食用玫瑰多酚提取物的穩定性及抗氧化能力評價

岳華嶺,廖紅梅

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

玫瑰是薔薇科薔薇屬多種花卉的通稱,是最重要的商業花卉之一。其中,食用玫瑰以花器官為可食部分,是可用于加工或食用玫瑰的統稱[1]。在世界范圍內,食用玫瑰被廣泛種植,主要分布在亞洲、中東、北美和歐洲等;國內總種植面積達800 hm2,主要分布在山東、甘肅、新疆、貴州、云南等地,食用品種包括平陰玫瑰、苦水玫瑰、滇紅玫瑰和墨紅玫瑰等[2]。食用玫瑰具有亮麗的顏色和濃郁的香氣,常用于制作鮮花餅、果醬、花茶、蛋糕、酸奶、糖果以及風味物質提取[1]。

食用玫瑰花瓣含有豐富的營養成分,主要成分為碳水化合物(60%～86%,以干重計),其次是蛋白質(2.5%～12.2%)和脂肪(<4%)。此外,其中還含有微量元素和類黃酮、類胡蘿卜素、酚酸及花色苷等功能成分[1]。這些活性成分賦予食用玫瑰抗氧化、抗菌、抗炎和抗衰老等特性。BAYDAR等[3]研究發現50 μg/mL的新鮮大馬士革玫瑰甲醇提取物對DPPH自由基的清除率為(77.02±0.09)%,高于丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)和二丁基羥基甲苯。BELAL等[4]的研究表明科爾德斯月季的甲醇提取物清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的IC50分別為21.93 μg/mL和10.38 μg/mL。由此可見,食用玫瑰具有較強的自由基清除能力。墨紅玫瑰是云南省的主要食用玫瑰品種,由德國的KORDES于1935年用香水月季和長春月季雜交選育而成[5]。目前關于墨紅玫瑰抗氧化性的研究較少,多酚類物質是植物中含量最豐富的次級代謝產物,具有良好的抗氧化性能,常作為天然抗氧化劑而得到廣泛應用[6]。因此,本研究以墨紅玫瑰為原料,分析玫瑰多酚提取物(rose polyphenols extraction,RPE)的穩定性及抗氧化性,為食用玫瑰相關產品開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

墨紅玫瑰(RosachinensisJacq ‘Crimson Glory’ H.T.)采自云南省紅河哈尼族彝族自治州;HCl(AR)、甲醇(HPLC級)、乙醇(AR)、維生素C(99%)、沒食子酸(gallic acid,GA,98%)、氯化鐵(AR)、硫酸亞鐵(AR)、菲啰嗪(98%)、EDTA(AR)、2,4,6-三吡啶基三嗪(98%),國藥集團有限公司;AB-8大孔樹脂、DPPH(96%)、ABTS(98%)、茶多酚(tea polyphenols,TP,97%)、α-生育酚(維生素E,97%)、特丁基對苯二酚(tert-butyl hydroquinone,TBHQ,98%)、BHA(98%)、硫酸銅,麥克林試劑有限公司;槲皮素、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、楊梅素、鞣花酸(標準品,純度均≥98%),北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV mini-124紫外分光光度計,日本島津公司;Ultrospec 7000紫外分光光度計,英國柏楉有限公司;TANKPE 060 Milli-Q超純水產生裝置,法國密理博公司;RV8旋轉蒸發儀,德國艾卡公司;DC801真空冷凍干燥機,大和科學株式會社;SQP型電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司;Sorvall LYNX 4000冷凍離心機, 德國賽默飛世爾科技公司;MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用儀,美國沃特世公司;HL-2S恒流泵,上海滬西分析儀器廠有限公司;DELTA 320 pH計,瑞士梅特勒-托利多公司;SY-1220恒溫水浴槽,美國精騏有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多酚提取純化

參考ZHANG等[7]的方法并稍作修改,以30%甲醇溶液[含0.5%(體積分數)HCl]在0 ℃下萃取24 h后過濾,以5 000 r/min離心20 min。將提取液過AB-8大孔樹脂柱,上樣流速為1.0 mL/min,以70%(體積分數)乙醇洗脫,洗脫流速為1.0 mL/min[8]。將洗脫后的提取液濃縮,并冷凍干燥成粉末狀待用。

