超聲對青稞蛋白理化性質和消化特性的影響

陳玉玉,石夢夢,王月琴,周明,張春紅,曹洪偉,4*,宋洪東,4,管驍,4

1(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)

2(西藏喜馬拉雅生態科技股份有限公司,西藏 日喀則,857000)

3(中國人民解放軍海軍特色醫學中心,上海,200052)

4(國家糧食產業(城市糧油保障)技術創新中心,上海,200093)

青稞又稱為裸大麥,是青藏高原中最具特色的高原農作物。青稞中蛋白質含量豐富,氨基酸比例均衡,可作為提供優質植物蛋白的潛在來源。研究發現,青稞中蛋白質平均含量為13.08%,最高含量可達20.33%,而且包含人體必需的8種氨基酸,對于補充機體每日必需氨基酸具有重要意義[1]。在食品領域,青稞蛋白的功能特性及其消化吸收性決定了其應用前景,但由于種植區域的限制,國內外對青稞蛋白功能特性和消化吸收特性的研究鮮有報道,在一定程度上限制了青稞的深加工利用。

目前,有多種食品加工技術應用于植物蛋白的改性處理,以提高其營養功能特性。其中,超聲波技術作為一種綠色安全的非熱加工技術,具有高效、綠色、可持續等特點,可應用于改善食品的營養功能特性和感官品質,更好地滿足消費者對高質量食品的需求。研究發現,適當的超聲波處理可改變蛋白質分子的空間結構,從而改善蛋白質的理化性質和體外消化特性,對進一步提高食品的營養功能、感官品質以及消化吸收性發揮重要的作用[2]。

因此,本研究以青稞粉為原料,探究功率為600 W的超聲處理在不同時間條件下對青稞蛋白理化性質的影響,并通過測定蛋白質空間結構的變化進一步闡明超聲波作用可改善青稞蛋白理化特性的原因,最后通過體外模擬實驗探討超聲改性處理引起的青稞蛋白體外消化特性的變化,為改善青稞蛋白產品的營養功能特性和消化吸收性提供技術支撐,對提高青稞蛋白的利用價值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞粉,西安維特生物科技有限公司提供;胃蛋白酶(15 000 U/mg)、胰蛋白酶(30 000 U/mg),四川德博爾制藥有限公司提供;氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)等試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

MODEL-3旋轉蒸發儀,上海醫療器械專機廠;D5A-WS臺式低速離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司;SB-25-12D超聲儀,寧波新芝生物科技有限公司;SCIENTZ-10 N冷凍干燥機,北京博醫康實驗儀器公司;173Plus DLS動態光散射分析儀,美國Brook haven儀器公司;K9840凱氏定氮儀,濟南海能儀器有限公司;SP-2102UV紫外可見分光光度計,美國PerkinElmer儀器公司;RF-5301PC熒光分光光度計,日本島津公司;Navigator-100掃描電子顯微鏡,北京聚束科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青稞蛋白的提取

參考DU等[3]的方法,并稍作改進。將青稞粉(200 g)與去離子水(5 000 mL)于室溫下攪拌30 min,并調節pH至11.0。然后將混合物40 ℃下攪拌1 h后,將懸浮液以5 000×g離心15 min,在等電點(pH 4.5)處沉淀獲得上清液。根據溶解度,分別使用去離子水、20 g/L氯化鈉、700 mL/L乙醇和堿性溶液(pH 11)從上清液中提取青稞蛋白。在40 ℃下提取1 h,并以5 000×g離心15 min,通過旋轉蒸發從700 mL/L乙醇上清液中獲得青稞醇溶蛋白。再將溶液等電點調節至4.8,從堿性溶液上清液中獲得青稞谷蛋白。將收集的青稞蛋白冷凍干燥并低溫儲存,以供進一步實驗分析。

