響應面法優化超高壓處理赤霞珠葡萄及其對揮發性物質的影響

王學慶,張波*,楊培玉,張煜,張瀟方,陳建軍,張軍強,張竹林,杜建梅

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室, 甘肅省葡萄酒產業技術研發中心,甘肅 蘭州,730000)

2(甘肅張掖國風葡萄酒業有限責任公司,甘肅 張掖,734000)

香氣是構成水果風味的重要因素之一,作為一種標志性的指標,對判斷果實成熟及衡量其品質具有重要作用[1]。水果中的香氣物質包括醇類、酯類、羰基化合物、芳香族化合物、萜烯類化合物等[2],這些物質的種類和含量除與其品種、成熟度等內在因素有關外,還涉及環境、栽培等外部條件[3]。此外,由于香氣物質易在加工中發生損失,因此加工處理方式也是影響水果及其制品風味的重要因素。與傳統的熱力加工不同,非熱加工可以較大限度地保持水果原有的質量特性,因此近年來備受研究關注。其中超高壓技術作為一種新型的非熱加工技術,能夠在達到商業無菌要求的同時,保留食品原有的風味及品質,且對生態環境的破壞較小,因此是目前非熱加工技術中研究最多、產業化程度較高的一種加工方法[4]。

近年來,國內外許多學者已利用超高壓技術對果蔬的風味品質影響開展了多項研究。CHEN等[5]研究發現,超高壓在500 MPa下處理15 min可使獼猴桃汁保留原有的水果、新鮮、綠色等氣味。桑葚發酵飲料被不同超高壓壓力與時間處理后,400 MPa與處理15 min后酯類與醛類物質增多,酸類物質減少,可增強樣品的果香與甜香,使其口感更加柔和[6]。橙汁在不同的處理壓力和溫度下均可引起檸檬烯的降解,導致α-松油醇和香芹酮的濃度顯著增加,從而增加橙汁的特征風味[7]。并且對芒果汁的研究中發現,超高壓可增加己醇、芳樟醇、2-己烯醛、糠醛等物質的含量,使其青鮮香氣更加突出[8]。但是也有研究顯示,加壓500 MPa將會造成鮮榨橙汁更多的香氣喪失[9],且600 MPa/20 min處理后的獼猴桃汁中,醇類化合物的種類和數量均有所減少[10]。因此,要獲取較好的超高壓處理效果,除要考慮處理樣品的種類與組織狀態等條件外,還需考慮處理條件的因素與水平組合[11]。

赤霞珠作為常見的歐亞種釀酒葡萄,具有良好的品質特性和田間表現,是河西走廊地區種植面積最大的品種之一。盡管目前對赤霞珠風味質量的研究,特別是香氣品質的文獻已有大量報道,但有關超高壓處理對其香氣的研究目前還很有限。為此,本試驗以赤霞珠葡萄為原料,利用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術,以及單因素與響應面優化試驗,研究超高壓處理壓力、時間、溫度對赤霞珠葡萄揮發性物質種類與含量的影響,旨在為超高壓技術在葡萄與葡萄酒釀造過程中的應用提供一定的理論支撐和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄果實(可溶性固形物23.3°Brix,pH 3.49)于成熟期采自甘肅張掖國風葡萄酒業有限公司產區。

NaCl(分析純)、2-辛醇、4-羥基-4-甲基-2-戊酮、3-羥基己酸乙酯、C9～C20烷烴標樣,Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

超高壓處理設備,天津市華泰森淼生物工程技術有限公司;Hero電動研磨攪拌機,北京瑰夏傳奇貿易有限公司;DZ500/2D抽真空包裝機,瑞安市瑞寶包裝機械制造有限公司;電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司;TRACE 1310氣相色譜-質譜聯用儀、ISQ型單四級桿質譜儀,美國Thermo Scientific公司;色譜柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent Technologies公司;固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,美國Surpelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

選擇無病蟲害的樣品,剪粒去除果梗后,隨機挑選100 g裝于真空包裝袋中密封后進行超高壓處理,并將處理后的果實液氮速凍,-80 ℃保存。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 超高壓處理壓力的影響

根據實驗設備的壓力范圍,設定不同的壓力梯度為100、200、300、400、500 MPa,在溫度為25 ℃下處理25 min,以赤霞珠葡萄中揮發性物質種類與含量的綜合評分為指標,研究超高壓處理壓力對揮發性物質的影響。

