不同有機酸聯用對大腸桿菌的抑制作用

計晴陽,王文瓊,錢易,嚴浩東,瞿恒賢,顧瑞霞

(江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室(揚州大學),江蘇 揚州,225127)

有機酸是存在于各種食品中的天然化合物,可以用于防止食品變質以及延長食品的保質期,常作為食品添加劑和防腐劑使用[1]。有機酸具有廣譜抑菌活性并且通常被認為是安全的化合物(generally recognized as safe,GRAS),除具有抑菌作用外,對產品的感官特性影響較小、成本低且易于使用,在食品工業中得到了廣泛的應用[2]。如作為肉類的防腐劑[3]和清洗劑[4]、用于新鮮水果和蔬菜的消毒清洗[5]、擠奶工具或刀具的衛生清潔[6]等。常用的有機酸包括乳酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸和丁酸等,前4種已被證明可以用于抑制新鮮農產品上包括大腸桿菌在內的食源性致病菌的生長[7-9],丁酸可用于消除家禽表面的沙門氏菌[10]以及減少仔豬腸道大腸桿菌的豐度[11]。單一有機酸在使用時需要達到一定的濃度,通常會導致成本提高、影響產品風味以及造成營養成分的損失。一些研究嘗試聯合有機酸應用于肉類和新鮮蔬菜的清洗消毒[12-13],能夠取得較為有效的抑菌作用。

目前有關有機酸協同抑菌作用的理論研究較少,因此,本文通過測定5種有機酸(乙酸、乳酸、丁酸、檸檬酸、蘋果酸)對大腸桿菌ATCC25922的最小抑菌濃度、半數有效抑菌濃度和有機酸組合(乙酸+乳酸、乙酸+乳酸+丁酸、乙酸+乳酸+檸檬酸、乙酸+乳酸+蘋果酸)的聯合抑菌指數,探究不同有機酸的聯合抑菌效果。并研究有機酸及其組合對大腸桿菌細胞膜電位和微觀形態的影響,初步探索有機酸及其組合的抑菌機理。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)由揚州大學乳品生物技術與安全控制重點實驗室(中國揚州)保藏。使用前將大腸桿菌培養物與70%(體積分數)甘油溶液以1∶1的比例保存在-40 ℃冰箱。大腸桿菌培養在LB(luria-bertani)肉湯中。

乙酸、乳酸、丁酸、檸檬酸、蘋果酸為分析純,麥克林生化科技有限公司;羅丹明123染料,源葉生物有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1501酶標儀,美國Thermo Scientific公司;RF-5301PC熒光分光光度計,日本島津公司;S-4800Ⅱ場發射掃描電鏡,日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 有機酸最小抑菌濃度和半數有效抑菌濃度測定

最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)的測定參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南中描述的微量稀釋法。

有機酸標準溶液的配制:有機酸使用生理鹽水配制成100 mg/mL的標準溶液,利用過濾除菌法對供試樣品進行除菌,防止后期雜菌的污染。

細菌懸液配制:大腸桿菌第一代培養12 h,離心去上清液(4 500 r/min,5 min),加入生理鹽水調整OD600至0.35后,LB肉湯稀釋100倍。

MIC測定:取無菌96孔聚苯乙烯微孔板,在生物安全柜中用微量移液槍在第1孔中加入經LB肉湯稀釋后質量濃度為10 240 μg/mL的有機酸溶液200 μL,第2孔～第8孔中加入100 μL LB肉湯,使用移液槍依次進行二倍稀釋,最后一孔棄去100 μL液體,每孔再加入細菌懸液100 μL。第1孔～第8孔有機酸質量濃度分別為5 120、2 560、1 280、640、320、160、80、40 μg/mL。每種有機酸至少設置3個平行,空白對照為等量的生理鹽水。加液完成后加蓋上板,輕微振蕩混勻,37 ℃培養24 h。培養完成后使用酶標儀測定OD600值,OD600值和空白對照無顯著差異的最小有機酸濃度為該有機酸的MIC。