1.3.2 RPE的組成分析

根據朱文嫻[9]的方法測定總酚含量。取1 mL提取液,加入1 mL福林酚試劑,靜置5 min后,加入3 mL 75 g/L Na2CO3溶液和5 mL去離子水,在30 ℃條件下恒溫反應1 h,冷卻至室溫后于765 nm處測定吸光值。標準曲線繪制:配制濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L沒食子酸標準溶液,采用上述方法進行測定并繪制標準曲線。

根據嚴勇強等[10]采用蒽酮-硫酸比色法測定總糖含量。取1 mL提取液,加入4 mL蒽酮試劑(0.2 g蒽酮溶于100 mL濃H2SO4),混勻后置于沸水浴中加熱10 min,冷卻至室溫于610 nm 波長處測定吸光度。標準曲線:以5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標準溶液建立標準曲線。

采用考馬斯亮藍法檢測蛋白質含量。取10 μL樣品于96孔板中,加入300 μL G250染色液,用酶標儀測定其在595 nm處的吸光度。標準曲線繪制:配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL蛋白標準溶液,使用與樣品相同的方法進行標準曲線的制作。

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》,采用灼燒法測定總灰分含量。將坩堝置于馬弗爐中,在550 ℃下灼燒至恒重,稱取2～3 g樣品于恒重的坩堝中,繼續灼燒至恒重。

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》,采用直接干燥法測定水分含量。將稱量瓶置于101～105 ℃干燥箱中加熱至恒重。稱取2～10 g試樣放入稱量瓶中,繼續加熱至恒重。

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》,采用酸水解法測定脂肪含量。稱取2～5 g樣品,加入8 mL水,混勻后加10 mL HCl,于70～80 ℃水浴中至試樣消化完全。再加入10 mL乙醇。冷卻后將混合物移入具塞量筒中,以30 mL無水乙醚分次萃取合并于接收瓶,旋轉蒸發回收無水乙醚,最后于(100±5) ℃干燥至恒重,測定脂肪含量。

1.3.3 RPE的多酚成分分析

采用LC-MS分析RPE的酚類組成,方法如下[9]:配制0.1 mg/mL RPE溶液,在 4 ℃下8 000 r/min離心15 min,收集上清液,過0.22 μm濾膜,用于測試。檢測條件為:BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);DAD檢測器,檢測波長為280 nm;進樣量2 μL;流動相A:0.1%甲酸水溶液,流動相B:乙腈;流速0.3 mL/min;柱溫45 ℃;梯度洗脫,洗脫時間10 min。MS條件參數為:ESI+離子掃描,m/z:20～1 000;脫溶劑溫度:400 ℃,脫溶劑氣體流量為700 L/h;碰撞能量25 eV,錐電壓30 V,霧化器壓力50 psi,毛細管電壓3.5 kV。

1.3.4 RPE的溫度、pH穩定性

配制20 mg/L的RPE溶液,用0.1 mol/L HCl和NaOH 溶液調節其pH值為1.0～12.0,30 min后拍照記錄RPE溶液的顏色變化,并用紫外可見分光光度計在波長450～700 nm掃描。

參考段云劍[11]的方法,配制質量濃度為20 mg/L的RPE溶液,分放置于20、40、60、80、100 ℃的水浴鍋中,在0、1、2、4、6 h時測定其含量,并按公式(1)計算保留率,降解速率與濃度的一階相關關系式如公式(2)所示:

(1)

式中:Cx,x小時后樣品的含量,C0,樣品的初始含量。

lnC=-Kt+lnC0

(2)

式中:K,降解速率常數,h-1;t,時間,h;C0為樣品原質量濃度,mg/mL;C為經過t時間后的樣品質量濃度,mg/mL。

1.3.5 RPE對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除作用

參考段云劍[11]的方法并稍作修改,分別配制0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/mL的RPE溶液及對照樣品溶液,DPPH自由基清除能力測定:配制0.14 mmol/L的DPPH乙醇溶液,在試管中分別加入100 μL樣品和4 mL DPPH溶液,振蕩混勻后40 ℃下避光反應30 min后于517 nm下測定吸光度值。ABTS陽離子自由基清除能力測定:將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液按照1∶1體積比混合,避光反應16～24 h,得到ABTS陽離子工作液,使用前以無水乙醇進行稀釋,使其在734 nm處的吸光度值為0.7±0.02。在試管中分別加入0.1 mL樣品與3.9 mL ABTS陽離子工作液,置于暗處反應7 min后于734 nm下測定吸光度值。以去離子水作為空白,按公式(3)計算自由基清除率:

(3)

式中:A1,樣品的吸光度值;A0,空白的吸光度值。

1.3.6 RPE對鐵離子的還原能力

參考JING等[12]的方法并稍作修改,將300 mmol/L醋酸鈉溶液(pH為3.6)、10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L的FeCl3溶液,按照體積比10∶1∶1混合制成FRAP工作液。標準曲線的制作:配制濃度為100、200、400、800、1 600 μmol/L的FeSO4標準溶液,分別加入3 mL FRAP工作液、100 μL FeSO4溶液與2 mL去離子水,在37 ℃下孵育30 min后于593 nm下測定吸光度值。樣品的Fe3+還原能力檢測步驟同標準曲線測定,樣品的鐵離子還原能力以達到同樣吸光度值所需的Fe2+的微摩爾數表示。

1.3.7 RPE對亞鐵離子和銅離子的螯合作用

參考WANG等[13]的方法并稍作修改,對Fe2+的螯合能力分析:分別配制0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/mL的RPE溶液,2 mmol/L的FeSO4溶液和5 mmol/L的菲啰嗪溶液;在試管中分別加入4.7 mL樣品和0.1 mL FeSO4溶液,混合后靜置30 s, 加入0.2 mL菲啰嗪溶液,反應10 min后于562 nm下測定吸光值。對Cu2+的螯合能力分析:分別配制2 mmol/L的CuSO4溶液、10%(體積分數)吡啶溶液和10%(質量分數)鄰苯二酚紫溶液;在試管中分別加入1 mL CuSO4溶液、1 mL吡啶溶液、20 μL鄰苯二酚紫和1 mL 樣品,反應10 min后于562 nm下測定吸光度值。按照公式(4)計算螯合率:

(4)

式中:Ax,樣品的吸光度值,A0,空白的吸光度值。

1.4 數據統計及分析

所有測試均重復3次,所有數據均以平均值±標準差表示,采用SPSS 24軟件進行數據分析,在P<0.05為顯著性水平進行單因素ANOVA分析,采用MassLynx 4.1軟件進行LC-MS結果分析,采用Origin 2019軟件繪制圖。

2 結果與分析

2.1 RPE組成分析與多酚成分鑒定

經測定,提取液中玫瑰多酚含量為(3.70±0.03) mg/mL,提取量為(117.71±0.82) mg/g。ZHANG等[14]將10 g玫瑰粉與200 mL水混合,在50 ℃下通過80 W超聲提取30 min,多酚提取量為110.9 mg/g。王曉藝等[15]以含水量為30%的氯化膽堿-乳酸(物質的量之比1∶2)為溶劑提取重瓣玫瑰中的多酚,料液比1∶40(g∶mL)、超聲時間10 min、超聲功率400 W,超聲溫度50 ℃、提取2次,提取量為(136.20±1.23) mg/g,高于本研究中的提取量,這是由于玫瑰品種以及提取方法不同。綜上可以發現,多酚的提取量與其含量、提取方法(有機溶劑提取法、超聲輔助提取、微波輔助提取、超臨界二氧化碳萃取等)以及提取條件(溶劑、溫度、pH、時間、料液比等)有關。經過大孔樹脂柱后,RPE中糖、蛋白質和脂肪等物質被洗脫,其濃度均顯著降低(P<0.05);而總酚含量達到(9.82±0.34) mg/mL(表1),顯著提高(P<0.05)。將提純后的RPE溶液冷凍干燥得到凍干粉,其成分為多酚[(85.43±1.80)%]、水分[(8.25±0.24)%]、糖類[(1.75±0.22)%]、蛋白質[(2.06±0.54)%]和灰分[(1.88±0.09)%]。提取液含有中的脂肪則未檢出,原因可能是其含量較低,低于所用方法的檢測限。

表1 RPE純化前后成分比較 單位:mg/mLTable 1 Composition comparison of phenol extracts before and after purification