1.3.2.2 超高壓處理時間的影響

在超高壓處理壓力為300 MPa,處理溫度為25 ℃時,選擇不同的時間梯度為5、15、25、35、45 min,以赤霞珠葡萄中揮發性物質種類與含量的綜合評分為指標,研究超高壓處理時間對揮發性物質的影響。

1.3.2.3 超高壓處理溫度的影響

在超高壓處理壓力為300 MPa,處理時間為25 min時,選擇不同的溫度梯度為5、15、25、35、45 ℃,以赤霞珠葡萄中揮發性物質種類與含量的綜合評分為指標,研究超高壓處理溫度對揮發性物質的影響。

綜合評分計算參照吳娟弟等[12]的方法進行,其中設定綜合評分分值為100分(揮發性物質種類占50分,揮發性物質的總量占50分),種類得分和含量得分的計算如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:X為篩選的52種揮發性物質,Xi為各處理樣品中滿足選定范圍(篩選的52種揮發性物質)內的揮發性物質個數;Y為各處理因素下樣品中最高的揮發性物質含量,Yi為各處理因素下樣品的揮發性物質含量。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上,運用Box-Behnken試驗設計原理,選取超高壓處理壓力(A)、處理時間(B)、處理溫度(C)3個因素,以揮發性物質種類與含量的綜合評分為響應值,應用Design-Expert 13.0軟件進行3因素3水平響應面優化試驗,試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.4 揮發性物質測定

參照張克坤等[13]的方法并進行修改。取液氮保存的果實樣品去除果梗果籽,用研磨機粉碎成勻漿后取5.0 mL樣品置于20 mL頂空瓶中,分別加入10 μL的內標4-羥基-4-甲基-2-戊酮、3-羥基己酸乙酯、2-辛醇和1.0 g NaCl,加轉子密封后于磁力攪拌器上,40 ℃下水浴平衡30 min后頂空萃取30 min進行GC-MS分析,每個樣品進行3次分析。

氣質條件為DB-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度250 ℃;升溫程序:初溫50 ℃保持5 min,以6 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;載氣:高純He;流速1.0 mL/min;不分流進樣。質譜分析:電子電離源;電子能量70 eV;傳輸線溫度230 ℃;離子源溫度250 ℃;質量掃描范圍50～450m/z。

香氣化合物的定性分析采用質譜全離子掃描圖譜,根據化合物的保留指數(retention index, RI)、NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索對比進行定性分析。定量分析采用半定量進行分析,其中醛類與酮類物質以4-羥基-4-甲基-2-戊酮進行定量;酯類物質以3-羥基己酸乙酯進行定量;醇類、萜烯類與其他類物質以2-辛醇進行定量。

1.3.5 特征香氣及香氣輪廓分析

通過氣味活性值(odor activity value, OAV)來判斷不同香氣揮發性物質對赤霞珠葡萄的貢獻。香氣根據葡萄酒香氣輪盤進行分類[14],并結合本試驗中香氣物質的氣味描述,將香氣分為六類:草本香;果香;花香;脂肪味;化學香;焙烤香。每種香氣類別中特征香氣化合物的OAV相加,來構建赤霞珠葡萄果實的香氣輪廓。

1.4 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計,運用Design Expert 13.0進行響應面試驗設計與分析,并應用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析,Origin 2018軟件進行繪圖,每組試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 處理壓力對揮發性物質的影響

如圖1-a所示,各樣品揮發性物質的綜合評分隨著壓力的增加呈現上升變化,并在加壓400 MPa時達到峰值(61.29分),隨后壓力升高至500 MPa時,揮發性化合物的綜合評分有所降低(較400 MPa處理降低44.09%)。比較各處理下香氣物質的種類和含量數據發現,其中揮發性物質的種類未發生顯著變化,而含量則變化明顯(566.96～1 374.38 μg/L,P<0.05)。經不同壓力處理后,果實中醇類物質,如反-2-己烯醇、順-3-己烯醇含量有明顯的下降,類似的結果在王亞超等[15]的研究中也有報道,這可能是由于壓力的升高會引起處理體系的體積變化,從而使物質內部的化學鍵發生改變,促進了揮發性物質發生化學反應的速率,最終導致揮發性物質含量變化;但當壓力上升到一定程度時,又會發生相反的效果[16]。因此,初步確定400 MPa為較適的處理壓力。