1.3.2 超聲波處理青稞蛋白

取4.0 g青稞蛋白溶于100 mL蒸餾水中,于室溫下以350 r/min磁力攪拌30 min,制備均勻的青稞蛋白懸浮液。參考JIN等[4]的超聲改性方法并稍作改進。由預實驗發現,在超聲時間一定的條件下,超聲波功率為600 W時,青稞蛋白的理化性質以及消化吸收特性較為可觀。因此,本研究于室溫下對青稞蛋白懸浮液進行600 W超聲處理,脈沖開啟時間為5 s,關閉時間為3 s,且超聲探頭浸入蛋白懸浮液表面下2 cm,超聲處理時間分別為0、10、20、30、40、60 min,處理后的樣品于4 ℃冰箱中保存。

1.3.3 青稞蛋白溶解度和濁度的測定

青稞蛋白溶解度的測定參考HU等[5]的方法,并稍作改進。將各組青稞蛋白樣品與蒸餾水按料液比1∶100(g∶mL)混合得到青稞蛋白懸浮液,于8 000×g條件下離心30 min。用凱氏定氮法測定離心后上清液中蛋白質含量,青稞蛋白的溶解度表示為上清液蛋白質含量與離心前總蛋白含量之比,具體計算如公式(1)所示:

(1)

青稞蛋白濁度的測定參考MARTINI等[6]的測定方法并稍作修改。將青稞蛋白溶液質量濃度稀釋至4 mg/mL,于室溫下磁力攪拌30 min后測定600 nm處吸光值,以去離子水為空白對照,每個樣本測定3次取平均值。

1.3.4 青稞蛋白乳化性和乳化穩定性的測定

參考DABBOUR等[7]的測定方法并稍作修改。將青稞蛋白溶液稀釋至質量濃度為5 mg/mL,稀釋后的蛋白溶液與大豆油以3∶1體積比混合,用均質機對樣品溶液以20 000 r/min勻漿2 min,立即取樣0.05 mL并加入5 mL 0.1%的SDS溶液搖勻稀釋100倍。測定波長為500 nm處的吸光值,樣品于室溫下靜置10 min后,重復上述操作,均以SDS溶液作為空白對照。按公式(2)、公式(3)計算乳化性(EC,m2/g)和乳化穩定性(ES,%):

(2)

式中:C為蛋白質質量濃度,g/mL;A0表示樣品吸光值;DF為稀釋倍數;ρ是光程,1 cm;θ表示乳液中油相所占比例,0.25。

(3)

式中:EC和EC10分別表示0 min和10 min后的乳化能力。

1.3.5 青稞蛋白起泡性和泡沫穩定性的測定

參考GAO等[8]的方法測定青稞蛋白的起泡性和泡沫穩定性并稍作修改。將超聲處理后的青稞蛋白溶液質量濃度稀釋至0.01 g/mL,取10 mL樣品溶液以20 000 r/min均質2 min后,記錄泡沫體積V2,室溫下,靜置30 min后記錄泡沫體積V30。按公式(4)、公式(5)計算起泡性(foaming characteristics,FC)和泡沫穩定性(foam stability,FS):

(4)

(5)

式中:V0為均質前蛋白溶液的體積;V2為均質2 min后的泡沫體積;V30為室溫靜置30 min后的泡沫體積。

1.3.6 青稞蛋白流變特性的測定

參考ZHANG等[9]的測定方法并稍作修改。用配備有平行板(直徑40 mm,間隙1 000 μm)的流變分析儀恒溫測定青稞蛋白溶液的流變性質,在0.1 s-1的剪切速率下進行流動分析,剪切速率范圍為0～1 000 s-1。

1.3.7 青稞蛋白平均粒徑與粒徑分布的測定

取5 mL樣品溶液,加入蒸餾水稀釋至100 mL,使溶液中無肉眼可見的渾濁或沉淀雜質后進行離心,取出上清液,利用動態光散射儀進行掃描,在25 ℃平衡測定2 min,平行重復測量3次。

