納米磁球固定化木瓜蛋白酶的制備及酶學性質研究

梁杰,林國榮,周鳳超,楊磊,鄒漢勛,劉濤,章麗,郭天章,蔡力鋒

1(莆田學院 環境與生物工程學院,福建 莆田,351100)

2(福建省新型污染物生態毒理效應與控制重點實驗室,福建 莆田,351100)

3(生態環境及其信息圖譜福建省高校重點實驗室,福建 莆田,351100)

4(福建省水手食品有限公司,福建 莆田,351100)

木瓜蛋白酶(papain,PAP)是從番木瓜中提取到的水解酶,不但廣泛應用于食品加工行業,如:對肉質品嫩化、提升啤酒清澈度、改善豆類食品口感等,在醫藥、美容、皮革等領域也是重要的工業酶[1-4]。游離PAP重復使用受限制,酸、堿、熱和貯存穩定性較差,設計一種綠色環保、成本低廉的固定化方法具有現實意義。磁性納米顆粒是維度在1～100 nm的超細顆粒,Fe3O4納米顆粒具有易于磁分離和功能化修飾、較強親和力、低毒性、超順磁性、制作工藝簡單且成本低等特性,廣泛應用于固定化酶、靶向給藥、造影劑、細菌檢測等生物醫藥的研究領域[5-9]。單體甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate, MMA)聚合后的聚甲基丙烯酸甲酯(poly methylmethacrylate,PMMA)環保無毒,具有良好的耐熱性和穩定性,PMMA與納米顆粒反應后能產生性能更好的復合材料[10]。戊二醛(glutaraldehyde,GA)作為交聯劑常用來固定酶或細胞,交聯密度可調控,強化交聯穩定性的同時構建三維親水網絡結構[11-12]。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)是乙烯亞胺聚合產生的水溶性聚合物,帶有豐富的正電基團而具有高吸附性能,可顯著提高酶的活性和穩定性[13-14]。

本研究為實現PAP在磁性納米微球上的可控固定化,設計了一種既能保持酶的空間結構又易于通過磁分離能重復使用的載體,該載體能通過接枝不同分子質量PEI實現固載量調控。過程如下:a)首先通過懸浮聚合法在磁性微球Fe3O4表面均勻地包覆PMMA,制備核-殼結構的磁性Fe3O4納米粒子,標記為Fe3O4@PMMA,Fe3O4表面包覆PMMA一方面能有效避免反應過程中對微球表面的損傷腐蝕等破壞,另一方面能使Fe3O4@PMMA表面酯解形成羧基,可接枝不同分子量PEI(600/1 800/70 000)作為空間臂;b)將PAP物理吸附在PEI長鏈上,以GA為交聯劑,構筑具有磁響應且表面富含氨基的親水性三維立體空間結構的固定化載體Fe3O4@PMMA-PEI,能最大限度保護酶構象動態變化以保持其催化活力,同時又能將酶牢固的封裝在三維立體結構之中,實現對PAP的固定化。

納米磁球對PAP的固載量可通過接枝PEI的分子質量進行調控。選用Fe3O4@PMMA-PEI 1800為固定化載體,分析評價Fe3O4@PMMA-PEI 1800的微觀形貌和結構特征,對固定化酶Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP的酶學性質初步表征,研究結果證明,以Fe3O4為磁核的Fe3O4@PMMA納米磁球,表面接枝PEI 1800后通過GA交聯構建分子籠效應的載體能對PAP有效固定,為固定化PAP的研究和應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

FeSO4·7H2O、偶氮二異丁腈、GA、氯化鈉、85%磷酸、上海麥克林生化科技有限公司;FeCl36H2O,油酸,無水乙醇,MMA、聚乙烯醇(醇解度:98%～99% mol/mol)、酚酞、N-羥基琥珀酰亞胺、PEI(分子量分別為600、1 800、70 000)、牛血清蛋白、PAP(≥2 000 units/mg),阿拉丁試劑有限公司;氨水、鹽酸、二乙烯基苯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉,國藥集團化學試劑有限公司;實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