a-處理壓力;b-處理時間;c-處理溫度

2.1.2 處理時間對揮發性物質的影響

適當的延長超高壓處理時間也有助于赤霞珠葡萄中揮發性物質的釋放(圖1-b),本試驗中當處理時間達到25 min時,揮發性物質的綜合評分達到最高(74.64分),此后隨著處理時間的延長,得分逐漸降低至58.70分,這主要是由于揮發性物質含量的變化所造成的(由對照的990.52 μg/L上升至25 min處理下的1 402.73 μg/L,增加了41.62%)。其中醛類與芳香族類物質分別較對照增加22.38%和90.04%(醛類,對照869.24 μg/Lvs處理1 063.78 μg/L;芳香族類,對照4.67 μg/Lvs處理8.89 μg/L),這一結果與張峻松等[8]在超高壓處理芒果汁中的研究相似。一般來說醛類物質和芳香族化合物可在酶促作用下形成[17],而超高壓處理可使酶分子中的化學構象發生改變,并隨著處理時間的延長,對酶的活性產生變化,進而影響揮發性物質的合成釋放,造成香氣種類與含量的改變[18]。因此,初步確定25 min為較適的處理時間。

2.1.3 處理溫度對揮發性物質的影響

與壓力和時間因素相似,處理溫度的升高也出現先升高后降低的“峰形”變化(圖1-c)。當溫度達到35 ℃時,揮發性物質的綜合評分最高(75.46分),分別是25 ℃和45 ℃處理的1.05與1.20倍。這其中35 ℃處理時揮發性物質的個數從未處理時的25種增加至28種,含量較對照提高了20.13%。特別是酯類物質中己酸乙酯、順-3-己烯乙酸酯含量上升較為明顯,分別高于對照59.46%和32.00%,分析其原因可能是由于溫度的升高會增加分子的運動速率,從而加速酯化反應的進行[19],并且超高壓還會對合成酯類物質的酶產生激活或者鈍化作用[20],導致樣品中部分酯類物質變化。因此,初步確定35 ℃為較適的處理溫度。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面優化試驗結果

在單因素試驗的基礎上,利用初步確定的超高壓處理壓力(A)、處理時間(B)、處理溫度(C)的較優水平,以揮發性物質種類與含量的綜合評分為響應值進行Box-Behnken響應面優化試驗,試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 The results of response surface tests

利用Design Expert 13.0對表2中的結果進行多元線性回歸擬合分析,確立回歸方程模型為:

Y=-260+0.591A+7.272B+7.780C-0.000 4AB-0.001 8AC-0.000 36BC-0.000 68A2-0.145 6B2-0.106 2C2

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests

2.2.2 響應面各因素交互作用分析

圖2為處理壓力(A)、處理時間(B)、處理溫度(C)3因素間的響應面交互作用圖。圖中響應面的等高線越趨向于橢圓形,或曲面的斜率越陡,表明各因素間的交互作用對響應值的影響越大,交互作用就越顯著,反之則交互作用較弱[21]。由圖2-b可知,當處理壓力與處理溫度不斷增加時,揮發性物質的綜合評分呈現先上升后下降的趨勢,圖中的響應曲面斜率最陡峭,等高線呈橢圓形,表明處理壓力與處理溫度的交互作用顯著,與表3中的分析結果一致;而圖2-a與2-c中的響應曲面較為平滑,表明處理時間與處理壓力和處理溫度間的交互作用較弱,對揮發性物質的影響較小。

圖2 各因素交互作用對揮發性物質評分的影響

2.2.3 響應面優化及驗證試驗

通過Design Expert 13.0對模型的優化,得到超高壓處理工藝的最佳工藝條件為:處理壓力385.56 MPa、處理時間24.38 min、處理溫度為33.38 ℃,預測此時的綜合評分為72.48分。為了驗證該模型的準確性,結合實際操作情況,將處理工藝修改為處理壓力386 MPa、處理時間24 min、處理溫度為33 ℃。在此條件下進行3組驗證試驗,所得揮發性化合物的綜合評分為71.79分,與預測值接近(P>0.05),表明該模型優化得到的工藝條件可靠,具有可行性。

