廣葉繡球菌低分子質量多糖的液體發酵培養條件及提取工藝優化

劉朋肖,高蘇,梁瑞娜,安苗苗,趙國柱

(北京林業大學 生物科學與技術學院,林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京,100083)

繡球菌又名花椰菜菇、花茸,是一種名貴的食藥用菌,營養豐富,味道鮮美,廣葉繡球菌(Sparassislatifolia)隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、蘑菇綱(Agaricomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、繡球菌科(Sparassidaceae)、繡球菌屬(Sparassis)(Index Fungorum-Names Record),是我國及東亞地區主要的野生和栽培種[1],屬于中低溫型食用菌,在偏酸性條件下適宜生長,子實體生長發育階段對光照的需求高于其他食用菌,因此又有“陽光蘑菇”之稱[2]。多糖是繡球菌中重要的生物活性成分,以β-葡聚糖為主,占子實體干質量的40%,在食藥用菌中位于前列[3]。天然的β-葡聚糖主要有2種存在形式:β-(1→3)-葡聚糖和β-(1→6)-葡聚糖,前者具有廣泛的生物學活性。繡球菌富含β-(1→3)-葡聚糖,具有抗氧化性[4]、免疫調節[5]、抗腫瘤[6]、抗菌[7]等功效,開發利用價值極高。目前,廣葉繡球菌主要是以人工培育獲得子實體食用為目的,多糖的開發利用不足。人工培育子實體需要嚴格的、特定的條件如光照等,從接種到收獲子實體需要約120 d[8],生長周期長、成本高,因此,通過液體發酵培養繡球菌是高效獲取多糖的重要途徑。繡球菌子實體凍干品中提取的多糖分子質量高達400 kDa,具有溶解困難、黏度大等特點,不利于其提取及活性的發揮[9]。研究發現,多糖的分子質量差異受菌株、不同培養方式[10]、培養條件[11]及提取工藝[12]的影響。分子質量較低的繡球菌多糖具有更好的水溶性和生物活性,能夠暴露出更多的還原性末端,提高其抗氧化能力[13]。

繡球菌液體發酵獲取低分子質量多糖的研究不多,發酵菌絲體與多糖產量的動態變化規律尚不明確,提取工藝還不完善。本課題組前期通過復合篩選綜合評定初步獲得一產低分子質量多糖(25 641 Da)的廣葉繡球菌發酵菌株XQJ-1[14],為了增加多糖產量,更好的研究多糖結構與活性,本研究對其發酵條件,培養時間、培養基成分(碳源種類及含量、氮源種類及含量及培養基pH)進行優化,通過響應面法優化繡球菌胞內多糖的提取工藝(提取時間、提取次數、液料比、提取溫度),以提高繡球菌菌絲體干重,增加胞內多糖的產量和提取效率,為相關研究及繡球菌低分子質量多糖的深度開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

繡球菌XQJ-1,本實驗室篩選分離獲得,經ITS rDNA分子與形態鑒定為廣葉繡球菌[14]。

1.1.2 培養基

PDA固體培養基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,pH自然,121 ℃滅菌20 min;

種子液培養基(g/L):葡萄糖200,酵母粉6,KH2PO41,MgSO41,維生素B10.1,pH 4.0,121 ℃滅菌20 min;

基礎培養基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,蛋白胨5,KH2PO41,MgSO41,維生素B10.1,121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

752型紫外可見分光光度計,上海舜宇橫平科學儀器有限公司;SIGMA 1-14離心機,希格瑪貿易有限公司;DHG 9626A烘箱,上海精宏實驗設備有限公司;TG16A-WS離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;HZC-250全溫振蕩培養箱,蘇州培英實驗設備有限公司;SPX-250生化培養箱,上海龍躍儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 液體菌株的制備及初始培養

用接種針在繡球菌XQJ-1菌株斜面上挑取一小塊菌株接種到PDA平板培養基上,26 ℃避光培養8 d,待菌絲體鋪滿培養基,取1.0 cm2菌塊置于100 mL液體菌種培養基的250 mL三角瓶中,26 ℃、150 r/min培養6 d,獲得液體菌種;以10%(體積分數)的接種量將液體菌種接種于裝液量為100 mL/250 mL發酵培養基的三角瓶中,26 ℃、150 r/min培養20 d,獲得菌體發酵液。

