香榧油對肥胖小鼠脂質代謝紊亂的作用機制研究

蔣起宏,姚詩煒,盧紅伶,蔣陳凱,胡文君,馮永才,陳振濱,沈國新,相興偉2,,陳琳*

1(浙江省農業科學院蠶桑與茶葉研究所,浙江 杭州,310021)

2(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 湖州,313200)

3(諸暨綠康生物科技有限公司,浙江 紹興,311800)

肥胖是一個以脂肪在組織中大量堆積為特征的世界性公共衛生問題[1]。世界衛生組織發布《2022年歐洲區域肥胖報告》指出,超重和肥胖在歐洲已達“流行病”程度,且“肥胖”被確定為十大慢性疾病之一。據報道,長期高脂飲食會使得脂肪組織發生不同程度的改變,引起炎癥、氧化應激[2]、脂質代謝紊亂和腸道菌群失調[3],增加患糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病的風險[4]。目前,傳統合成藥物治療肥胖癥會導致嚴重的不良反應,如惡心、嘔吐、腹脹、肌肉酸痛等[5-6]。使用安全的天然化合物改善肥胖及其相關的代謝綜合征,已經成為研人員關注的熱點。

脂質是人類飲食中的關鍵宏量營養素,攝入的膳食脂肪酸類型和比例會影響機體的健康和生理功能[7]。研究表明,飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)對健康有害,而單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)對健康有益。其中,n-3不飽和脂肪酸在減輕體重、改善身體成分和抵消肥胖的不良代謝效果尤為顯著[8]。香榧是紅豆杉科榧樹屬常綠喬木,主要分布在中國亞熱帶的丘陵地區,特別是在浙江會稽山脈一帶。因其種籽風味獨特,營養價值高,倍受消費群體喜愛[9]。香榧油中富含不飽和脂肪酸,包括亞油酸、油酸和金松酸(5 C,11 C,14 C-二十碳三烯酸)。此外,香榧油中還含有一些生物活性物質,如β,γ生育酚,β-谷甾醇和多酚,具有巨大的潛在營養價值[10]。然而,香榧油對肥胖小鼠干預效果尚不清晰。本研究采用高脂飲食誘導肥胖小鼠模型,研究香榧油干預對肥胖小鼠的降脂、抗氧化和炎癥作用機制,為香榧油作為人類飲食中的油或預防肥胖功能性食品的開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧種實,于2022年9月采自諸暨斯宅村;香榧油,由浙江省農業科學院蠶桑與茶葉研究所制備提供。甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素6(Interleukin 6,IL-6)試劑盒,南京建成科技有限公司;RIPA裂解液、Fasting gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒、Cell Kit RNA Easy Fast試劑盒,碧云天生物技術有限公司;Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus),翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

24只雄性C57BL/6小鼠,體重(20±2) g,年齡7周,杭州子源實驗動物科技有限公司,證書編號SCXK(zhe)2019-0004。小鼠在23～25 ℃、40%～65%的濕度、12 h的光照/黑暗周期下飼養,并允許自由獲取飲食(飼料配料表如表1所示)。

表1 小鼠飼料組成成分Table 1 Composition of mice feed

1.2 儀器與設備

ABI ViiATM7實時熒光定量PCR儀,Applied Biosystems;Micro21R高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技公司; FA1004N型分析天平,上海民橋精密科學儀器有限公司;Tecan Infinite F200型多功能酶標儀,瑞士TECAN集團公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與給藥

將24只C57BL/6小鼠在SPF級動物房內適應性飼養1周后,隨機分為4組,分別為正常對照組(NC組)、高脂對照組(HFD組)、低劑量香榧油組(SCL組)、高劑量香榧油組(SCH組),每組6只,實驗周期8周。在試驗期間,NC組小鼠飼喂普通飼料,HFD組、SCL組和SCH組飼喂高脂飼料。SCL組和SCH組小鼠分別灌胃500 mg/kg BW和800 mg/kg BW的香榧油,而NC組和HFD組給予等體積生理鹽水。所有實驗小鼠飼養于SPF級動物房內,自由攝食,飲水。每日對小鼠精神狀態、飲食情況、排泄等進行記錄,每周定時稱量各組小鼠體重。

1.3.2 血清生化指標檢測

8周后,各組小鼠處死前分別稱重記錄,斷頸處死后快速心臟取血,然后分別摘取小鼠肝臟、腎周脂肪組織、附睪脂肪,使用預冷PBS緩沖液漂洗小鼠臟器組織各3次,用濾紙吸干表面水分后稱重。一部分肝臟組織和附睪脂肪置于干燥無菌離心管中,貯存在-80 ℃冰箱保持備用;一部分采用4%多聚甲醛進行固定,用于后續HE染色。血液于3 000 r/min離心15 min,取上清液,按試劑盒說明書測定TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、GSH-Px、IL-6、TNF-α。