進一步經LC-MS分析(圖1、圖2),結合前人研究結果[16]對比分析,可知RPE中的酚類物質含量由高到低為:矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷>鞣花酸>槲皮素>沒食子兒茶素>Bis-六羥基二苯?；?葡萄糖苷>山奈酚>兒茶素>楊梅素(表2)。相似研究分析出平陰玫瑰中含有沒食子酸、原兒茶酸、山奈酚、草質素-8-甲醚、異槲皮苷、紫云英苷6種成分[20]。此外,劉紅燕[21]從平陰玫瑰中鑒定出沒食子酸、咖啡酸、木犀草素、槲皮素、喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-4′-O-β-D-葡萄糖苷、刺槐苷等7種組分。在本研究中,8種多酚含量低于RPE中總酚含量,一方面在于福林酚法測定的總酚含量是以沒食子酸當量來表征,與實際多酚種類存在差異[18];另一方面,部分多酚結構待鑒定。

圖1 RPE的液相色譜圖

A-矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷;B-兒茶素;C-Bis-六羥基二苯?；?葡萄糖苷;D-沒食子兒茶素;E-槲皮素;F-楊梅素;G-鞣花酸;H-山奈酚

表2 RPE中酚類成分含量Table 2 Comparison of phenolic components in RPE

2.2 RPE的穩定性評價

2.2.1 熱穩定性

多酚尤其是花色苷的穩定性會受溫度影響,較高溫度下其保留率降低(圖3-A)。在20 ℃下,RPE較穩定,其在6 h后的保留率為(98.20±0.07)%;隨著溫度升高至60 ℃,其保留率逐漸下降,6 h后保留率為(80.37±0.07)%;當溫度升高至80～100 ℃,降解更快;其中100 ℃下經2 h后保留率僅為(24.93±0.20)%。在各個溫度的熱處理過程中,RPE的保留率在0～1 h下降最快,在1～6 h保留率下降速度變緩,并且隨著溫度升高,K值逐漸升高,溫度越高花色苷的降解速率越快,表明其在1～6 h內的降解過程符合一級動力學反應(圖3-B)。矯馨瑤[22]的研究表明藍莓多酚提取物的熱降解也符合一級動力學模型。VOSS等[23]對錦葵素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷進行熱處理,發現90 ℃處理0.5 h后出現降解產物,并且每種花色苷都產成了間苯三酚醛和酚酸類化合物等降解產物。綜上所述,由于花色苷等酚類物質在高溫下會發生降解,因此低溫條件(≤20 ℃)更有利于RPE的保存。

2.2.2 pH穩定性

RPE中的主要成分之一矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷是一種天然色素,其顏色隨著pH值的變化而變化(圖4-A)。pH值為1～4時,溶液呈紅色,并且隨著pH值增大,溶液的顏色逐漸變淺。pH值為7～8時,溶液呈紫色,并且顏色隨著pH值增大而加深。pH值增大到9時,溶液呈深藍綠色,增大到10～11時,溶液呈綠色,當pH值為12時,溶液呈棕黃色。根據全波段掃描圖譜(圖3-B),pH值1～4時,吸收峰的高度降低,寬度增大,pH值為5～6時,沒有出現吸收峰,pH值增大至7時,重新出現吸收峰。pH值為7～9時,吸收峰的寬度降低,高度增加,并向右偏移。出現上述現象的原因是pH值的變化使花色苷的結構發生變化,pH值為1～4時,花色苷以黃酮陽離子的形式存在,呈現紅色;pH值為5～6時,花色苷水解形成無色的半縮醛形式;當pH值進一步升高至7～8,花色苷脫水、去質子化,變為紫色,當pH值升高至10以上時,花色苷轉變為查爾酮結構[24]。此外,ZHANG等[14]研究發現pH值為7時,玫瑰提取物中總酚的含量要遠低于pH值為2和5時的總酚含量(P<0.05),原因是多酚在非酸性條件下更易形成沉淀。綜上所述,RPE應保存在pH≤4的環境中以防止其結構發生變化。