1.3.2 繡球菌XQJ-1生物量測定

用無菌紗布過濾收集菌絲體,40 ℃烘干24 h至恒質量,用分析天平稱重,保留2位小數。將繡球菌XQJ-1菌絲體研磨成粉末備用。

1.3.3 胞內多糖測定

采用熱浸法提取胞內多糖,參照游雄等[15]的方法稍作改動。菌絲體粉末以10 mL/g的液料比,加入蒸餾水,95 ℃浸提2次后合并浸提液。浸提液濃縮至原體積的1/4后,加入4倍體積的無水乙醇,在4 ℃醇沉過夜后離心收集沉淀,冷凍干燥,得到粗多糖。配制1 mg/mL粗多糖溶液。采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線[16],吸取上述粗多糖溶液2 mL,加入1 mL 5%(體積分數)的苯酚混合,室溫靜置10 min后,加入濃硫酸5 mL,30 ℃水浴30 min,于紫外分光光度計490 nm處測定吸光度,根據標準曲線計算多糖含量。

1.3.4 培養天數對胞內多糖的影響

按上述1.3.1節的方法培養繡球菌XQJ-1,從第10天開始測定其胞內多糖及菌絲體生物量,共測量至第21天。

1.3.5 培養基成分對胞內多糖的影響

在1.1.2節基礎培養基的條件下,按上述1.3.1節的方法培養繡球菌XQJ-1,采用單因素-驗證的方法分別考察不同碳源及含量(10、15、20、25、30 g/L)、不同氮源及含量(2、5、8、11、14 g/L)及初始pH值(3、4、5、6)(表1),不同單因素對繡球菌XQJ-1液體發酵胞內多糖及菌絲體干重的影響,每組實驗設3個重復。

表1 繡球菌XQJ-1產胞內多糖的條件優化Table 1 Optimization of intracellular polysaccharide production conditions of Sparassis latifolia XQJ-1

1.3.6 響應面優化液體發酵繡球菌XQJ-1胞內多糖的提取方法

按1.3.2節方法獲得繡球菌XQJ-1菌絲體粉末,采用1.3.3節中的熱浸法對其菌絲體多糖進行提取,設置不同的提取次數、提取溫度及料液比,其他條件不變。

通過單因素試驗確定提取繡球菌XQJ-1胞內多糖的最優水平,采用Design-Expert 8.0.6軟件,以液料比、提取時間、提取溫度3個因素設計三因素三水平的響應面試驗,一共17組方案點,每組設置3個重復,試驗因素的水平如表2所示。

表2 Box-Behnken design 實驗因素水平Table 2 Box-Behnken design experimental factors and level

按1.3.3節的方法計算多糖含量,多糖得率的計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.7 數據分析

每組實驗3個重復,采用SPSS Statistics 17.0進行方差分析,Origin 9.1繪圖軟件處理實驗數據并繪制圖表,數據多重比較采用Tukey法。

2 結果與分析

2.1 培養時間對液體發酵繡球菌XQJ-1產胞內多糖的影響

繡球菌液體發酵21 d,定時取樣測定菌絲體干重及胞內多糖的含量。如圖1所示,繡球菌XQJ-1生長周期較長,前10 d為生長的遲滯期,大量合成細胞分裂所需要的酶類、ATP及其他細胞成分,菌體生長緩慢;第10～16天進入對數期,菌絲體生物量快速增加;17～18 d時為穩定期,此后由于養分消耗及代謝產物的積累,菌絲體生長停滯甚至出現自溶現象,菌絲體干重逐漸下降。隨著菌絲體生物量的變化,胞內多糖也表現先增長后降低的趨勢,在16 d達到最大值,隨著培養基營養物質的不足,胞內多糖的自我消耗增多,產量不斷下降。綜合菌絲體干重與胞內多糖的含量變化,第17天收集菌絲體干重最高,且胞內多糖與16 d相比并無顯著差異,故選擇第17天為液體培養繡球菌XQJ-1的最佳時間。