1.3.3 組織病理學觀察

將固定好的肝臟組織和附睪脂肪,經過無水乙醇脫水、包埋、切片后,用于HE染色觀察。

1.3.4 RT-PCR測定肝臟組織脂質代謝相關基因表達

取50 mg肝臟組織加入1 mL組織裂解液進行研磨,隨后按照TRIzol法提取細胞總RNA,2 μg總RNA根據Fasting gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。反應體系:含有10 μL SYBR Green混合液,1 μL cDNA樣品,上游引物和下游引物各0.4 μL,用ddH2O補足至20 μL,并在95 ℃,5 s;60 ℃,34 s條件下循環40次。以β-actin為內參基因,通過RT-PCR系統測定靶基因的相對表達水平,計算公式為2-ΔΔCt。測定的目標基為人腺苷酸活化蛋白激酶α(human adenylate activated protein kinase α,AMPKα)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)、固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)和β-肌動蛋白(β-actin)(表2)。

表2 基因引物序列Table 2 Gene primer sequences

1.4 數據處理

實驗數據用SPSS 19.0進行分析處理,數據均以“平均值±SD”的形式表示,對數據進行ANOVA單因素方差分析和圖基檢驗,P<0.05表示差異顯著,采用GraphPad Prism 8軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 香榧油抑制肥胖小鼠的體重增長

飼養8周后,小鼠體重均顯著增加,其中NC、HFD、SCL和SCH組小鼠與起始比分別增加了20.23%、30.06%、23.12%、21.97%。與HFD組小鼠相比,香榧油干預后,能有效抑制高脂飲食小鼠體重的增長趨勢,分別降低了4.51%和6.81%(圖1-a)。此外,實驗結果發現香榧油能降低肝臟系數和腎周脂肪堆積,其中高劑量效果最佳(圖1-b、圖1-c),呈顯著性差異(P<0.05)。

a-體重;b-肝臟系數;c-腎周脂肪

2.2 香榧油改善肥胖小鼠的脂質代謝紊亂

高脂飲食8周后,與NC組相比,HFD小鼠TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P<0.05),HDL-C水平顯著降低(P<0.05),表明肥胖小鼠出現嚴重的脂質代謝紊亂,并伴隨高脂血癥(圖2)。與HFD組相比,SCL和SCH組小鼠TC、TG水平均顯著降低(P<0.05)。其中低劑量香榧油能略微降低LDL-C水平和升高HDL-C水平,但不顯著,而高劑量香榧油干預均能逆轉這一現象。

2.3 香榧油改善肥胖小鼠的抗氧化能力和炎癥反應

長期攝入富含脂肪和膽固醇的飲食會導致高脂血癥、肝臟脂質堆積,誘發炎癥和氧化應激。如圖3所示,與正常組相比,HFD組小鼠GSH-Px、SOD水平顯著降低(P<0.05),而IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05),表明高脂飲食會導致小鼠抗氧化能力下降,出現嚴重的炎癥反應。與HFD組相比,SCL組小鼠GSH-Px水平顯著升高(P<0.05),且能降低IL-6和TNF-α水平。另一方面,SCH組小鼠GSH-Px、SOD水平均顯著升高(P<0.05),IL-6和TNF-α水平明顯降低,接近正常組。表明香榧油對肥胖小鼠的抗氧化能力和炎癥具有改善作用,且呈現劑量依賴性。

a-GSH-Px;b-SOD;c-IL-6;d-TNF-α

2.4 小鼠組織病理學觀察

為了評估香榧油對肥胖小鼠肝臟組織和附睪脂肪的影響,對肝臟組織和附睪脂肪進行H&E染色觀察。如圖4-a所示,NC組小鼠的肝臟清晰,形態正常,排列均勻。HFD組小鼠,肝臟組織結構混亂,排列不規則,顯示出細胞質空泡化和明顯的脂肪變性。SCL和SCH組小鼠組織結構完整,能減輕肝細胞空泡化,抑制肝臟脂肪變性,緩解了肥胖小鼠肝臟的病理過程。如圖4-b所示,NC組小鼠附睪脂肪細胞分界清晰,形態規則完整,大小均勻,呈蜂窩狀;HFD組小鼠附睪脂肪細胞性狀不規則,體積較大,呈現嚴重炎癥反應;SCL組小鼠附睪脂肪相比于HFD組體積明顯降低,細胞排列規則;SCH組小鼠附睪脂肪細胞排列規則,分界清晰,但細胞大小不均勻,未見明顯炎癥反應。這些結果表明,香榧油可以有效的保護肥胖小鼠免受肝臟損傷,減少脂肪堆積。