1.3.8 青稞蛋白微觀結構的測定

參考FLORES-JIMéNEZ等[10]的方法并稍作修改。用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察超聲對青稞蛋白微觀結構的影響,將真空冷凍干燥后的青稞蛋白樣品表面噴金使其導電,利用SEM在30 kV的加速電壓下,放大200、500倍對青稞蛋白樣品的微觀結構進行掃描。

1.3.9 青稞蛋白紫外吸收光譜分析

參考WANG等[11]的方法并稍作修改。將超聲處理后的青稞蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L, pH 7)稀釋至0.5 mg/mL,用紫外可見分光光度計測定紫外吸收強度,掃描波長為230～450 nm,掃描速度為5 nm/s。

1.3.10 青稞蛋白熒光光譜分析

參考HUANG等[12]的方法并稍作修改。用熒光分光光度計測定其熒光強度,將超聲處理后的蛋白質溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.1 mg/mL,設定激發波長為290 nm,掃描在310～460 nm發射波長下的熒光光譜,狹縫寬度恒定為5 nm。

1.3.11 青稞蛋白體外消化特性的測定

參考WANG等[13]的方法并稍作修改。配制胃消化液中,取0.3 g胃蛋白酶、2.0 g氯化鈉和0.7 mL濃鹽酸溶液均勻混合,用去離子水定容至100 mL,并調節溶液pH為1.2;配制腸消化液中,將0.68 g的磷酸二氫鉀用25 mL去離子水溶解完全后,依次加入19 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液和40 mL去離子水混合,然后加入4.0 g胰蛋白酶,用去離子水定容至100 mL,并調節溶液pH為7.5。

體外模擬青稞蛋白胃和腸消化過程及其消化率的測定:將超聲處理后的青稞蛋白樣品與配制的胃、腸消化液混合。取10 mL蛋白溶液與12 mL配制的胃消化液分別置于37 ℃水浴中預熱15 min后,將兩溶液混合均勻于37 ℃水浴條件下消化2 h后,立即煮沸滅酶,冷卻備用。再將溶液pH調節至7.0,加入等體積的腸消化液,于37 ℃水浴條件下消化2 h后,立即沸水滅酶,冷卻備用。分別將上述兩消化液以5 000×g離心30 min,收集上清液。用凱氏定氮儀測定蛋白質含量,計算青稞蛋白的體外消化率,如公式(6)所示:

體外消化率/%=

(6)

1.4 數據分析

所有實驗平行重復3次,結果以平均值±標準差(SD)表示。實驗數據用Excel進行初步整理,用SPSS 21.0進行數據方差分析和Duncan多重比較,并用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲對青稞蛋白溶解度和濁度的影響

蛋白質的溶解度主要取決于蛋白質變性和聚集的程度、表面疏水性以及蛋白質分子大小等。而濁度作為蛋白質聚集和結合程度的重要指標,與蛋白質的聚集程度呈正相關[14]。圖1顯示了超聲時間對青稞蛋白溶解度和濁度的影響。發現未經超聲處理的青稞蛋白溶解度為54.63%,超聲處理0～20 min時,青稞蛋白的溶解度隨超聲處理時間的延長逐漸增大,當超聲時間為20 min時,溶解度達到最大為78.45%。主要是因為超聲作用改變了蛋白質的空間構象,使其分子結構變得疏松,蛋白分子與水之間的接觸面積以及相互作用力增大,可溶性蛋白含量增多,從而溶解度顯著提高[15]。而青稞蛋白濁度的變化與之相反,隨著超聲時間的延長,青稞蛋白的濁度先減小后增大又趨于平穩,當超聲時間為20 min時,蛋白質的濁度最小。主要是因為超聲波的高剪切效應破壞了青稞蛋白的完整結構,使蛋白質之間的分子鍵破裂,較大的蛋白質聚集體解聚成小分子,顆粒粒徑減小,光散射的比表面積增大,青稞蛋白的濁度降低。若繼續延長超聲處理時間,小顆粒蛋白分子之間易發生重聚集形成較大的蛋白聚集體,影響光傳播,從而增大蛋白質的濁度[16]。