半數有效抑菌濃度(median effective concentration,EC50)計算:通過非線性擬合曲線計算得到抑菌率為50%時的有機酸濃度,即為EC50,擬合模型為Dose Resp模型。

有機酸抑菌率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:OD對照組為培養24 h后空白對照組的OD600值,OD實驗組為培養24 h后實驗組的OD600值。

1.3.2 有機酸聯合抑菌指數測定

參考文獻[14]中的實驗方法并做出適當改進。2種有機酸之間協同抑菌能力的測定:在96孔微孔板中設置棋盤格,以獲得聯合抑菌指數(fractional inhibitory concentration index, FICI),按照微量棋盤法橫向和豎向分別加入乙酸和乳酸溶液,調整總體系濃度分別為1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC,加入LB肉湯定容至100 μL后在每個棋盤格中加入100 μL細菌懸液,37 ℃恒溫培養箱中孵育24 h后測定OD600值。

FICI計算如公式(2)所示:

(2)

3種有機酸之間協同抑菌能力測定:根據微量棋盤法進行改進,將二維棋盤法升級為三維棋盤法,用于測試3種抑菌物質之間的聯合抑菌能力,按照微量棋盤法橫向和豎向分別加入乙酸和乳酸溶液,調整總體系濃度分別為1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC,每個棋盤格中再分布加入第3種有機酸(丁酸、檸檬酸和蘋果酸),調整總體系濃度分別為1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC,加入LB肉湯定容至100 μL后,再加入100 μL菌懸液,37 ℃恒溫培養箱中孵育24 h后測定OD600值。如公式(3)所示:

(3)

1.3.3 細胞膜電位測定

將培養至對數生長期的大腸桿菌于4 ℃、4 500 r/min離心10 min,生理鹽水洗滌3次,加入無菌水制成菌懸液,調整菌株OD600值至0.4。加入有機酸標準溶液,調整至各有機酸的MIC和有機酸組合的最佳抑菌濃度,生理鹽水作為對照組。洗滌后加入羅丹明123溶液(5 μg/mL),避光培養30 min后使用熒光分光光度計測定熒光強度,測定激發波長和發射波長分別為480 nm和540 nm,數據用平均熒光強度(average fluorescence intensity,MFI)表示。

1.3.4 細胞微觀形態觀察

將培養至對數生長期的致病菌于4 ℃、4 500 r/min離心10 min,生理鹽水洗滌3次,加入生理鹽水制成菌懸液,調整菌株OD600值至0.4。加入有機酸標準溶液,調整至各有機酸的MIC和有機酸組合的最佳抑菌濃度,生理鹽水作為對照組。孵育4 h后收集菌體并用磷酸鹽緩沖液清洗2次,在4 ℃下使用2.5%(體積分數)戊二醛固定4 h。樣品經無菌去離子水洗滌3次除去戊二醛,再用不同體積分數乙醇溶液(30%、50%、70%、85%、90%、100%)進行梯度逐級脫水,每次脫水10 min,脫水結束后再用100%乙醇重復處理3次,每次15 min。脫水的細胞使用液氮處理以蒸發乙醇。干燥、噴金后使用場發射掃描電鏡觀察細菌細胞微觀形態。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3次取其平均值。實驗數據采用OriginPro 2022繪圖,采用SPSS 25.0統計軟件進行單因素ANOVA判斷,P<0.05表示具有顯著性差異。EC50的計算使用OriginPro2022軟件,選擇Dose Resp模型進行非線性擬合。