SU8010型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM),日本株式會社日立制作所(HITACHI);TESNSORⅡ型傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruker公司;ASAP 2420型快速比表面積和孔隙率儀,美國麥克默瑞提克;D2F-6050型真空干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司;HZ9310K型搖床,華利達實驗設備有限公司;UV5500PC型紫外可見光光度計,上海元析儀器有限公司;KQ-600KDE型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;WP-UP-GX-80型超純水機,四川沃爾科技有限責任公司;DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責任公司;BSA124S型電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 固定化酶Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP的制備

參考文獻[15],通過化學共沉淀法制作Fe3O4磁性粒子,以Fe3O4為磁核心制備Fe3O4@PMMA[16],接著進行以下步驟:a)對微球表面PMMA酯解和活化;b)微球表面接枝PEI(600/1 800/70 000):稱取40 mg酯解活化后的磁性微球,向其中加入1%(1 g/100 mL)不同分子量的PEI水溶液2 mL,在搖床中設置溫度25 ℃、轉速160 r/min的條件下反應4 h,反應結束用磁鐵使沉淀析出,蒸餾水反復洗滌,50 ℃真空干燥備用,根據PEI分子量分別標記為:Fe3O4@PMMA-PEI 600、Fe3O4@PMMA-PEI 1800、Fe3O4@PMMA-PEI 70000。

稱取20 mg的Fe3O4@PMMA-PEI 600、Fe3O4@PMMA-PEI 1800、Fe3O4@PMMA-PEI 70000,分別添加2 mL 1.5 mg/mL PAP(pH 7.0,0.1 mol/L的PBS緩沖液配制),置于搖床中110 r/min、30 ℃下振蕩4 h至吸附平衡,隨后向試管中加入2 mL GA溶液(移取4 mL 25%的GA,加入96 mL pH 7.0的0.20 mmol/L磷酸鹽緩沖液,配制為1%的溶液,稀釋至0.02 %備用),110 r/min交聯反應30 min,結束后利用磁分離將上清液和固定化酶分開,緩沖液洗滌沉淀3次,收集上清液和洗滌的緩沖液。將上清液和洗滌液按一定比例稀釋,用Bradford法測定上清液和洗滌液中PAP濃度,計算PAP固載量和解吸率[17]。

1.3.2 磁性微球的性質表征

1.3.2.1 固定化情況及化學性質

參考文獻[16],采用化學滴定法,測定磁性微球表面的羧基和氨基含量。

1.3.2.2 SEM分析

采用SU8010型發射掃描電子顯微鏡觀察納米磁球微觀形貌。

1.3.2.3 X射線衍射表征(X-ray diffraction,XRD)

以Cu-Ka為輻射源,管壓40 kv,電流30 mA,掃描速度2°/min,掃描范圍2θ為5°～90°。

1.3.2.4 熱重分析測定(thermogravimetric,TG)

稱量10 mg磁性微球,使用美國沃特斯SDT650熱重分析儀進行熱重分析。在N2氣氛下,設定起止溫度25 ℃,終止溫度800 ℃,升溫速率10 ℃/min,吹掃氣流速20 mL/min。

1.3.2.5 比表面積與孔隙測定

將適量Fe3O4@PMMA-PEI 1800微球樣品置于50 ℃真空干燥箱中干燥2 h后放入樣品管內,50 ℃下進行脫氣8 h。在77.35 K液氮環境、N2氣氛下進行全孔分析,繪制樣品在N2氣氛下的吸附-脫附等溫線,計算樣品比表面積。

1.3.3 酶學性質研究

1.3.3.1 蛋白質濃度測定

采用Bradford法測定,以牛血清蛋白為標準,得到標準曲線方程:y=1.803 7x-0.02 60,R2=0.999 4。根據標準曲線可計算出樣品中蛋白質含量[17]。

