西藏傳統風干牦牛肉中微生物群落組成及安全評價

張二豪,落桑央吉,高潭,羅章

(西藏農牧學院 食品科學學院,西藏 林芝,860000)

牦牛被譽為“高原之舟”,長期生活在海拔3 000 m以上的高原地區,是我國高海拔地區特有的珍稀牛種[1]。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪、富含多種氨基酸和微量元素等特點,深受消費者的喜愛。風干牦牛肉是藏民族極具特色的傳統生食肉制品,是藏民族在長期游牧生活中發現的一種傳統牦牛肉貯藏方法[2]。風干牦牛肉是以新鮮牦牛肉為原料,經分割、切條后在低溫干燥條件下自然風干而成[3],是當地主要的畜產消費品和接待親朋好友的上等佳肴。在自然條件下,傳統風干肉在內源酶和環境微生物作用下,發生一系列變化而形成具有獨特風味的生食肉制品[4]。目前,風干牦牛肉制品主要以牧民家庭式生產、小作坊和企業批量生產3種生產方式生產[5],牧民家庭式生產方式由于傳統生活習俗、不規范的制作工藝和自然環境條件下操作等因素,使產品面臨環境致病或腐敗微生物污染的風險,給產品食用安全性帶來潛在風險[6]。因此,探討傳統風干牦牛肉中微生物群落組成及安全性,對改善家庭式風干牦牛肉生產方式,增強農牧民食品安全意識具有重要意義。

食品微生物學研究方法主要包括傳統培養法、基于細胞組分或代謝特征差異的非培養生理生化法、基于代謝產物的現代分析技術和基于DNA或RNA等遺傳信息的分子生物學方法[7]。高通量測序技術由于其通量高、信息量大、準確性高、能全面反映樣品微生物群落結構及其豐度等優點[8],已被廣泛應用于食品微生態學領域的研究。王俊鋼等[9]利用高通量測序技術分析了新疆傳統風干肉中細菌多樣性,發現新疆哈薩克族傳統風干肉中存在豐富的細菌菌群且含有大量的條件致病菌;文開勇等[10]利用高通量測序技術研究了四川傳統臘肉中的微生物群落結構組成,發現不同來源臘肉中微生物群落組成存在一定差異;趙睿等[11]利用高通量測序技術對不同腌制肉品細菌多樣性進行了分析,結果表明不同類別的腌制肉中微生物群落結構存在明顯差異。目前,西藏傳統風干牦牛肉制品的研究主要集中在加工工藝、品質和風味物質等方面[1,3,5],而有關其微生物方面的研究多側重于益生菌的篩選[12-13],對西藏傳統風干牦牛肉中的微生物群落組成研究不夠全面。不同的地理環境、加工方式、生活習俗對產品中微生物群落組成及多樣性的影響較大[6,9],因此,本研究采用高通量測序技術,分析西藏不同地區傳統風干牦牛肉中微生物群落結構組成,明確傳統風干牦牛肉中微生物多樣性及安全性,旨在為進一步研究微生物菌群與風味品質間的相互關系、改善傳統手工加工方式及品質控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與信息

風干牦牛肉樣品于2022年3月采集自西藏林芝市巴宜區(BY)、拉薩市曲水縣(LS)、山南市桑日縣(SN)、日喀則市康馬縣(RKZ)和那曲市班戈縣(NQ),樣品信息如表1所示。風干牦牛肉制品均為牧民家庭式生產(新鮮牦牛肉切條后于陰涼處自然風干40 d),無任何添加劑和調味品,每個地區采集4份,共20份樣品,裝入無菌袋中,于4 ℃條件下帶回實驗室。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2 試劑

E.Z.N.A.?Stool DNA Kit M4015-02試劑盒、Gel Extraction Kit D2500-01試劑盒,美國Omega公司;2×TaqPCR Master Mix、D2000 DNA Marker,天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖,美國Invitrogen公司。

1.3 儀器與設備

5418R高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;NanoDrop2000微量分光光度計,美國Thermofisher公司;Tocan 240凝膠成像系統,上海領成生物科技有限公司;T100PCR儀,美國Bio-rad公司;DYY-15D電泳儀,北京六一。

1.4 樣品總DNA提取及PCR擴增

按照E.Z.N.A.?Stool DNA Kit試劑盒操作說明提取樣品總DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA質量,用NanoDrop2000微量分光光度計測定DNA濃度和純度。利用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌16S rRNA基因V3～V4區,ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)擴增真菌內源轉錄間隔區(internally transcribed spacer,ITS),膠回收PCR擴增產物并送至上海派森諾生物科技有限公司進行測序。

