 結果與分析

2.1 嗜冷菌的分離鑒定

從中國地區共分離到329株嗜冷菌,經16S rRNA鑒定分為21個屬,76個種。其中分離菌株主要包括假單胞菌、嗜冷桿菌(Psychrobacter)、不動桿菌、沙雷氏菌、谷氨酸桿菌(Glutamicibacter)、微小桿菌、金黃桿菌、芽孢桿菌、拉恩氏菌(Rahnella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、哺乳動物球菌(Mammaliicoccus)等菌屬(圖1)。其中假單胞菌189株占比57.45%,P.azotoformans占假單胞菌總數的26.46%,P.lactis占假單胞菌總數的13.76%, 此外還包括P.paralactis、P.gessardii、P.weihenstephanensis、P.fragi、P.fluorescens、P.marginalis、P.fildesensis等33種假單胞菌(圖2)。

圖1 嗜冷菌所占比例

圖2 基于16S rRNA假單胞菌的進化樹

2.2 嗜冷菌的污染分布

采用雷達圖顯示嗜冷菌的污染分布,結果如圖3所示。從季節上看,4個牧場夏季嗜冷菌豐富度是高于冬季的,可能原因是大部分嗜冷菌的最適生長溫度在30 ℃左右,夏季更適合嗜冷菌的生長,導致嗜冷菌的豐富度更高。在嗜冷菌分布上,假單胞菌和不動桿菌分布最廣,存在不同牧場的前三把奶、墊土、運奶車、冷藏罐、TMR飼料等各個環節中。前三把奶和墊土嗜冷菌種類最豐富,而青儲和飲用水幾乎不含有嗜冷菌。其次嗜冷菌種類在夏季和冬季有所差異,金黃桿菌屬、索絲菌屬(Brochothrix)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、萊略特氏菌屬(Lelliottia)、拉恩氏菌屬(Rahnella)只在冬季牧場分離到,而微小桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、節桿菌屬(Arthrobacter)、馬賽菌屬(Massilia)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)、泛菌屬(Pantoea)、葡萄球菌屬、哺乳動物球菌屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)和沙雷氏菌屬更傾向于夏季。

圖3 嗜冷菌在不同環節的分布

2.3 假單胞菌的蛋白酶活力及耐熱性

在28 ℃下,經過脫脂乳平板初步篩選有61.38%的假單胞菌水解脫脂乳平板。在假單胞菌中,分離到的14株的P.gessardii,3株P.fluorescens,3株P.poae,1株P.extremorientalis,1株P.congelans,1株P.coleopterorum,1株P.chloritidismutans,1株P.cedrina在28 ℃下都表現出蛋白水解活性;P.lactis產蛋白酶比例為88.46%,P.paralactis產蛋白酶比例為84.21%,P.azotoformans產蛋白酶比例為84%,P.lurida產蛋白酶比例為66.67%,P.marginalis、P.reinekei和P.endophytica產蛋白酶比例為50%,P.fragi產蛋白酶比例為9.09%;而P.weihenstephanensis、P.fidesensis、P.peli、P.reidholzensis、P.versuta等15種假單胞菌在28 ℃下未產生脫脂乳水解圈(圖4)。

圖4 假單胞菌株產蛋白酶比例

從假單胞菌的蛋白酶水解度來看,63.79%的假單胞菌蛋白酶活力集中在0～10 U/mL,23.28%蛋白酶活力為10～20 U/mL,9.48%蛋白酶活力為20～30 U/mL,3.45%蛋白酶活力超過30 U/mL。假單胞菌分泌的蛋白酶經135 ℃處理5 s后,63.79%的菌株蛋白酶殘留率為20%～60%,21.55%的菌株蛋白酶殘留率高于60%,有5株P.azotoformans和4株P.gessardii蛋白酶殘留率超過80%。此外假單胞的蛋白酶活力和酶殘留率分布較分散,即使同一種假單胞菌在蛋白酶活力和酶殘留率有較大的差別,對不同來源的嗜冷菌的蛋白酶水解度的研究對牧場管理具有非常重要的意義(圖5)。

圖5 假單胞菌蛋白酶活力及酶殘留率

2.4 假單胞菌的aprX基因位點檢測結果

此外還對116株產蛋白酶菌株進行aprX基因的檢測,發現107株蛋白酶擴增出約800 bp左右條帶,說明該基因位點的存在與菌株是否產蛋白酶有較高(92.24%)的相關性。因此,可通過aprX基因位點對產蛋白酶嗜冷菌進行靶向檢測,該基因位點是檢測假單胞菌最合適的基因序列。