1.3.3.2 酶活力測定

酶活力定義:在測定條件下(pH 7.0,37 ℃),1 min內PAP催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。參考文獻[18-19],繪制L-酪氨酸標準曲線,y=129.63x-0.339 9,R2=0.999 3,計算酶活力。相對酶活力是指某一條件時酶的活力與相同反應條件下最大酶活力的比值。

1.3.3.3 溫度對游離酶與固定化酶的影響

取1.5 mg/mL游離PAP (pH 7.0磷酸鹽緩沖液配制) 0.2 mL,和等當量的Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP樣品,分別在20～90 ℃條件下,每間隔10 ℃作為一組進行測定,按照文獻[19-21]酶活力的測定方法進行反應,分別將未經處理過的游離PAP和Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP的酶活力作為100%。

1.3.3.4 游離酶與固定化酶的熱穩定性比較

取1.5 mg/mL游離PAP (pH 7.0磷酸鹽緩沖液配置) 0.2 mL,和等當量的Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP樣品,分別在20～90 ℃條件下保溫2 h,溫育結束后按照上述酶活力的測定方法進行反應,分別將未經保溫處理過的游離PAP和Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP的酶活力作為100%。

1.3.3.5 pH對游離酶與固定化酶酶活力的影響

取1.5 mg/mL游離PAP(pH 7.0磷酸鹽緩沖液配制) 0.2 mL,和等當量的Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP樣品,分別在pH 5.0～11.0反應,將未經處理過的游離PAP和Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP的酶活力作為100%。

1.3.3.6 固定化酶操作穩定性

稱取20 mg Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP,根據固載量計算酶的等當量。用3 mL、1 mol/L的NaCl磷酸緩沖溶液(pH 7.0)對其進行振蕩洗脫,以35 ℃、110 r/min振蕩洗脫4 h。振蕩洗脫結束后將上清液按照一定比例稀釋,每次洗脫后測定Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP酶活力,共測7次。將第一次測定的酶活力設為100%,其余數據以相對酶活力表示。

1.4 數據處理

實驗數據使用Excel 2013、Design Expert 8.0、SPSS 23軟件計算差異顯著性和相關性并繪圖。

2 結果與分析

2.1 性質表征

2.1.1 納米磁球對PAP的固定情況

如表1所示,Fe3O4@PMMA-PEI對PAP的固載量與Fe3O4@PMMA相比顯著提高,與PEI特殊的長鏈結構有關。

表1 納米磁球對PAP的固定情況Table 1 The immobilization of PAP nano-magnetic

PEI長鏈上富含氨基,柔軟的長鏈結構和良好的親水性將酶吸附并包裹在聚合鏈中,交聯劑GA的醛基與PEI長鏈上的氨基反應促進交聯網狀結構形成,使得酶以立體結構包裹在聚合鏈中,能維持酶舒展的狀態;LEE等[22]通過GA對脂肪酶-Cu2+雜化納米酶交聯后測定其活性,證明GA交聯非但不影響酶的空間構象和形態,還能增強重復使用性。立體網狀結構聚合鏈位于納米磁球的外表面,將酶包裹起來防止脫落的同時也可預防空間位阻對酶活力的影響[16]。PAP在Fe3O4@PMMA-PEI 1800上的固載量最大,過長的PEI分子鏈容易容易發生纏繞。測定Fe3O4@PMMA-PEI 1800表面的基團含量,氨基含量0.33 mmol/g,羧基含量0.95 mmol/g。

考察Fe3O4@PMMA-PEI 1800對PAP的物理吸附、封裝固定與解吸情況,由表2可知,物理吸附法的固載量比交聯封裝法的低;交聯封裝法得到的固定化酶的經洗脫后解吸率顯著降低。