a-肝臟組織;b-附睪脂肪

2.5 香榧油提高肥胖小鼠肝臟脂質代謝基因表達水平

為更進一步分析香榧油改善脂質代謝紊亂的分子機制,測定了與脂質代謝相關基因AMPKα、SPEBP-1c和FAS表達情況。由圖5的RT-PCR結果可知,與NC組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟組織中AMPKα、SPEBP-1c和FAS的表達均顯著升高(P<0.05)。與HFD組小鼠相比,SCL組小鼠SPEBP-1c表達水平顯著降低(P<0.05),AMPKα和FAS的表達水平略有降低但不顯著;SCH組小鼠AMPKα、SPEBP-1c和FAS表達均顯著降低,且與正常組無顯著差異。結果表明,香榧油可能通過調控AMPKα/SPEBP-1c通路調控脂質代謝,從而改善肥胖。

a-AMPK;b-SREBP-1c;c-FAS

3 結論與討論

本研究通過高脂飲食建立肥胖小鼠模型,探究了香榧油對肥胖小鼠脂質代謝的影響。肥胖通常是由于體內脂肪堆積所導致,伴隨脂肪在組織中的積累(異位脂肪沉積在肝臟,心臟,骨骼肌等),會導致高脂血癥、糖尿病以及心血管疾病等[11]。如今越來越多的研究表明,補充富含n-3不飽和脂肪酸的植物油,能有效降低肥胖小鼠的體重和脂肪堆積,對肥胖和高脂血癥具有積極作用。例如,石榴籽油的膳食補充劑,含有高水平的石榴酸(9 C,11 T,13 C-十八碳三烯酸),可以顯著降低血清甘油三酯和磷脂水平[12]。大蒜油和洋蔥油可以改善高脂飲食對體重、脂肪組織重量和血脂異常的影響,具有抗肥胖特性[13]。本研究試驗結果再次證明了這一點,香榧油干預8周后,能顯著抑制肥胖小鼠體重的增長,降低肝臟系數和腎周脂肪的堆積(P<0.05)。高脂血癥的特征是血清中TC,TG和LDL-C水平升高,HDL-C水平降低[14]。據報道,在LDL-C和HDL-C共同作用下,能調節體內膽固醇含量,降低心血管疾病風險[15]。在這項研究中,在補充800 mg/kg BW香榧油的小鼠中觀察到血清TC(-19.24%),TG(-28.17%)和LDL-C(-21.81%)降低,血清HDL-C升高(13.28%)。同時,肝臟和附睪脂肪切片的H&E染色表明,香榧油干預后能顯著減少高脂飲食誘導的肝臟脂肪變性和附睪脂肪堆積,對肥胖小鼠脂質代謝紊亂具有改善作用。

最新研究表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)和氧化應激在肥胖發展中呈上升趨勢。ROS是高反應性物質,由于ROS的影響,幾乎所有細胞成分都會發生化學變化,最終導致脂質過氧化的產生,脂質過氧化是氧化應激發展的主要致病因素[16]。氧化應激已被證明在幾種與肥胖相關的有害健康后果中起關鍵作用,包括DNA氧化[17]。實驗結果表明,香榧油能顯著提高肥胖小鼠血清中SOD和GSH-Px水平(P<0.05),增強抗氧化能力,減輕氧化應激反應。同時,肥胖小鼠血清炎癥指標檢測結果顯示,香榧油能降低TNF-α和IL-6水平,且接近于正常組。先前研究表明,TNF-α和IL-6是重要的促炎癥因子,在肥胖相關的疾病發生發展中發揮重要作用[18],包括脂質代謝和胰島素信號傳導,其循環水平隨著肥胖而增加,隨著體重減輕而降低[19]。AMPKα、SPEBP-1c和FAS是調控脂質代謝的關鍵基因。AMPKα在調節脂質代謝途徑中起著重要作用,通過抑制FAS、ACC表達,促進脂肪酸氧化分解[20]。SREBP-1c是脂肪生成的主要調節因子,參與脂生成中編碼限速酶的基因的轉錄激活,例如FAS,ACC和硬脂酰輔酶A去飽和酶1[21]。SREBP-1c可控制肝臟中葡萄糖脂質的合成,這一過程對于能量貯存至關重要[22]。研究結果表明,800 mg/kg BW香榧油能顯著抑制AMPKα、SPEBP-1c和FAS表達水平(P<0.05),改善肥胖小鼠脂質代謝途徑。

綜上所述,香榧油能抑制肥胖小鼠體重增長,改善高脂血癥,并減輕氧化應激和炎癥反應,保護肝臟組織。同時,香榧油能調節AMPKα/SREBP-1c信號通路,改善肥胖小鼠脂質代謝紊亂。這些實驗結果表明,香榧油具有開發成功能性食用油的潛力,為其高值化利用提供實驗依據。