1.5 數據處理及分析

基于QIIME2 (2019.4)軟件和Vsearch (v2.13.4)軟件對原始數據進行質量過濾、去噪、拼接、去嵌合體和質控處理;采用QIIME2的classify-sklearn算法,基于細菌Greengenes數據庫(Release 13.8, http://greengenes.secondgenome.com/)和真菌UNITE數據庫(Release 8.0,https://unite.ut.ee/)進行物種分類學注釋;采用QIIME2 (2019.4)和R語言進行alpha多樣性分析、繪制稀釋曲線、韋恩圖和物種組成熱圖。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果分析

高通量測序結果如表2所示,20個樣品共獲得1 148 131條16S rRNA有效序列和1 490 806條ITS有效序列,平均序列長度分別為430 bp和254 bp。測序覆蓋度和稀釋曲線用于驗證測序結果是否能真實反映樣品微生物多樣性[9],20個樣品中微生物測序覆蓋度為98.01%～100%,隨著測序深度的增加,20個樣品的稀釋曲線均趨于平坦(圖1),說明測序結果基本覆蓋了樣品中所有微生物類群,能真實反映樣品微生物多樣性。在97%相似度水平下,共獲得38 655個細菌OTUs和2 498個真菌OTUs,其中LZ、LS、SN、RKZ和NQ樣品中所獲得的細菌OTUs數分別為7 464、7 650、8 474、7 759、7 308個,所獲得的真菌OTUs數分別為419、657、498、506、418個。OTUs數與樣品中微生物豐度密切相關,OTUs數越多,說明樣品中微生物豐度越大[14]。SN樣品中的細菌OTUs數最多,LS樣品中真菌OTUs數最多,NQ樣品中的細菌和真菌OTUs數最少,說明SN樣品中細菌種類和LS樣品中真菌種類最豐富。韋恩圖能夠直接展示不同樣品間微生物群落組成的差異性和相似性[15]。由圖2可知,不同地區樣品中共有的細菌OTUs數為1 252個,占總OTUs數的3.24%,共有的真菌OTUs數為124個,占總OTUs數的4.96%,說明不同地區風干牦牛肉中微生物種類存在差異,這可能與風干牦牛肉制作環境中的微生物有關[4]。

A-細菌;B-真菌

A-細菌;B-真菌

表2 樣品高通量測序結果Table 2 The high-throughput sequencing results of the samples

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數中的Chao1、Shannon和Simpson指數主要用于反映樣品微生物豐富度和多樣性,Chao1指數值越大說明物種豐富度越高,Shannon指數值越大,Simpson指數值越小說明物種多樣性越高[16]。由表3可知,SN樣品細菌和LS樣品真菌豐富度最高,NQ樣品細菌和真菌豐富度最低;SN樣品細菌和真菌多樣性最高,LZ樣品細菌和NQ樣品真菌多樣性最低?？傮w而言,隨著海拔高度的升高,風干牦牛肉樣品中細菌和真菌豐富度和多樣性呈先增后降的趨勢。高海拔生態系統由于其低降水量、低氣溫和低氣壓等特點,影響其環境微生物多樣性[17-18],說明海拔對風干牦牛肉中微生物豐度和多樣性存在一定的影響。有研究表明,隨著海拔高度的升高,曲拉中細菌和真菌群落豐富度和多樣性逐漸降低[19],這與本研究結果存在差異,這可能與風干牦牛肉制作環境和安全衛生條件等因素有關。