表2 反應方法對固定和解吸的影響Table 2 The reaction method’s impact onization and desorption

2.1.2 微觀結構—SEM分析

由圖1-a可知,納米磁球球體大小基本均勻、外表面較為光滑平整,球體粒徑大約在100～250 nm,球體分散性能良好,可能是接枝PEI能調節立體空間的電荷層,抑制了Fe3O4的團聚現象。由于載體本身具有導電性,拍照時有拖尾而導致納米磁球略微變形。由圖1-b看出,PAP均勻地包覆在Fe3O4@PMMA-PEI 1800外表面,PAP負載量較多且輪廓清晰,微球粒子分散性能較好,球體粒徑約120～250 nm,局部未見有明顯的團聚現象,單體分散性良好,有利于酶促反應的有效發生。江維婷等[23]通過水熱法制備的Fe/Fe3C/Fe3O4磁性微球粒徑大小分布在2～6 μm,分布范圍較大,球體表面粗糙,而本文制備的Fe3O4@PMMA-PEI 1800球體粒徑分布在100～250 nm。

a-Fe3O4@PMMA-PEI 1800;b-Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP

2.1.3 XRD測定

納米磁球樣品的XRD圖譜與Fe3O4標準卡(JCPDS NO 19-0629)卡片對比可知(圖2),在2θ=30.1°、35.5°、43.1°、53.6°、57.1°、62.7°觀察到(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)特征晶面峰與標準的Fe3O4晶體一致,對應的晶面間距也與PDF卡片(JCPDS NO 19-0629)一致,說明樣品是具有特征立方結構的Fe3O4晶體,結晶狀態良好[24-25]。圖譜中特征衍射峰寬度窄且峰型尖銳,除Fe3O4特有的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)特征晶面峰外,未出現其他雜質晶體衍射峰,說明該載體在一系列反應后,仍具有較高的純度與結晶度[26],一些列的化學反應并未使Fe3O4與高分子化合物發生鍵合而改變特征晶型,Fe3O4磁性沒有衰減,體現出納米磁球載體的結晶純凈性與使用穩定性。

a-Fe3O4@PMMA;b-Fe3O4@PMMA-PEI 1800; c-Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP

2.1.4 TG分析

圖3為熱損失曲線,失重分2個階段:50～300 ℃為第一階段,此階段a、b、c質量損失分別僅為3.06%、4.38%、4.97%,該階段質量損失主要可能是殘留水份蒸發造成的。第二階段溫度范圍在300～510 ℃,是主要失重階段,a、b、c的質量損失分別是54.46%、52.85%、60.76%,a和b的失重率是PMMA聚合物以及PEI長鏈斷裂造成的,b的質量損失略大于a可能是PMMA和PEI的相互作用提高了熱穩定性,而c的質量損失最大則是蛋白酶的分解、PEI長鏈斷裂以及Fe3O4向Fe2O3的相變等多重影響帶來的,還有PAP的分解產物可能導致Fe3O4發生還原或分解等一些反應帶來的質量損失[27]。在510 ℃之后的范圍內,3種微球質量不再發生變化,趨于穩定。

圖3 納米磁球的熱重曲線圖

2.1.5 比表面積與孔隙測定

通過比表面積與孔隙測定得到Fe3O4@PMMA-PEI 1800納米磁球的表面積為151.30 m2/g,孔容0.27 cm3/g,孔徑3.27 nm。李玲慧[28]制備的Fe3O4@TiO2磁性微球比表面積為124.18 m2/g,孔徑為18.547 nm;BAO等[29]制備的Fe3O4@SiO2磁性微球吸附劑,比表面積93.2 m2/g,Fe3O4@PMMA-PEI 1800在比表面積上具有優勢,提高比表面積能增加納米磁球與酶的物理接觸,使材料獲得更好的吸附能力,有利于酶的固定化。