3 討論

傳統的微生物培養比其他研究方法具有諸多優勢,是深入探索原料乳微生物資源不可缺少的技術手段,獲得純化的菌株是研究微生物的生長特性、產酶特性的基礎。本研究通過傳統培養方法,明確中國地區嗜冷菌的分布狀況,分析假單胞菌的蛋白水解活性與aprX基因存在的相關性。

通過傳統純培養方法分離出329株嗜冷菌,通過16Sr RNA測序結果,分為21屬76種,表明中國原料乳含有復雜的嗜冷細菌群落。在嗜冷菌屬水平上,主要包括假單胞菌屬、不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬、沙雷氏菌屬等。其中假單胞菌屬占比為57.45%,主要包括P.azotoformans、P.lactis、P.paralactis、P.gessardii等33種假單胞菌。先前的一項研究發現,假單胞菌是原料乳中最常見的屬(74.79%),主要包括25個種,其中最常見的是P.fragi(10.92%),P.lundensis(6.72%)和P.fluorescens(4.48%)[22],該研究結果由于分離源及分離時間不同在菌群豐度上與本研究存在微小的差異性。

從嗜冷菌在各個環節的污染分布來看,前三把奶和牛舍墊土的嗜冷菌種類最多,幾乎可以分離到常規乳中所有種類的嗜冷菌,但青儲飼料和飲用水幾乎不含有嗜冷菌。在之前的研究中,也提出了原料乳在擠出時是無菌的,但原料乳會受到牛舍墊土、榨乳罩杯、頭三把乳和貯罐的污染,與本研究是一致的[23-25]。此外發現假單胞菌屬和不動桿菌屬的分布最廣,幾乎存在所有環節,是原料乳中的最大污染菌株,對該菌株的控制可以很大程度上減少嗜冷菌的對乳制品的破壞。

耐熱蛋白酶的存在是導致UHT乳變質的關鍵因素之一,本研究評價了假單胞菌的水解蛋白能力,并分析了蛋白酶活力與aprX基因存在的相關性。結果顯示,在28 ℃下,61.38%的假單胞菌株都具有水解脫脂乳平板的能力。有研究表明,25 ℃時, 60%的假單胞菌株表現出水解乳瓊脂平板,在7 ℃時為30%,在2 ℃時仍有10%水解乳瓊脂平板[12],與本研究結果一致。在先前的相關研究中,分析了嗜冷菌中的酪蛋白酶譜,發現不同菌株中含有不同結構類型的蛋白酶(45～130 kDa),蛋白酶結構的多樣性可能是菌株蛋白酶活力不同的原因[26]。此外有研究表明菌株產生分子質量為45～48 kDa的蛋白酶是最常見的耐熱酶,文獻中通常稱為AprX,是由aprX基因所編碼和表達[27-29]。因此本課題組對分離菌株的aprX基因進行了分析,發現產蛋白酶的嗜冷菌中有92.24%都攜帶aprX基因,aprX基因的存在與蛋白酶有較大的相關性在先前的研究中也被證實[13,30]。但是本研究中有部分菌株雖然攜帶aprX基因,但是并未水解乳瓊脂板,可能是在28 ℃下,該基因未被表達,也有部分未檢測到aprX基因的菌株,卻有水解乳瓊脂板的能力,可能是由于產生其他分子質量的蛋白酶,而不能產生分子質量為45～48 kDa的蛋白酶(AprX)。

國內外許多研究者對來自不同國家的原料乳樣品中嗜冷菌的多樣性和蛋白水解活性進行研究(表1)[16-21]。

表1 來自不同國家的原料乳樣品中嗜冷菌多樣性和蛋白水解活性Table 1 Psychrophilic diversity and protein hydrolysis activity in raw milk samples from different countries

在本研究中,假單胞菌做為嗜冷菌中的優勢菌,占總分離菌株的57.45%,幾乎存在牧場環境中所有環節,有61.38%的菌株具有蛋白水解活性。此外不同嗜冷菌,即使是同一種菌株,由于分離源不同產蛋白酶能力存在較大差異。AprX作為嗜冷菌主要蛋白酶,它與aprX基因有較強的相關性,產蛋白酶的嗜冷菌中有92.24%都攜帶該基因。因此,應針對不同牧場采取不同的嗜冷菌防控措施,并且可通過aprX基因作為目標靶點對產耐熱蛋白酶菌株進行研究。