表3 樣品alpha多樣性指數Table 3 Alpha diversity index of samples

2.3 門分類水平樣品微生物群落組成

在門分類水平,不同樣品微生物群落結構組成見圖3。由圖3-A可知,不同地區風干牦牛肉樣品相對豐度前10的細菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、埃普西隆桿菌門(Epsilonbacteraeota)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、藍菌門(Cyanobacteria)、髕骨細菌門(Patescibacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),其中厚壁菌門、變形菌門和放線菌門是不同地區風干牦牛肉樣品中的主要優勢細菌門,其平均相對豐度占比90.79%。變形菌門(44.58%)是LZ樣品中的第一優勢菌門,其次是厚壁菌門(37.04%)和放線菌門(10.14%),而LS、SN、RKZ和NQ樣品中的第一優勢菌門均是厚壁菌門,其相對豐度分別為41.84%、39.85%,42.75%和41.10%,其次是變形菌門(相對豐度分別為37.50%,38.73%,33.85%和39.73%)和放線菌門(相對豐度分別為11.80%,11.53%,12.40%和11.12%)。不同樣品中的優勢菌門基本相同,但相對豐度略有差異。有研究表明,厚壁菌門、變形菌門和放線菌是不同腌制臘肉[11]、傳統自然發酵酸肉[20]和風干肉[6]中的優勢菌門,這與本研究結果一致。弋凱鴿等[21]研究表明,青藏高原風干牦牛肉中的優勢細菌門是厚壁菌門和放線菌門,王俊鋼等[9]研究表明,變形菌門、厚壁菌門和藍細菌門是新疆傳統風干肉中的優勢細菌門,這與本研究結果存在差異,這可能與采樣點地理環境、海拔、加工衛生條件等因素有關。厚壁菌門中的革蘭氏陽性菌和變形菌門中的革蘭氏陰性菌是人體腸道內的優勢益生菌群,如厚壁菌門代謝產生的丁酸和變形菌門發酵產生的丙酸對人體健康十分重要[22-23],同時,厚壁菌門和變形菌門中也存在很多病原菌,如葡萄球菌、沙門氏菌、假單胞菌、霍亂弧菌和大腸桿菌等[9,24],這些病原菌對食品安全性具有潛在隱患,而厚壁菌門和變形菌門是不同樣品中的優勢菌群,因此,在某種程度上,傳統風干牦牛肉可能存在安全隱患。

A-細菌;B-真菌

由圖3-B可知,不同地區風干牦牛肉樣品中的真菌主要集中在毛霉菌門(Mucoromycota)、子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、捕蟲霉門(Zoopagomycota)和梳霉門(Kickxellomycota)這7個門,平均相對豐度占比93.80%,其中相對豐度﹥1%的真菌門有3個,分別是毛霉菌門、子囊菌門、擔子菌門。毛霉菌門是不同樣品中的第一優勢真菌門,其相對豐度為43.96%～63.61%,其次是子囊菌門(27.9%～41.00%)和擔子菌門(2.03%～8.96%)。有研究表明,子囊菌門和擔子菌門是四川傳統臘肉中的優勢菌門[10],被孢霉門、子囊菌門和擔子菌門是湘派鹵牛肉中的優勢菌門[25],新疆傳統風干肉中的優勢真菌是子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門[26],這與本研究結果差異較大。地理環境、氣候、海拔和原材料等因素可能是導致此差異的關鍵因素[11,19]。毛霉菌門中存在致腐和致病毛霉門真菌[27-28],這對食品安全存在潛在風險。西藏傳統風干牦牛肉中存在大量毛霉門真菌,因此須進一步研究風干牦牛肉中真菌特性以確定其安全性。

2.4 屬分類水平樣品微生物群落組成

在屬分類水平,20個樣品共檢測出1 151個細菌屬,相對豐度前20的細菌屬如圖4-A所示。不同樣品中相對豐度﹥1%的細菌屬有9個,分別是假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、Terasakiispira屬、Cobetia屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium_1)、鹽單胞菌(Halomonas)、弓形桿菌(Arcobacter)和鹽弧菌屬(Salinivibrio),平均相對豐度占比67.59%。假單胞菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬是不同樣品中的優勢菌屬,其相對豐度均在10%以上。雖然不同樣品中的主要優勢菌屬基本相同,但相對豐度存在差異。LZ、SN和NQ樣品中的第一優勢菌屬是假單胞菌屬,平均相對豐度占比23.74%,其次是乳桿菌屬(20.39%)和片球菌屬(12.11%),而LS和RKZ樣品中的第一優勢菌屬是乳桿菌屬,平均相對豐度占比21.62%,其次是假單胞菌屬(16.87%)和片球菌屬(12.65%),說明不同地區風干牦牛肉中細菌群落組成存在差異。有研究表明,發酵時間、地理環境、氣候、海拔和原材料等因素影響微生物群落組成[11,19,29],因此,這些因素可能是導致不同地區風干牦牛肉中微生物群落組成差異的原因。葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和乳桿菌屬是不同臘肉樣品中的優勢細菌屬[11],嗜冷桿菌屬和環絲菌屬是新疆傳統風干肉中的優勢細菌屬[9],乳酸桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬和節桿菌屬(Arthrobacter)是青藏高原風干牦牛肉中的優勢細菌屬[21],這與本研究結果差異較大。取樣地生態環境、原材料和加工方式等因素可能是導致微生物群落組成差異的關鍵因素。乳酸菌被認為是食品發酵中的安全菌株,而其他菌屬可能對食品安全存在隱患,如假單胞菌、嗜冷桿菌、不動桿菌等屬于條件致病菌[6,30-31],而本研究樣品中存在大量條件致病菌,嚴重影響傳統風干牦牛肉的食用安全性。