Fe3O4@PMMA-PEI 1800孔徑分布大致分布在3.0～5.0 nm附近。圖4曲線呈現典型的Ⅳ型等溫線形狀,Fe3O4@PMMA-PEI 1800納米磁球中具有多級多孔結構,根據IUPAC分類,孔徑3.27 nm屬于介孔結構。

a-N2-吸脫附等溫線;b-孔徑分布曲線

2.2 酶學性質分析

2.2.1 最適反應溫度

酶能否在高溫下保持活性是其工業應用的一個重要指標。由圖5可知,游離PAP的最適溫度為50 ℃,溫度高于70 ℃以后酶活力急劇下降。固定化酶的最適溫度提升至60 ℃,在40～80 ℃能保持80%以上的相對酶活力,固定化酶能在更大的溫度區間內保持高效催化能力。90 ℃時游離PAP相對酶活急速降低至30%以下,Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP依然能保持66.84%的相對酶活力。GA與Fe3O4@PMMA-PEI 1800長鏈上的氨基構建的立體結構難以被破壞,能維持生物酶舒展的狀態,產生酶活力緩釋的效果,PMMA的耐熱性能加強了熱穩定性,保護Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP免受高溫鈍化,降低酶的溫度敏感性[30]。蘇二正等[31]通過氨基載體原位固定化PEG相中的PAP,固定化PAP的最適溫度在60～70 ℃,固定后的PAP比游離的PAP熱穩定性都有所提升,高溫對游離蛋白酶的空間結構、疏水作用、氫鍵等作用力產生影響破壞酶的活性部位導致酶失活,而固定化酶能使酶保持剛性的結構和舒展的空間構象,提升了穩定性。

2.2.2 熱穩定性

熱穩定性能是考察酶能否工業化使用的重要指標。分析圖6,固定化酶熱穩定性始終優于游離酶,隨溫度升高,Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP與游離PAP酶活力均有所下降,Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP熱穩定性顯著高于游離PAP,游離PAP在60 ℃下溫育2 h后相對酶活力僅剩余58.72%,90 ℃環境下溫育2 h后完全失活。Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP在60 ℃下溫育2 h相對酶活力能保持80.37%,90 ℃溫育2 h后依然保持36.63%的酶活力,載體抑制蛋白酶空間構象發生改變的同時提供熱阻,降低了酶對高溫的敏感性。游離PAP對環境溫度敏感,隨著溫度逐漸升高,游離PAP酶活力下降速度快。Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP在20～60 ℃以內酶活力下降緩慢,60～80 ℃時依然保持70%以上的酶活力。隨著溫度升高,Fe3O4@PMMA-PEI 1800與PAP之間非共價結合的相互作用減弱,PAP從Fe3O4@PMMA-PEI 1800上脫落下來[27]。翟葉輝[32]制備的殼聚糖埃洛石微球固定化木瓜蛋白酶在70 ℃時酶活力僅剩余40%左右,而Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP在70 ℃時的酶活力為71.36%,熱穩定性有顯著提高。

圖6 游離酶與固定化酶的熱穩定性

2.2.3 最適pH值

由圖7可知,PAP在pH 7.0時擁有最大酶活力,在pH 5.0～7.0能發揮60%以上的酶活力,在pH 9.0～11.0酶活力快速下降,pH 10.0相對酶活力僅剩10%。酶分子活性基團的解離情況受pH影響,偏離最適pH使酶活性中心的基團解離而產生構象改變,導致酶和底物的特異性結合力降低或結合后不發生酶促反應,甚至造成酶失活[33]。Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP最適pH為6.0,在pH 9.0時仍具有78%以上的相對酶活力,pH 11.0環境下仍保留29.48%的酶活性,此時游離PAP已完全失活。MOSAFA等[34]將PAP通過強共價鍵連接到(3-氯丙基)三甲氧基上硅烷改性二氧化硅涂層磁性納米顆粒上,在pH 9.0能保持大約45%的相對酶活力。Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP在pH 5.0～10.0環境中酶活力仍能保持60%以上,可能是因為PEI長鏈上富含氨基基團而改變了反應體系中的微環境,使Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP具有更寬的pH適應范圍,尤其更適應堿性條件下的反應。

