百里香酚單向輸水抑菌墊制備及其對冷鮮馬肉保鮮研究

徐敏敏,王潮姿,李文博,黃歡,孫文秀

(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院,內蒙古 呼和浩特,010018)

冷鮮肉是指對屠宰后的畜禽胴體進行迅速冷卻處理,讓屠宰后的胴體溫度(以后腿為測量點)在24 h內降至0～4 ℃,期間要嚴格遵循衛生標準,并且在之后的排酸、分割及零售過程中一直維持在0～4 ℃條件下的鮮肉[1]。因冷鮮肉含有豐富的水分、蛋白質、脂質、含氮浸出物及維生素等營養物質[2],深受人們喜愛。但在貯藏和銷售過程中,冷鮮肉容易出現汁液流失現象,導致冷鮮肉極易受到微生物污染而腐敗[3]。因此,如何在冷鮮肉貯存銷售期間抑制微生物的生長繁殖,延長冷鮮肉的貨架期成為人們關注的熱點。

近年來,人們對綠色、安全、無毒的保鮮劑的關注越來越高。百里香酚是一種單帖酚類植物精油,該化合物已在歐盟(European Union, EU)香料列表中注冊,并被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)列為一般公認的安全(generally recognized as safe, GRAS)[4-6]。它具有廣譜的抑菌性和抗氧化特性[7-8],但由于其揮發性、強烈的氣味和疏水性等缺陷限制了其在食品中的應用[9]。目前,通過靜電紡絲技術對精油進行包埋,可以提高精油的穩定性,改善其疏水性,掩蓋感官屬性并可以達到可控釋放的效果。WANG等[10]制備紫蘇醛、百里香酚、ε-聚賴氨酸負載明膠/玉米蛋白納米纖維膜,對冷藏雞胸肉保鮮效果的評價,延緩了雞胸肉的生化變化,對延長冷藏雞胸肉的保質期有顯著的效果。但其只能通過百里香酚單一的方式抑菌?；诖搜芯勘尘?本研究通過靜電紡絲技術制備了一種單向輸水抑菌墊。通過調整表面納米孔徑大小,重點調控上、中層表面納米孔徑大小,形成梯度孔徑實現單向輸水,可以吸收汁液流失,減少微生物的再繁殖,同時將精油包埋到纖維膜中,達到緩釋的效果。并將其應用于冷鮮馬肉的保鮮中評價其保鮮效果,從而延長冷鮮馬肉的貨架期。所制備的抑菌墊為冷鮮肉抑菌保鮮提供了一種新型手段和思路,有利于為冷鮮肉產業的發展,可有效延長冷鮮肉的貨架期并提升貯藏期肉品品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百里香酚(thymol,99%)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF),上海麥克林生化科技有限公司;聚乳酸(polylactic acid, PLA,Mw=100 000 g/mol)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP),美國Nature Works公司;二氯甲烷、硫代巴比妥酸、無水乙醇、氧化鎂、硼酸、均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;正己烷,天津市鑫鉑特化工有限公司;平板計數瓊脂、營養肉湯,廣東環凱微生物科技有限公司;馬肉,農貿市場。

1.2 儀器與設備

TL-F6靜電紡絲機,深圳通力微納科技有限公司;IR Affinity-1傅里葉變換紅外光譜儀,島津企業管理(中國)有限公司;U-2910紫外可見分光光度計,日本日立公司;TM 4000 Plus掃描電子顯微鏡,日本株式會社日立高新技術那珂事業所;HARKE-SPCA接觸角測定儀,北京哈科試驗儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 纖維膜的制備

1.3.1.1 上層PLA/thymol纖維膜的制備

將一定量的聚乳酸顆粒溶解于二氯甲烷、DMF的混合物(二氯甲烷與DMF的體積比為9∶1)中得到12%(質量分數)的溶液,攪拌溶解。之后,將百里香酚(10、30、50 g/L)分別加入到上述溶液中,充分混合后得到靜電紡絲溶液。同時,制備純聚乳酸溶液作為對照樣品。

將紡絲溶液添加到體積為20 mL注射器中,安裝到靜電紡絲機上。其紡絲參數為:正極電壓為+20 kV,流速為1 mL/h,針尖距不銹鋼板的垂直距離為15 cm,濕度和溫度為20%和25 ℃。得到10、30、50 g/L PLA/Thymol纖維膜,將得到的纖維膜在室溫下干燥24 h。