2.3 赤霞珠葡萄揮發性物質的測定

2.3.1 超高壓處理對葡萄果實揮發性物質的影響

利用響應面優化后的結果對赤霞珠葡萄揮發性物質進行分析測定,結果如表4所示,在未處理的葡萄樣品中共檢測到38種揮發性物質,主要包括醇類物質9種,酯類物質3種,醛類物質13種,酮類物質5種,酸類1種,萜烯類4種和其他類物質3種;經超高壓處理后香氣物質的種類增加至43種,比較得知,主要是由于處理后額外出現的酯類(癸酸乙酯、己酸異戊酯)和萜烯類(香茅醇、香葉醇、香葉基丙酮)所造成的,由此推測超高壓處理所生成的香氣物質將為赤霞珠果實提供更多水果香與花香。

表4 不同處理下赤霞珠葡萄揮發性物質含量Table 4 Different treat on volatile compounds in ‘Cabernet Sauvignon’

超高壓處理還導致香氣物質的含量發生了顯著變化,與對照相比,香氣物質的總量由1 239.17 μg/L增加至1 964.85 μg/L,其中醇類、酯類、醛類、酸類、萜烯類和其他類物質的含量均顯著增加。在所檢測到的物質中,具有青香與綠葉香氣的反-2-己烯醛(青香、蘋果氣味)、正己醛(果香、青草香)、反-2-己烯醇(綠葉香、果香)、正己醇(草本香、花香)和順-3-己烯醇(青草香)等C6化合物的含量在超高壓處理后顯著增加,較對照提高近1.70～4.20倍,推測這將為葡萄果實帶來較為濃郁的香氣特征。與之相反的是,超高壓處理也會降低辛酸乙酯(花香、水果香)、(反,反)-2,4-己二烯醛(水果香、青香)、4-甲基-3-戊烯-2-酮(花香)和苯乙烯(芳香)等的含量,但由于這些物質的氣味強度較低,因此推測超高壓處理對這些香氣物質所產生的氣味影響會相對較弱。

2.3.2 超高壓處理對葡萄果實特征香氣物質的影響

為了進一步比較優化后的超高壓處理條件對赤霞珠葡萄主要揮發性成分的影響,對試驗中所檢測到的19種OAV>0.1的香氣物質(表4)進行主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA),結果如圖3所示。由圖3-a、圖3-b可知,PC1的貢獻率為82.17%,PC2的貢獻率為8.44%,累積貢獻率為90.61%,適用于降維分析標準。其中2個樣品在PC1與PC2上有明顯的區分,超高壓處理組在PC1正半軸與PC2正半軸上得分較高,主要反映了大部分具有草本香、水果香和花香的醇類、醛類、酮類和萜烯類等物質的信息,并與(反,順)-2,6-壬二烯醛(C13)、正己醛(C1)、反-2-己烯醛(C4)、反-2-壬烯醛(C12)、順-3-己烯醇(A2)、反-2-己烯醇(A3)、正己醇(A1)、正己酸(E1)、β-紫羅蘭酮(F3)等C6、C9化合物具有較高正相關性,這表明超高壓處理可顯著提升赤霞珠葡萄果實的青香、果香與花香等氣味。而對照樣品則在PC1負半軸與PC2正半軸得分較高,主要反映了己酸乙酯(B1)與(反,反)-2,4-己二烯醛(C8)2種具有水果香氣的化合物信息。

a,b-葡萄果實揮發性物質的主成分分析;c-偏最小二乘判別分析;d-香氣輪廓分析

圖3-c為PLS-DA結果,從圖3-c可知,反,順-2,6-壬二烯醛、正己醛、反-2-己烯醛3種物質的VIP>1,是影響超高壓處理前后揮發性物質構成的主要因素,同時上述3種化合物的OAV在檢測到的主要揮發性物質中相對較高。綜上,超高壓處理前后對葡萄果實的揮發性物質存在差異,表明超高壓處理對揮發性物質的影響較大,這與前文的結果一致。

通過進一步的香氣輪廓分析發現(圖3-d),2種處理下葡萄果實的香氣輪廓相似,主要由草本香、果香與花香構成,其中草本香的氣味強度最高,其次是花果香、脂肪味和化學香,而焙烤香相對較低。相比于對照而言,超高壓處理后的葡萄果實各香氣類型均顯著增加,草本香、果香與花香增加較為明顯,且無異味產生,這主要與處理后C6醇/醛、反,順-2,6-壬二烯醛、β-紫羅蘭酮等化合物含量的增加有關,因此認為超高壓處理可賦予葡萄果實豐富的青香、水果香、花香等氣味表現,并推測這將為其釀造產品葡萄酒的香氣特征產生影響。