圖7 游離酶與固定化酶的最適pH值

2.2.4 操作穩定性

由圖8可知,固定化酶活力隨洗脫次數緩慢下降,固定化酶可承受一定的振蕩作用力,PEI長鏈形成的三維結構和納米磁球的介孔結構能維持多次洗脫時酶的少量脫附。經過4次4 h/次洗脫,Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP相對酶活依舊保持在88.42%;經過7次4 h/次洗脫后仍有71.14%的相對酶活力。李有花[19]通過分子對接技術設計以PS-CL、PS-PEG、PS-PEG-DDI(II)為載體來固定化PAP,其中以PS-PEG-DDI(II)為載體的固定化PAP使用去離子水洗脫12 h后剩余酶活力在70%以上。湯燕明等[35]以CaCO3為模板劑、多巴胺為包覆劑制備的多孔碳材料固定化木瓜蛋白酶在重復使用5次以后酶活力保留了46.7%,多孔碳材料疏松的結構造成酶在重復使用洗脫后容易脫落下來;丁麗君等[36]通過中和沉淀法將改性后的CTS和HNTs制備CTS-HNTs微球,以戊二醛為交聯劑通過交聯-吸附固定化木瓜蛋白酶,重復洗脫4次以后,固定化酶的相對酶活為26.26%。本文制備的Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP之所以在操作穩定性上具有優勢,與載體的制備方法有關,湯燕明等[35]使用的載體雖然是疏松多孔的碳材料,吸附性能良好,但不夠穩定,蛋白酶易于從載體上脫落下來,而丁麗君等[36]制備的CTS-HNTs微球通過戊二醛交聯固定蛋白酶,從電鏡圖中看到微球性狀不規則,且球體粒徑比Fe3O4@PMMA-PEI 1800大;本文制備的納米磁球固定化酶反應條件溫和,交聯反應時使用的戊二醛量約為丁麗君等使用的4%,戊二醛具有較強的化學和生物毒性,過高濃度會對酶活帶來負面影響。韋美蘋等[37]通過Fe3O4@mSiO2-GLYMO-IDA-Cu2+螯合載體固定化木瓜蛋白酶,重復使用7次以后酶活性降低至原來酶活的7.5%,載體上的Cu2+在多次酶解與洗滌過程中發生解離導致脫落,使載體表面的木瓜蛋白酶量及酶活降低。

圖8 固定化酶的操作穩定性

3 結論

本研究通過懸浮聚合法在磁性微球Fe3O4表面包覆PMMA,制備核-殼結構的磁性Fe3O4@PMMA納米微球,使PMMA微球表面酯解形成羧基。在Fe3O4@PMMA上接枝PEI 1800,將PAP物理吸附在PEI 1800長鏈上,通過GA交聯封裝,構筑具有磁響應且表面富含氨基的親水性載體Fe3O4@PMMA-PEI 1800,實現PAP的封裝固定。

(1)納米磁球對PAP的固載量可通過接枝不同分子量PEI(600/1 800/70 000)進行調控,Fe3O4@PMMA接枝PEI 1800時對PAP的固載量可達139.80 mg/g,解吸率2.78%。

(2)在電鏡下觀察納米磁球的形貌特征,Fe3O4@PMMA-PEI 1800外表面較為光滑平整,球體粒徑在100～250 nm,分散性能良好?？汕逦目吹紽e3O4@PMMA-PEI 1800-PAP表面有均勻的包覆物。

(3) Fe3O4@PMMA-PEI 1800的比表面積為151.30 m2/g, 孔容0.27 cm3/g,孔徑3.27 nm。是多級多孔結構的介孔結構,有利于酶的固定化。

(4) Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP酶學性質:最適溫度從50 ℃提升至60 ℃,在90 ℃下保存2 h依然能保持36.63%酶活力,此時游離PAP已失活,固定化酶熱穩定性顯著提高。Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP的最適pH為6.0,在pH 5.0～pH 9.0的環境下仍具有75%以上的相對酶活力,在強堿性下仍然具有29.48%的酶活力,此時游離PAP已變性失活,固定化PAP具有較寬的pH使用范圍。經過7次循環使用,酶活力保留在70%以上。Fe3O4@PMMA-PEI 1800-PAP的熱穩定性和pH穩定性有較大提升,提高了固定化酶在極端pH下的耐受性。