a-溶解度;b-濁度

2.2 超聲對青稞蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

乳化活性指數(emulsifying activity index,EAI)是衡量蛋白質乳化能力的重要指標,其數值越高,表明蛋白質可越快速吸附在油滴表面,形成油水界面。乳化穩定性指數(emulsion stability index,ESI)則反映了蛋白質預防乳液分離的能力[17]。圖2顯示了不同超聲處理時間對青稞蛋白乳化性和乳化穩定性的影響,發現青稞蛋白的乳化性隨著超聲時間的延長先升高后降低,當超聲處理20 min時,青稞蛋白的乳化活性指數達到最大值11.05 m2/g。青稞蛋白的乳化穩定性變化趨勢與蛋白乳化性相似,在600 W超聲處理20 min時達到最大值。這主要是因為超聲波作用促使青稞蛋白分子內部空間結構的展開,更多疏水性基團的暴露加速蛋白質分子擴散到水油界面與油脂相互作用,形成穩定的網絡結構;或者由于超聲波的剪切作用,蛋白質分子之間的相互作用力減弱,顆粒粒度分布均勻,從而有效提高了青稞蛋白的乳化性以及乳化穩定性。若繼續延長超聲處理時間,大量蛋白質顆粒易通過分子間力發生交聯,從而降低了青稞蛋白的乳化性和乳化穩定性[18]。溶解性和濁度作為青稞蛋白的功能特性之一,超聲處理對青稞蛋白乳化性和乳化穩定性的影響與蛋白質溶解性和濁度的變化結果一致。

圖2 不同超聲處理時間對青稞蛋白乳化性和乳化 穩定性的影響

2.3 超聲對青稞蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

蛋白質的起泡能力與其形成液-氣分散體的能力有關,而起泡穩定性表示一定時間后初始泡沫體積中剩余泡沫體積的百分比,是評估攪打食品質量穩定性的重要參數[19]。圖3顯示了超聲處理對青稞蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響,發現超聲波處理后青稞蛋白樣品的起泡性和泡沫穩定性均高于未經超聲處理的蛋白質。在超聲處理時間為20 min時,青稞蛋白的起泡能力達到最大值74.68%,蛋白質的泡沫穩定性最高為79.54%。這主要是因為超聲波作用使蛋白質顆粒均勻分布于溶液中,而粒徑較小的蛋白分子容易被吸附到空氣和水的界面上展開,對樣品的發泡性具有積極的作用。而且在超聲波作用過程中,空化氣泡的產生使蛋白質分子之間的相互作用力減弱,蛋白顆粒粒徑減小,蛋白質更容易在空氣和水的界面上展開并形成穩定性較高的泡沫[20]。超聲處理對青稞蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響與其對蛋白分子的乳化性和乳化穩定性的作用結果是一致的。

圖3 不同超聲處理時間對青稞蛋白起泡性和泡沫 穩定性的影響

2.4 超聲對青稞蛋白流變特性的影響

蛋白質溶液的表觀黏度主要取決于蛋白分子的理化性質及其表面疏水性的程度[21]。圖4顯示了不同超聲處理時間條件下剪切速率對青稞蛋白表觀黏度的影響以及剪切速率和剪切應力之間的變化關系。結果表明,超聲波處理顯著降低了青稞蛋白的表觀黏度,并且隨著剪切速率的增加,剪切應力增加,而表觀黏度逐漸降低。與未經超聲處理的青稞蛋白相比,超聲處理可明顯減小青稞蛋白的表觀黏度和剪切應力。當超聲處理20 min時,青稞蛋白的表觀黏度降至最低,在相同的剪切速率下,超聲處理時間達到30 min時,蛋白質的表觀黏度呈現小幅度的增長后逐漸下降。這主要是因為超聲波對青稞蛋白產生較強的剪切作用,改變了蛋白分子與水之間的結合能力或者破壞了蛋白質分子之間的化學鍵,使蛋白分子粒徑減小,流動性增強,黏度降低[22]。然而,過長時間的超聲波作用易誘導蛋白質顆粒與水之間形成較強的作用力以及蛋白分子之間發生連續的重聚集過程,使青稞蛋白粒徑增大,流動性減弱,黏度增大。因此,超聲波作用對青稞蛋白流變特性的影響與對蛋白分子的溶解度和粒徑大小的關系密切相關。