圖1 繡球菌XQJ-1液體培養過程中菌絲體干重與 胞內多糖變化情況

2.2 培養基成分對液體發酵繡球菌XQJ-1產胞內多糖的影響

2.2.1 碳源種類對繡球菌XQJ-1產胞內多糖的影響

分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源制作培養基,培養基的其他成分保持不變,26 ℃、150 r/min振蕩培養17 d。由圖2可知,當可溶性淀粉質量濃度為15～25 g/L時,繡球菌菌絲體干重顯著高于葡萄糖、蔗糖不同濃度組(P<0.05),因此可溶性淀粉較適合菌絲體的生長。當可溶性淀粉用量為15 g/L時,菌絲體多糖達最大產量為350.78 mg/L。綜合考慮多糖產量及成本,后續驗證實驗中選擇15 g/L的可溶性淀粉為培養基的碳源。

圖2 碳源種類及含量對繡球菌XQJ-1液體培養過程中 菌絲體干重與胞內多糖的影響

2.2.2 氮源種類對繡球菌XQJ-1產胞內多糖的影響

在基礎培養基中分別選擇蛋白胨、酵母粉、牛肉膏為氮源,其他成分保持不變,26 ℃、150 r/min振蕩培養17 d。由圖3可知,分別以5 g/L和8 g/L的牛肉膏為氮源時,繡球菌菌絲體多糖產量均較高且無顯著差異(P>0.05),而選用8 g/L的牛肉膏做氮源時,菌絲體生物量顯著高于其他組(P<0.05),因此將8 g/L的牛肉膏作為篩選的氮源。

圖3 氮源種類及含量對繡球菌XQJ-1液體培養過程中 菌絲體干重與胞內多糖的影響

2.2.3 初始pH對繡球菌XQJ-1產胞內多糖的影響

將培養基的pH值分別調至3、4、5、6,于26 ℃、150 r/min振蕩培養17 d。由圖4可知,隨著pH值的升高,菌絲體干重呈現先增大后減小的趨勢,在pH值為5時,有最大干重6.0 g/L,當pH值從3升至5時,菌絲體產量呈上升趨勢,但變化幅度不大;當pH值繼續增加時,菌絲體產量急劇下降,pH值為7時基本不生長,所以未做檢測。胞內多糖也呈現先增加再減少的變化趨勢,在初始pH值為5時,胞內多糖產量最高,達到432.65 mg/L,因此選擇初始pH值為5進行后續實驗。

圖4 不同初始pH值的培養基對繡球菌XQJ-1液體培養 過程中菌絲體干重與胞內多糖的影響

綜合以上單因素試驗結果,優化后的培養基組成(g/L)為:馬鈴薯200,可溶性淀粉15,牛肉膏8、KH2PO41,MgSO41,維生素B10.1,初始pH值為5。

2.2.4 液體培養繡球菌XQJ-1最適方法驗證

按照單因素優化的最適培養基組成,對繡球菌XQJ-1進行液體發酵培養,培養至第17天收集菌絲體,經檢測菌絲體干重為(6.03±0.25) g/L,胞內多糖為(433.25±37.46) mg/L,符合實驗預期,可以看出該方法重復性較好,可用于后續大批量發酵實驗,為繡球菌的產業化發酵培養提供了理論基礎。

2.3 響應面優化液體發酵繡球菌XQJ-1胞內多糖的提取方法

2.3.1 提取胞內多糖單因素試驗

提取次數:由圖5-a可知,隨著提取次數的增加,繡球菌菌絲體多糖的得率逐漸增加,但超過2次后得率并無顯著性增加(P>0.05),且浸提多次操作繁瑣,耗時較長,因此確定在后續實驗中浸提次數為2次。提取時間:由圖5-b可知,隨著浸提時間的增加,繡球菌菌絲體多糖的得率先上升再下降,說明提取時間過長或過短都不利于多糖的提取和釋放,提取時間為2.5 h時,多糖得率最大,因此確定2.5 h為最佳提取時間。液料比:由圖5-c可知,液料比(mL∶g)從10∶1上升到30∶1的過程中,繡球菌菌絲體多糖得率顯著上升,進一步提高液料比后則呈下降趨勢,因此確定30∶1為最佳液料比。提取溫度:由圖5-d可知,隨著提取溫度升高,多糖得率整體也呈現先上升再下降的趨勢,在85 ℃多糖得率最大,因此確定85 ℃為最佳提取溫度。

a-提取次數;b-提取時間;c-液料比;d-提取溫度

2.3.2 響應面法試驗設計及結果

在2.3.1節的單因素試驗結果的基礎上,采用Box-Behnken design中心組合試驗原理設計試驗,結果見表3。對標中的數據進行多元回歸擬合,得到多糖得率與各因素關系為:Y=8.81-0.45A+0.2B+0.75C-0.037AB+0.35AC-0.03BC-0.83A2-0.93B2-0.96C2。