1.3.1.2 中間層PVA/PVP纖維膜的制備

a)交聯PVA纖維膜的制備

稱取一定量的PVA粉末,加入蒸餾水,攪拌(60 ℃)直至溶解。得到質量分數為12%(質量分數)的PVA紡絲溶液,靜置消泡后進行靜電紡絲[溫度(20±2) ℃,濕度(25±2)%],電壓為20 kV,推進速度0.5 mL/h,接收距離為15 cm。

向上一步配制好的PVA紡絲溶液內加入質量分數為5%(質量分數)的戊二醛(glutaraldehyde, GA)水溶液,使得GA與PVA發生原位交聯。用PVA/GA紡絲溶液進行靜電紡絲。將得到的纖維膜置于盛有鹽酸的燒杯上方,進行鹽酸熏蒸催化,得到交聯PVA纖維膜。

b)交聯PVA/PVP纖維膜的制備

稱取一定質量的PVP粉末溶于適量蒸餾水中,配制為12%(質量分數)的PVP溶液。將其加入到1.3.1.2節中PVA紡絲溶液中,制得PVA與PVP不同體積比(9∶1、8∶2、7∶3)的混合紡絲液,靜置后紡絲,通過掃描電鏡觀察纖維形貌。最終確定PVA與PVP體積比,然后向紡絲溶液中加入5%(質量分數)GA溶液進行原位交聯并用鹽酸熏蒸催化處理。

1.3.1.3 單向輸水抑菌墊的制備

單向輸水抑菌墊是由3層組成的:上層為PLA/thymol纖維膜,中間層為交聯PVA/PVP纖維膜,底層為紙纖維膜。底層紙纖維膜作為接收,通過靜電紡絲先將中間層紡絲,再將上層紡絲,最后形成單向輸水抑菌墊。

1.3.2 上層PLA/thymol纖維膜在不同食品模擬液中的釋放效果測定和傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)測定

釋放效果測定:參考GB 31604.1—2015《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》進行。測量溶液在278 nm處的吸光度來確定thymol的釋放量(注意:保持溶液的恒定體積)。10%(體積分數)乙醇中,thymol的線性方程為:y=4.489 3x+0.005 5,R2=0.999 3。50%(體積分數)的乙醇中,thymol的線性方程為:y=5.228 4x+0.016,R2=0.999。正己烷中,thymol的線性方程為:y=6.761 1x+0.017 7,R2=0.999。釋放的thymol累積量的計算如公式(1)和公式(2)所示:

Qn=CnV+V1(C1+C2+C3+…+Cn-1)

(1)

(2)

式中:第n次取樣時thymol累計釋放量為Qn,μL;第n次取樣時溶液的含量為Cn,μL/mL;溶液的體積為V,mL;每次取樣量為V1,mL;累計釋放率為q,%;總負載量為Q0,μL。

FTIR:thymol、PLA膜和PLA/thymol纖維膜通過衰減全反射IRSpirit-T進行分析。光譜采集波段范圍為500～4 000 cm-1。每個樣品的光譜是通過3次掃描的平均值得到的,分辨率為4 cm-1。

1.3.3 單向輸水抑菌墊的結構表征及性能研究

1.3.3.1 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)測定

將待測樣品在真空下進行噴金處理(Hummer 6.2濺射系統)。將樣品剪成相同的尺寸,固定于導電膠上。用TM-4000型掃描電鏡下觀察纖維的微觀結構。

1.3.3.2 單向輸水抑菌墊的單向輸水性能測定

將抑菌墊剪成5 cm×1 cm的長方形,固定于玻璃板上,通過水接觸角(water contact angle, WCA)系統(Data physics,OCAESr)收集了單向水傳遞的效果[11]。將2 μL純水滴在抑菌墊表面,立即拍照記錄。

1.3.3.3 單向輸水抑菌墊的抑菌性能測定

采用瓊脂擴散法評價單向輸水抑菌墊對革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的抑菌性能,該方法通過測量抑制區的直徑來分析抑菌效果[12]。簡而言之,在無菌條件下,將200 μL的微生物懸浮液(1×104CFU/mL))均勻地涂在營養瓊脂平板上。然后,將準備好的纖維膜切成直徑為10 mm的圓片,用紫外線照射滅菌30 min,放在接種的營養瓊脂的頂部中心,在37 ℃下培養24 h,24 h后觀察實驗結果,測量抑菌圈直徑以確定抗菌活性。