A-細菌;B-真菌

20個樣品中共檢測出306個真菌屬,相對豐度前20的真菌屬如圖4-B所示。LZ樣品的優勢真菌屬(相對豐度>1%)為毛霉屬(Mucor)(26.22%)、根霉屬(Rhizopus)(20.38%)、假散囊菌屬(Pseudeurotium)(3.73%)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)(2.09%)和沙蜥屬(Saitozyma)(1.39%);LS樣品中的優勢真菌屬是根霉屬(47.32%)、沙蜥屬(2.02%)和鐮刀菌屬(Fusarium)(1.28%);根霉屬(43.77%)和沙蜥屬(2.06%)是SN樣品中的優勢真菌屬;根霉屬(41.26%)、毛霉屬(8.67%)、Tausonia屬(4.56%)、曲霉屬(Aspergillus)(1.84%)、擔子菌酵母屬(Naganishia)(1.09%)和威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)(1.08%)是RKZ樣品中的優勢真菌屬;根霉屬(56.84%)和曲霉菌屬(1.73%)是NQ樣品中的優勢真菌屬。不同樣品中主要優勢真菌屬組成及相對豐度差異較大。有研究表明,新疆風干肉中的優勢真菌屬是假絲酵母屬(Candida)、Mrakia屬和德巴利酵母屬(Debaryomyces)[26],曲霉屬、德巴利酵母屬和假絲酵母屬是四川傳統臘肉中的優勢真菌屬[10],這與本研究差異較大,說明地理環境、氣候、海拔和原材料等因素影響微生物群落組成。根霉屬和毛霉屬真菌能分泌多種酶類、有機酸和芳香的脂類物質[32],被廣泛用于食品發酵工業。霉菌和酵母菌在食品發酵過程中不僅能夠提升產品風味,還能抑制腐敗微生物的生長和過氧化物的生成,進而提升產品安全性和保質期[26]。不同地區風干牦牛肉中富含豐富的霉菌和一定數量的酵母菌,這可能對風干牦牛肉品質的形成有一定的影響。

2.5 Beta多樣性差異分析

為進一步比較不同樣品間微生物群落組成的差異性和相似性,對相對豐度前20的細菌和真菌屬進行熱圖聚類分析。由圖5-A可知,SN與NQ樣品間距離最近,與LZ樣品距離最遠,說明SN與NQ樣品間細菌群落組成相似,而LZ樣品與其他樣品細菌群落組成差異較大。不同樣品間細菌群落組成差異性與海拔間無明顯規律,說明海拔不是影響風干牦牛肉中細菌群落組成的關鍵因素。弋凱鴿等[21]研究表明,那曲與拉薩地區風干牦牛肉中細菌群落組成相似,而山南與日喀則地區風干牦牛肉中細菌群落組成相似,這與本研究結果存在差異,說明樣品采樣地環境影響風干牦牛肉中細菌群落結構組成。由圖5-B可知,RKZ和NQ樣品間距離最近,LS和SN樣品間距離最近,說明RKZ和NQ樣品間真菌群落組成相似,LS和SN樣品間真菌群落組成相似。不同樣品間真菌群落組成差異性與海拔間呈一定趨勢,說明海拔高度可能影響風干牦牛肉中真菌群落組成。

A-細菌;B-真菌

3 結論

20個樣品高通量測序后共獲得1 148 131條16S rRNA有效序列和1 490 806條ITS有效序列;在97%相似度水平下,樣品共獲得38 655個細菌OTUs和2 498個真菌OTUs;不同地區風干牦牛肉中微生物豐富度和多樣性隨海拔升高呈先增后降的趨勢;在門分類水平,不同地區風干牦牛肉樣品中的主要優勢菌門是厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、毛霉菌門、子囊菌門和擔子菌門;在屬分類水平,假單胞菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、根霉屬和毛霉屬是不同地區風干牦牛肉中的優勢菌屬,不同地區風干牦牛肉中細菌和真菌群落組成存在差異;熱圖聚類分析表明,LZ樣品與其他樣品微生物群落組成差異較大;不同地區風干牦牛肉中即存在功能性益生微生物菌群,又存在大量條件致病菌,這些致病菌具有一定的安全隱患。