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Response surface experimental design and results

由表4的方差分析結果可得:R2=0.980 2,說明所得回歸方程模型極顯著(P<0.01),并且模型的失擬項檢驗不顯著(F>0.05),說明該回歸方程能夠較好反應實際試驗情況,可以利用該模型對多糖提取的最佳條件進行預測分析。通過比較回歸系數,在一次項中,提取時間A與提取溫度C達到極顯著水平(P<0.01),液料比B達到顯著水平(P<0.05),得到各因素對繡球菌菌絲體多糖得率的順序為:提取溫度C>提取時間A>液料比B。在平方項中,A2、B2及C2的回歸系數均極顯著(P<0.01),說明提取時間A、液料比B及提取溫度C與繡球菌菌絲體多糖得率之間存在著明顯的二次關系。在交互項中,只有提取時間與提取溫度的交互項AC的回歸系數達到顯著水平(P<0.05),表明提取時間與提取溫度的交互作用對繡球菌菌絲體多糖得率有顯著影響。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

3D響應面圖(圖6)的擬合曲面為凸形,說明多糖存在最大得率,進一步對方程求解,得到的最優提取條件為:提取時間2.4 h,液料比為31.08∶1(mL∶g),溫度88.53 ℃,預測得率9.0%。為便于實際操作,將得到的最優條件進行校正,校正后的最優條件為:提取時間2.4 h,液料比31∶1(mL∶g),溫度89 ℃。采用校正后的條件進行重復驗證實驗,實際得率(8.82±0.15)%,與模型預測值偏差2%,說明模型具有良好的擬合性和重復性。

a、c、e為響應面3D圖:a-提取時間和液料比;c-提取時間和提取溫度;e-液料比和提取溫度; b、d、f為響應面等高線圖:b-提取時間和液料比;d-提取時間和提取溫度;f-液料比和提取溫度

3 討論

目前對液體發酵培養廣葉繡球菌及胞內低分子質量多糖的獲取研究還不充分,豐富液體發酵廣葉繡球菌方法,提高菌絲體干重、胞內多糖的產量和提取效率是非常必要的。本研究發現,廣葉繡球菌XQJ-1菌絲體干重與胞內多糖積累趨于同步動態變化,說明協同分析二者的產量和質量十分重要。研究發現繡球菌液體搖瓶發酵通常在15 d達到較高的菌體生物量[17],與本研究(17 d)相近。實驗顯示繡球菌對碳源利用范圍較為廣泛,可以較好的利用單糖、二糖和多糖等。以菌絲體干重和菌絲體多糖為指標,本研究篩選得到的最佳碳源是可溶性淀粉,與游雄等[15]的研究結果一致,說明繡球菌對于可溶性淀粉類大分子多糖有更好的利用能力。氮源篩選結果顯示,繡球菌對不同氮源的利用效率依次為牛肉膏、蛋白胨、酵母粉。但氮源需求可能因繡球菌來源菌種不同及培養條件差異而發生變化,根據目前已有的研究可以發現繡球菌更傾向于利用成分復雜有機氮源,其中的核苷酸、維生素礦物質元素等可有效促進繡球菌的生長[9-10]。pH會引起微生物細胞膜的通透性和培養基成分的離子狀態變化,進而影響胞外酶的活性及菌體生長,調控代謝通路,本研究發現繡球菌生長的最適pH值為5,與KUROSUMI等[18]優化得到繡球菌液體培養的最適條件為pH=5的結果一致,當pH值超過5,繡球菌菌絲體及胞內多糖產量急劇下降,pH值為7時甚至停止生長,說明偏酸性條件有利于菌絲體生物量及多糖的積累。研究表明pH=5時,多糖合成過程中關鍵酶磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase,PGM)和UDPG焦磷酸化酶(UDP-glucosepyro phosphosphprylase,UGPase)活性最高,有利于多糖的合成[19]。