2 結果與分析

2.1 有機酸對大腸桿菌MIC和EC50的影響

MIC是指微生物在特定生長環境下培養一段時間,可抑制某種微生物明顯增長的最低藥物濃度,用于定量測定抑菌物質的體外抗菌活性。由圖1可知,本研究中乙酸、乳酸和丁酸的MIC為2 560 μg/mL,檸檬酸和蘋果酸的MIC為5 120 μg/mL,通過測試得出不同有機酸的MIC后,利用棋盤格法研究不同有機酸的聯合抑菌效果。EC50可以更加準確地反映不同有機酸之間的抑菌能力差異,根據圖1-c、圖1-e可知,丁酸抑制大腸桿菌的能力最強,EC50為964.32 μg/mL,蘋果酸的EC50為1 727.72 μg/mL,抑菌能力最弱。由圖1-a～圖1-d可知,乙酸、乳酸、檸檬酸的EC50分別為1 004.90、1 497.50、1 406.02 μg/mL。

a-乙酸;b-乳酸;c-丁酸;d-檸檬酸;e-蘋果酸

2.2 有機酸對大腸桿菌的聯合抑菌作用

棋盤格法和固定組合法通常用于研究有機酸的協同抑菌效果,BURNS等[15]利用棋盤格法研究了弱有機酸兩兩組合對部分致病菌的聯合抑菌作用,結果表現為協同或相加效應。相關研究表明,乙酸和乳酸組合可用于新鮮葉菜的消毒處理,能夠明顯降低蔬菜表面大腸桿菌和李斯特菌等致病菌的活菌數,且不會造成蔬菜顏色和多酚含量的損失[13]。PEH等[16]將3～5種有機酸以固定的比例進行組合研究其協同抑菌效果,10種有機酸組合中有9組具有協同抑菌活性。

由圖2-a可知,乙酸和乳酸的最佳抑菌組合為640 μg/mL乙酸+640 μg/mL乳酸,聯合抑菌表現為相加作用(FICI=0.500)。因此,雖然乙酸和乳酸聯用雖然能夠降低有機酸的使用量,但是并不表現出明顯的協同抑菌能力。由圖2-b～圖2-d可知,320 μg/mL乙酸+320 μg/mL乳酸+320 μg/mL丁酸、80 μg/mL乙酸+80 μg/mL乳酸+1 280 μg/mL檸檬酸和320 μg/mL乙酸+320 μg/mL乳酸+640 μg/mL蘋果酸為抑制大腸桿菌生長的最佳抑制組合,FICI分別為0.375、0.316和0.375,均表現為協同作用,因此3種有機酸聯用具有協同抑菌作用且強于兩種有機酸聯用。

a-乙酸+乳酸;b-乙酸+乳酸+丁酸;c-乙酸+乳酸+檸檬酸;d-乙酸+乳酸+蘋果酸

2.3 有機酸及其組合對大腸桿菌細胞膜電位的影響

膜電位是指生物細胞膜內部和外部之間的電勢差,作為質子動力的一個元素參與了ATP的產生,在細菌維持微生物平衡和抗抑菌劑過程中起到重要作用[17-18],膜電位的降低會影響代謝功能從而導致細菌死亡[19]。羅丹明123是一種陽離子染料,可利用膜電位穿過細胞膜和細胞壁進入細胞基質,其熒光強度和膜電位呈正相關[20]。

由圖3可知,相較于對照組,1MIC的乙酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸處理大腸桿菌后,細胞膜電位分別降低了26.24%、22.22%、10.65%和23.96%,最佳抑制濃度的乙酸+乳酸、乙酸+乳酸+檸檬酸和乙酸+乳酸+蘋果酸分別使大腸桿菌膜電位降低了11.81%、4.75%和18.28%,而丁酸和乙酸+乳酸+丁酸會導致大腸桿菌膜電位的上升。相關研究表明最小抑菌濃度的乙酸和乳酸會導致陰道嗜血桿菌細胞膜電位下降[21],檸檬烯同樣也會導致熒光假單胞菌的膜電位下降[22]從而達到抑菌作用。因此,最小抑菌濃度的乙酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸能夠通過誘導大腸桿菌細胞膜去極化,導致細胞代謝功能紊亂以及細胞死亡,而最小抑菌濃度的丁酸不具有影響細菌膜電位的能力。

A-對照組;B-1MIC乙酸;C-乳酸:D-丁酸;E-檸檬酸;F-蘋果酸; G-乙酸+乳酸;H-乙酸+乳酸+丁酸;I-乙酸+乳酸+檸檬酸; J-乙酸+乳酸+蘋果酸