a-表觀黏度;b-剪切應力

2.5 超聲對青稞蛋白平均粒徑與粒徑分布的影響

超聲波作用易使蛋白質發生變性,從而影響蛋白分子的結構特征,使其粒徑減小[23]。圖5顯示了超聲處理時間對青稞蛋白平均粒徑的影響,發現超聲作用顯著降低了青稞蛋白的平均粒徑,在超聲20 min時,蛋白分子的平均粒徑達到最小值。主要是因為超聲波的空化作用破壞了蛋白質分子的空間結構,使其粒徑減小。不同超聲時間對青稞蛋白粒徑分布的影響如圖6所示。未經超聲處理的蛋白質分子呈單峰分布,超聲處理后青稞蛋白的粒徑分布由單峰變為雙峰,且主峰左移,粒徑分布范圍變窄。超聲10 min和20 min時,在25～75 nm出現粒徑次峰,表明超聲作用使青稞蛋白分子發生解聚,粒徑減小。超聲30、40、60 min的青稞蛋白在1 000～3 000 nm出現粒徑次峰,且主峰右移,粒徑增大。主要是因為適當的超聲波剪切作用可使蛋白質分子之間發生碰撞,破壞分子之間的相互作用力,使蛋白質聚集體轉化為小片段亞基,粒徑減小,粒徑分布范圍變窄,溶液更均勻穩定[24]。因此,粒徑大小是蛋白質功能特性的重要部分,粒徑小而表面積大,與水分子之間的作用力較強,溶解度增大,從而改善了蛋白質分子的乳化性和發泡性能。

圖5 不同超聲處理時間對青稞蛋白平均粒徑的影響

圖6 不同超聲處理時間對青稞蛋白粒徑分布的影響

2.6 超聲對青稞蛋白微觀結構的影響

用SEM觀察青稞蛋白的微觀結構,探究在超聲波作用下青稞蛋白結構的變化。圖7顯示了超聲處理時間對青稞蛋白微觀結構的影響,測定了放大200倍和500倍條件下青稞蛋白結構的變化。結果發現未進行超聲處理的青稞蛋白表面較平整且呈大塊狀,超聲處理后的青稞蛋白變得異質、無序,蛋白質結構更加疏松多孔且形成許多不同形狀和大小的蛋白顆粒。主要是因為超聲波空化作用促使青稞蛋白表面電荷的增加以及疏水性基團和巰基的暴露,而這些基團容易相互作用,從而形成不規則的片段[25]。當超聲處理20 min時,青稞蛋白顆粒較小,結構更疏松多孔,這與超聲對青稞蛋白粒徑大小的影響結果一致。因此,超聲強度600 W,超聲處理時間為20 min時,青稞蛋白結構的變化更有利于其理化特性的改善。

a-青稞蛋白對照組(×200);b-超聲處理20 min改性組(×200); c-青稞蛋白對照組(×500);d-超聲處理20 min改性組(×500)

2.7 超聲對青稞蛋白紫外吸收光譜的影響

蛋白質中主要含有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸,其微環境的變化以及在近紫外區域的光吸收強度可用于表征蛋白質空間構象的變化[26]。圖8顯示了不同超聲時間對青稞蛋白紫外吸收光譜的影響。發現青稞蛋白的紫外吸收強度隨超聲時間的延長先增大后減小,但不會影響最大吸收峰位置。主要是因為在超聲波的空化作用下,蛋白質分子空間結構展開促使其內部疏水基團暴露以及蛋白分子螺旋結構伸展,色氨酸、酪氨酸等顯色基團從內部疏水區域轉移至極性溶劑環境中,從而增大了蛋白質的紫外吸收強度[27]。若繼續延長超聲時間,蛋白質分子可能會發生折疊聚集,暴露的發色基團減少,紫外吸收強度降低。