天然多糖的提取方法包括順序提取、酸堿提取、酶輔助提取、超聲提取等方法,由于酸、堿會造成糖苷鍵的斷裂,而酶解處理又會引入其他蛋白,超聲波對多糖的降解程度高,通常這些方法得到的多糖為高分子質量多糖[20-23],本研究則通過熱水提醇提取多糖的方法對提取次數、提取時間、液料比、提取溫度的響應面工藝優化,發現提取次數為2時,能使多糖最大限度地溶解于熱水中,提高低分子質量多糖提取效率。廣葉繡球菌XQJ-1多糖提取率隨提取時間先增加后降低,ZHANG等[24]的結論中表明提取的時間越長產量越低。液料比對多糖的提取具有一定的影響,液料比的增加促進水向細胞內擴散,利于多糖的溶出,但過高的液料比會導致胞內的雜質易于溶出,不利于多糖提取。崔麗霞等[25]采用響應面法對繡球菌子實體多糖的提取方法進行了優化,在液料比為38.8∶1(mL∶g)的條件下沸水浴提取3 h多糖得率可達9.9%,與本研究的液料比為31∶1(mL∶g)相近。此外,影響多糖溶解度的因素還有提取溫度,隨著溫度的升高,分子運動加快,多糖溶解度上升,但溫度過高時,多糖結構易被破壞,造成多糖分解流失,影響其生物活性[26]。本研究通過Box-Behnken設計實驗進一步對繡球菌菌絲體多糖的提取方法進行優化,在單因素試驗過程中發現當溫度超過85 ℃、提取時間超過2.5 h后,菌絲體多糖的得率出現下降趨勢,表明溫度過高或提取時間過長可能會造成多糖的降解,從而造成得率的下降。在單因素優化中,液料比在30∶1(mL∶g)時有最大多糖得率,說明液料比過高或過低也不利于多糖的提取。在響應面實驗中,只有提取時間和提取溫度表現出了較好的交互作用,而液料比與其他因素的交互作用不明顯,擬合曲面均為凸形說明存在最大值。

目前,對廣葉繡球菌多糖的研究一般集中在高分子質量多糖組分上[6],然而由于其黏度高,水溶性差,結構構象復雜,很難通過屏障黏附到細胞表面受體或穿透細胞膜,導致其生物活性有限[27-28]。某些低分子質量多糖,特別是10～100 kDa的多糖,已被證明具有較強的生物活性,如抗氧化能力和抗腫瘤等[29-30]。DUAN等[4]從繡球菌發酵液、菌絲體、子實體中采用堿水提法和熱水浸提法提取6種低分子質量多糖,分子質量相似并集中在(30～50 kDa),具有顯著的抗氧化能力。此外,通過不同的解聚手段獲得的相對低分子質量廣葉繡球菌多糖表現出更高的抗氧化活性,尤其在還原力方面,由于低分子質量多糖暴露的還原性末端多,因而比高分子質量多糖的還原性強[10]。同時低分子質量多糖更容易黏附到細胞表面受體或者穿透細胞膜,從而表現出更顯著的活性,對研究多糖的藥理活性尤為重要。因此,在本研究中,通過對其培養條件及提取工藝進行優化,在最佳培養條件下,采用熱水浸提法獲得較高廣葉繡球菌XQJ-1菌絲體干重、胞內多糖含量及提取效率,并經過對多糖主要組分進行初步鑒定,獲得分子質量為25 641 Da的低分子質量多糖,并具有顯著的抗結腸癌的能力[14]。

4 結論

本研究對液體發酵的廣葉繡球菌的低分子質量多糖培養條件及提取工藝進行優化。單因素優化培養條件,驗證結果顯示:液體發酵培養基碳源為15 g/L可溶性淀粉,氮源為8 g/L牛肉膏,pH值為5,發酵17 d時,廣葉繡球菌XQJ-1的菌絲體干重為(6.03±0.25) g/L,胞內多糖達(433.25±37.46) mg/L,處于較高的優化水平;響應面法對XQJ-1胞內多糖的提取優化表明,提取次數2次,提取時間2.4 h,液料比31∶1(mL∶g),溫度89 ℃時,胞內多糖得率為(8.82±0.15)%,較優化前(6.24%)提高了41.3%,達到較高的提取效率。為廣葉繡球菌進一步開發利用提供參考。