2.4 食用有機酸及其組合對大腸桿菌細胞形態的影響

研究發現大腸桿菌暴露于0.5%乳酸后,利用透射電鏡能夠觀察到細菌細胞的一般形態仍會保留,但細胞膜層結構的完整性受到嚴重破壞,大多數細菌細胞坍塌甚至破碎,細胞中可以觀察到明顯的凹坑和間隙[23],原子力顯微鏡同樣觀察到類似的現象[24]。寧亞維等[25]使用1MIC的苯乳酸和乙酸處理大腸桿菌,掃描電鏡圖分析表明大腸桿菌菌體出現凹陷變形,但對細胞壁和膜的完整性影響有限。本文利用掃描電鏡分析有機酸對大腸桿菌細胞超微結構的影響,從圖4-a中可以看出,對照組中大腸桿菌細胞顯示出規則的桿狀結構,細胞大小分布均勻。觀察圖4-b～圖4-j,有機酸和有機酸組合處理過的大腸桿菌細胞表現出明顯的形態變化,多數菌體出現收縮、彎曲變形和表面粗糙現象,少數個別菌體出現凹陷、胞內物質泄露和菌體粘連現象。

a-對照組;b-乙酸;c-乳酸;d-丁酸;e-檸檬酸;f-乙酸+乳酸;g-乙酸+乳酸;h-乙酸+乳酸+丁酸;i-乙酸+乳酸+檸檬酸; j-乙酸+乳酸+蘋果酸

有機酸能夠透過細胞膜對細胞內部產生作用,導致菌體變形以及細胞局部破裂。本文掃描電鏡結果表明,最小抑菌濃度的單一有機酸以及有機酸之間的聯合使用均會導致大腸桿菌胞內物質泄露,細胞膜皺縮以及細胞形態發生變化。

3 結論與展望

乙酸、乳酸和丁酸對大腸桿菌ATCC25922的MIC為2 560 μg/mL,檸檬酸和蘋果酸對大腸桿菌的MIC為5 120 μg/mL。乙酸、乳酸、丁酸、檸檬酸和蘋果酸的EC50分別為1 004.90、1 497.50、964.32、1 406.02/1 727.72 μg/mL。1/4 MIC乙酸+1/4 MIC乳酸、1/8 MIC乙酸+1/8 MIC乳酸+1/8 MIC丁酸、1/32 MIC乙酸+1/32 MIC乳酸+1/4 MIC檸檬酸以及1/8 MIC乙酸+1/8 MIC乳酸+1/8 MIC蘋果酸,即可達到單一有機酸質量濃度為1 MIC時的抑菌效果。

乙酸和乳酸聯用表現為相加作用,3種有機酸進行組合時(乙酸+乳酸+丁酸、乙酸+乳酸+檸檬酸、乙酸+乳酸+蘋果酸)對大腸桿菌表現出顯著的協同抑菌作用。1 MIC的乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸以及最佳抑菌濃度的乙酸+乳酸、乙酸+乳酸+檸檬酸和乙酸+乳酸+蘋果酸能夠降低大腸桿菌細胞膜電位,影響大腸桿菌的代謝活性。1 MIC的有機酸和最佳抑菌濃度的有機酸組合均能夠導致大腸桿菌細胞膜破裂,細胞微觀形態發生改變。

有機酸在合理的比例下組合使用時能夠起到協同抑菌作用,在較低的使用量下抑制致病菌的生長。有機酸組合在食品生產和加工過程中,可以用于控制微生物污染和食源性病原體的傳播,有望成為克服細菌抗生素耐藥性的替代方案。由于其抑菌特性受到生物體生理狀態和外部環境的顯著影響,并且有機酸的廣泛使用可能導致細菌耐酸性提高,因此未來可以通過基因組學或蛋白組學等手段進一步深入研究有機酸協同抑菌的內在機制,并結合其他抑菌保鮮技術(化學、物理和生物),設計基于有效協同活性或附加效果的改進抑菌策略,用以滿足現代消費者對食品安全和品質的要求。