3 討論

超高壓作為一種非熱加工技術,可以相對完整地保留果蔬及其制品的品質。本試驗研究了超高壓在不同壓力、時間與溫度處理下對赤霞珠葡萄果實揮發性物質的影響,結果表明,超高壓處理可顯著影響赤霞珠葡萄果實揮發性物質的含量(P<0.05),適當的處理條件對保留和提升處理樣品的香氣具有重要的作用。對比本試驗結果可知,揮發性化合物的變化受溫度的影響較大,其次是處理壓力,而受時間因素的影響較小。分析認為,超高壓處理引起揮發性物質的變化可能有以下兩個原因,一方面超高壓會影響部分香氣合成途徑中酶的活性,造成樣品中揮發性物質的變化;另一方面超高壓會促進樣品中氧化還原反應的進行,從而使部分化合物氧化分解。ZHANG等[22]在超高壓處理芒果汁的研究中發現,超高壓增加了醇脫氫酶的活性,從而影響了醇類物質的轉化與代謝,導致其含量減少,這一變化與本試驗結果類似。同時壓力的升高還會引起赤霞珠葡萄果實中己醛、順-3-己烯醛、反-2-己烯醛等C6醛類化合物含量的顯著增加,推測這可能也與酶(脂氧合酶、氫過氧化物裂解酶)活性變化有關[23],因此有助于增強處理樣品中草本與果香風味。而在不同時間處理條件下(15～25 min),樣品中酯類化合物的種類與含量減少,芳香族化合物含量增加,這些改變可能還是受到超高壓處理對酶(糖苷酶、?；D移酶)的作用[24]。另外,本研究團隊在前期的試驗中發現,適當增加超高壓處理溫度會提高樣品中醇類和酸類物質的活性,引起樣品體系的熵變,促進化學反應向生成酯的方向發展[25],推測這可能是造成本試驗中己酸乙酯、順-3-己烯乙酸酯含量提高,以及癸酸乙酯、己酸異戊酯在處理后產生的原因之一。

利用響應面優化后的結果處理赤霞珠葡萄,并對其特征香氣成分進行分析,結果表明超高壓處理主要與樣品中C6醛、C6醇、(反,順)-2,6-壬二烯醛與β-紫羅蘭酮等物質具有較高的相關性,推測這可提升樣品中青香、水果、花香等氣味,與香氣輪廓分析的結果一致。相似的結果在對杏汁的研究中也有報道,表明超高壓處理可顯著增加處理樣品中己醇、順-3-己烯醇、己醛、反-2-己烯醛等物質的含量,并在保持原有香味的基礎上,超高壓可使其青鮮香氣更加突出,香韻也更為豐富[26]。不過本試驗只分析了超高壓處理對葡萄果實揮發性物質的影響,對其在葡萄酒產品中的作用還未研究,因此計劃下一步將開展相關的釀造試驗,研究超高壓處理在實際應用中的表現,以期為超高壓技術在葡萄酒生產中的應用與推廣提供一定的技術參考。

4 結論

為了研究超高壓處理對赤霞珠葡萄果實揮發性物質的影響,本試驗利用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術,通過單因素與響應面試驗對超高壓處理條件進行優化,并在此基礎上結合主成分分析與香氣輪廓描述對其特征香氣進行分析。結果表明:超高壓處理的最優工藝條件為處理壓力386 MPa、處理時間24 min、處理溫度為33 ℃;利用優化后的結果處理赤霞珠葡萄發現,經超高壓處理的果實香氣物質總量與種類均顯著增加,其中醇類、醛類、酯類和萜烯類化合物是造成2種樣品明顯差異的主要物質;結合PCA和PLS-DA分析表明,處理樣品與正己醛、反-2-己烯醛、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、正己醇和反,順-2,6-壬二烯醛等具有草本、花果香的物質有較高相關性,與對照樣品存在明顯的區分;進一步利用香氣輪廓描述發現,超高壓處理后可顯著增強赤霞珠葡萄的草本香、果香與花香等氣味,推測將有助于提高處理果實的品質特性與釀造潛能。