圖8 不同超聲處理時間對青稞蛋白紫外吸收光譜的影響

2.8 超聲對青稞蛋白熒光強度的影響

色氨酸和酪氨酸殘基周圍環境的極性決定了熒光強度,而熒光強度的波動可作為蛋白質三級結構變化的指標[28]。圖9顯示了不同超聲時間對青稞蛋白熒光強度的影響。發現超聲處理后青稞蛋白的熒光強度顯著增強,但在不同超聲時間內,青稞蛋白的最大發射波長幾乎不變。這主要是因為超聲波作用促使青稞蛋白內部疏水性基團的暴露以及極性區域的展開分離,蛋白質三級結構進一步拉伸,大量顯色氨基酸暴露,從而增加了熒光強度[29]。超聲20 min時的熒光強度最大,這一結果與青稞蛋白理化性質的變化一致。因此,適當的超聲波處理可促使蛋白分子結構展開以及改變蛋白質三級結構,從而改善青稞蛋白的理化特性。

圖9 不同超聲處理時間對青稞蛋白熒光強度的影響

2.9 超聲對青稞蛋白體外消化率的影響

研究發現,對蛋白質分子進行超聲波處理,由于超聲波的空化作用,蛋白質分子被分解成較小的片段,顯著提高了其反應消化速率[30]。圖10顯示了不同時間的超聲處理對青稞蛋白體外消化率的影響?？傮w上來看,在模擬胃和腸液消化過程后,青稞蛋白的體外消化率變化趨勢相似,超聲改性處理顯著提高了青稞蛋白的體外消化率,當超聲處理時間為20 min時,體外消化率達到最大值79.3%。這主要是因為超聲作用對青稞蛋白分子構象和微觀結構的影響,使其暴露更多接觸位點,增加了蛋白質對消化酶的可及性。然而,如果繼續延長超聲處理的時間,青稞蛋白的體外消化率逐漸減小后趨于平穩,可能是因為在外界因素的作用下,蛋白質分子的變性和復性處于平衡狀態,其中變性有利于消化,而復性使蛋白質抵抗消化,適當的超聲處理會促進其發生變性,從而提高蛋白質的體外消化率[31]。

圖10 不同超聲處理時間對青稞蛋白體外消化率的影響

3 結論

本文以青稞蛋白為研究對象,探究超聲處理時間對青稞蛋白理化性質和消化特性的影響,并從蛋白質微觀結構變化等方面進一步闡述超聲波作用對青稞蛋白理化特性的影響機制。結果表明,600 W超聲處理20 min時,超聲波的空化作用可改變蛋白質分子的空間結構并使其展開解離,顯著改善了青稞蛋白的溶解度、起泡性、泡沫穩定性和乳化性等理化性質以及青稞蛋白的體外消化率,降低了青稞蛋白的濁度、蛋白分子的粒徑和表觀黏度,使蛋白質溶液的粒徑分布范圍變窄,溶液穩定性更強。此外,在超聲處理20 min時,青稞蛋白的顆粒較小、結構更疏松,而且蛋白質分子內部結構的展開,促使其三級結構進一步拉伸以及疏水性基團和顯色基團的暴露,紫外吸光度和熒光強度均增大,增強了超聲波對青稞蛋白理化性質和體外消化特性的改善作用。綜上所述,超聲波是改善青稞蛋白功能特性的有效方法,且超聲強度600 W、時間為20 min的處理條件對青稞蛋白的理化性質和體外消化率的改善作用最強。本研究對拓展青稞蛋白在食品工業中的應用以及提高青稞蛋白的經濟價值具有重要意義。