1.3.4 單向輸水抑菌墊對冷鮮馬肉的保鮮實驗

1.3.4.1 樣品處理

將冷鮮馬肉放入無菌生物安全柜中紫外照射30 min去除表面雜菌,去除冷鮮肉中的脂肪和結締組織,將肉樣切分成大小相同的小肉塊(25±0.1) g。將抑菌墊按照表1進行分組并放置于肉樣的底部(其中上層纖維膜靠近肉),其中抑菌墊大小均為5 cm×5 cm。均采用托盤包裝并貯存在4 ℃冰箱中,不同時間間隔測定冷鮮馬肉的品質變化。

表1 馬肉樣品的分組Table 1 Grouping of horse meat samples

1.3.4.2 汁液流失的測定

在貯存和分析冷鮮肉樣品之前,對樣品進行稱重以確定滲出物損失的潛在變化。通過計算樣品的初始重量和最終重量之間的差異,計算出滲出液損失的百分比。滲出液損失的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:滲出物損失為w,%;肉樣的初始質量為M1,g;肉樣最終質量為M2,g。

1.3.4.3 揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)值測定

TVB-N值測定參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》的方法執行。

1.3.4.4 菌落總數的測定

參考GB 4789.2—2022的方法,選用平板計數法測定肉樣的菌落總數,每個樣品測定3次取平均值。

1.4 統計分析

采用Origin 9.65進行繪圖分析和SPSS(Version 26.0)軟件對數據進行分析。所有實驗至少進行3次。結果值以均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 上層PLA/thymol纖維膜的表征

a-PLA纖維膜,b-百里香酚,c-PLA/10 g/L thymol纖維膜, d-PLA/30 g/L thymol纖維膜,e-PLA/50 g/L thymol纖維膜

PLA/50 g/L thymol纖維膜在各種食品模擬物中的釋放效果如圖2所示。由于食品模擬物不同的特性,thymol的釋放率有明顯的差異[16]。測試了3種類型的食品模擬物,分別是高水活性食品模擬物[10%(體積分數)乙醇溶液]、高酒精含量食品模擬物[50%(體積分數)乙醇溶液]和油脂類食品模擬物(正己烷)[17]。如圖2所示,thymol的積累率將隨著時間的延長而增加。相比之下,thymol在50%乙醇中的遷移速度最快,而在正己烷中的延長速度最慢,這表明它在正己烷溶液中具有緩釋作用。圖2表明,纖維膜對油脂類食品模擬物的效果更持久,達到緩釋的效果,因此可能會延長冷鮮馬肉的貨架期。

圖2 PLA/5%Thymol纖維膜在不同食品模擬劑下的 百里香酚累積釋放率

2.2 單向輸水抑菌墊表征

2.2.1 形貌分析

圖3是單向輸水抑菌墊各層組成及其整體的掃描電子顯微鏡圖像。其中,圖3-a為上層PLA/thymol纖維膜,圖3-b為中間層交聯PVA/PVP纖維膜,圖3-c為底層紙纖維膜,圖3-d為單向輸水抑菌墊的截面結構?？梢钥闯?單向輸水抑菌墊的3層結構緊密相連。各層的微觀形貌在組成單向輸水抑菌墊前后,其形貌不發生改變,因為單向輸水抑菌墊的組成過程屬于物理性的,對各層的結構不會改變。

A-PLA/thymol纖維膜;b-PVA/PVP纖維膜;c-紙纖維膜; d-截面結構

2.2.2 單向輸水性能

兩側具有非對稱潤濕性的膜可以實現水的定向傳輸[18]。當液滴位于疏水側時,受到2個相反的力,即PLA膜在疏水側的水的排斥力(hydrophobic pressure,HF)和水的靜水壓力(hydrostatic pressure, HP)[19]。當HF小于HP時,液滴穿過疏水層并與親水層接觸。然后液滴受到來自親水性PVA纖維的毛細管力(capillary pressure, CF)并立即擴散到吸收層中(圖4-a)。圖4-b是水接觸角圖,表明水滴在疏水性PLA纖維上停留了一段時間,然后相對迅速地被吸收到親水層中。結果與上述理論一致。

a-單向輸水的機理;b-納米纖維膜正向動態滲透過程

2.2.3 抗菌性能

采用瓊脂擴散法對所得抑菌墊的抗菌性能評價。使用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為代表,表2為單向輸水抑菌墊對所測不同菌落的抑制效果,PLA纖維膜沒有明顯的抑菌效果。隨著thymol濃度的增加,抑菌活性也在增加。該抑菌墊對大腸桿菌的抑菌直徑從(15.19±0.65) mm增加到了(24.70±0.21) mm,對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑從(15.68±0.25) mm增加到了(24.32±0.72) mm。