A-顏色;B-全波段掃描

2.3 RPE的抗氧化能力評價

2.3.1 RPE的自由基清除能力

根據對ABTS陽離子自由基的清除率達到100%時的濃度(圖5-A),推斷ABTS陽離子自由基清除能力從強到弱為RPE>GA>TP>維生素C>TBHQ>BHA>維生素E。在質量濃度為0.05 mg/mL時,RPE對ABTS陽離子自由基的清除率達到100%。多項研究表明RPE中的主要成分矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷和鞣花酸等均具有良好的自由基清除能力[19,25]。

A-ABTS陽離子自由基;B-DPPH自由基

如圖5-B所示,在低濃度的情況下,RPE的DPPH自由基清除能力顯著高于其他對照,當RPE質量濃度為0.1 mg/mL時,RPE的清除能力達到飽和,對DPPH自由基清除率為89.53%。當質量濃度為0.8 mg/mL時,RPE的清除率最低。葛芹[8]發現云南安寧玫瑰提取物對DPPH自由基的EC50值為20.8 μg/mL,其清除能力為GA的8.9倍。李坪[26]的研究表明云南玫瑰多酚提取物清除DPPH自由基的能力弱于維生素C,存在差異的原因可能在于玫瑰提取物的成分不同。此外,α-生育酚在此濃度范圍內對DPPH自由基的清除率為0,原因可能是其濃度過低。楊盈等[27]研究發現α-生育酚與DPPH自由基反應的計量比為1∶2,而本實驗中樣品與DPPH自由基的體積比為0.1∶4,因此難以體現出α-生育酚對DPPH自由基的清除能力。

綜上,RPE對ABTS陽離子自由基和DPPH自由基具有較強的清除能力,當RPE的質量濃度達到0.1 mg/mL時,自由基清除能力達到飽和。

2.3.2 RPE的Fe3+還原能力

如圖6所示,RPE對Fe3+的還原力顯著高于對照組(P<0.05)。SINAN等[28]研究發現Fe3+還原能力與抗氧化劑結構中酚羥基的位置、數量以及甲氧基的數量密切相關。從玫瑰多酚的成分來看,矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、鞣花酸以及兒茶素等都含有多個羥基并具有鄰位酚羥基。趙靖[29]的研究表明鄰位酚羥基的抗氧化性能優于非鄰位結構,可能在于鄰位酚羥基具有較好的氧化還原可逆性,其抗氧化性能具有再生性。因此,RPE具有較強的Fe3+還原能力。

圖6 抗氧化劑種類對鐵離子還原能力的影響

2.3.3 RPE的金屬離子螯合能力

如圖7所示,相同質量濃度下,RPE對Fe2+和Cu2+的螯合率低于EDTA,高于其他對照組,原因在于EDTA中含有多個胺和羧基結構,能夠提供多個N、O配位原子與金屬離子的空價電子軌道相結合,形成穩定的環狀結構[30]。此外,BHA、TBHQ和茶多酚對Cu2+的螯合率則隨著質量濃度的升高而降低,目前關于脂溶性抗氧化劑螯合銅離子的研究不足,可能是由于螯合物不穩定,在測試的過程中發生分解,還需要進一步研究驗證。

A-Fe2+;B-Cu2+

3 結論

本研究對墨紅玫瑰多酚進行了提取,并分析其穩定性和抗氧化能力。通過LC-MS鑒定出墨紅玫瑰含有矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、鞣花酸、兒茶素、槲皮素、楊梅素、山奈酚、bis-六羥基二苯?；?葡萄糖苷和沒食子兒茶素,并且在低pH和低溫的環境中結構較為穩定。通過與維生素C、GA、BHA、TBHQ、TP、維生素E等抗氧化劑的對比發現:在較低濃度下,玫瑰多酚提取物即表現出好的抗氧化性能,在質量濃度為0.1 mg/mL時,其抗氧化能力基本已達到飽和,但同濃度下其對金屬離子的螯合率低于EDTA。從結構上來看,RPE的抗氧化性主要來源于各組分的酚羥基,其能通過轉移氫原子來捕獲自由基。未來可以通過直接添加到食品中或用于食品的抗氧化包裝來發揮其抗氧化能力。由于目前對玫瑰多酚的鑒定研究不足,今后可對其各組分進行分離鑒定,以期更全面地了解玫瑰多酚的結構和性能,有助于開發新的天然抗氧化劑。本研究為墨紅玫瑰花色苷的應用提供了可靠思路和理論支撐。