表2 不同濃度的thymol抑菌墊抑菌圈直徑 單位:mmTable 2 Diameter of inhibition zone of thymol inhibition pad at different concentrations

百里香酚本身具有很強的抗菌,使用靜電紡絲包埋后在依然保留了抗菌活性,與ANAYA-CASTRO等[20]研究結果一致。百里香酚表現優異的抗菌性是因為其酚羥基能與細菌細胞膜作用,而破壞了細胞膜結構[21]。

2.3 單向輸水抑菌墊對冷鮮馬肉貯藏期間理化性質的影響

2.3.1 冷鮮馬肉的汁液流失率變化

如圖5-a所示,冷鮮馬肉汁液流失率變化情況。隨著貯藏時間的延長,冷鮮馬肉的汁液流失率呈上升趨勢。第6天后,實驗組對馬肉汁液的吸收量顯著低于對照組(P<0.05)?？瞻捉M和對照組在貯藏的第12天分別達到了7.6%和7.4%,而實驗組在貯藏的第18天汁液流失率才達到6.2%。出現這種現象的原因是,汁液流失主要是蛋白質分解,肌肉結構松散,持水能力減弱[22-23],實驗組中由于thymol的存在,更大程度地抑制了微生物的繁殖,蛋白質分解也減少,從而減少了汁液流失。

a-汁液流失率;b-TVB-N值;c-菌落總數

2.3.2 冷鮮馬肉的TVB-N值變化

TVB-N是反映肉中蛋白質和胺類降解的重要生物標志物[8]。GB 2707—2016《食品安全國家標準 鮮(凍)畜、禽產品》明確規定了TVB-N的限值為15 mg/100 g。如圖5-b所示,3組樣品的TVB-N值均隨著貯藏時間的延長而逐漸升高。在貯藏期的第9天,空白組和對照組的TVB-N值已經超過了15 mg/100 g的限值,并且顯著高于此時的實驗組(P<0.05)。在第15天時,實驗組的TVB-N值為(17.75±0.27) mg/100 g,超出了限值。其原因可能是單向輸水抑菌墊中的抑菌物質百里香酚和單向輸水作用抑制了肉樣中微生物的繁殖,從而降低了TVB-N值。

2.3.3 冷鮮馬肉的菌落總數變化

菌落總數是反映冷鮮肉在貯藏期間品質變化的重要指標[24]。糧農組織建議所有肉類和肉制品的可接受微生物限量為7 lg CFU/g[25]。如圖5-c所示,是冷鮮馬肉在4 ℃的貯藏期內菌落總數變化。在貯藏期的0～6 d內,3組的菌落總數值從初始的(3.14±0.04) lg CFU/g緩慢上升,在第6天以后上升趨勢加快。在第12天時,空白組和對照組的菌落總數值都超過了7.0 lg CFU/g,實驗組的最低[(5.83±0.15) lg CFU/g]。從菌落總數值來看,空白組和對照組在第12天就超出了限值,而實驗組在第18天才超出限值。因此,可以得出這樣的結論,單向輸水抑菌墊可以在一定程度上延緩微生物繁殖,加入thymol的后達到雙重抑菌的效果。

3 結論

本研究通過靜電紡絲技術成功制備了單向輸水抑菌墊。掃描電鏡圖和傅里葉紅外光譜表明,纖維膜形態分布均勻,百里香酚也成功被包埋。由于百里香酚是強揮發性活性物質,所以通過纖維膜進行包埋,百里香酚在不同的食品模擬物中具有緩釋作用,尤其是在油脂類的食品模擬物中累積釋放率為40.43%,起到緩釋作用。通過體外抑菌實驗表明,單向輸水抑菌墊對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌都有明顯的抑制作用。將該墊用于貯藏冷鮮馬肉的保鮮中,在4 ℃下,可以將馬肉貨架期延長6 d。單向輸水抑菌墊不僅可以通過單向輸水作用控制汁液流失率,而且可以緩慢地釋放天然抑菌劑,達到良好的抑菌作用,從而延長冷鮮肉的貨架期,為冷鮮肉貯藏過程中易腐敗變質的問題提供了新思路。