不同體積分數乙醇對白酒中典型酯類物質在口腔中吸附和釋放過程的影響

趙騰飛,張璋,宋露露,胡智慧,唐佳代,龍亞飛

(茅臺學院 釀酒工程系,貴州 遵義,564507)

風味是影響食品質量和決定消費者選擇的關鍵因素之一。在飲食過程中,食品中風味物質先釋放至口腔,通過鼻咽由后鼻嗅途徑進入鼻腔,再與相對應的嗅覺受體細胞相互作用,從而產生風味感知[1]。因此,風味物質在口腔中的釋放過程對食品的最終風味感知有重要影響。

近年來,大量研究集中于解析風味物質的口腔釋放過程[2]。研究發現,除唾液[3]、口腔黏膜[4]、呼吸速率[5]等生理因素外,食品基質(乙醇體積分數、體系pH等)、風味物質的理化性質(油水分配系數、沸點等)也會影響風味物質在口腔中的釋放[2]。乙醇是酒精飲品的重要組成部分,乙醇體積分數會直接影響酒體的整體感知[6]。MUOZ-GONZLEZ等[7]考察了低乙醇濃度(0.5%、5%、10%,體積分數)對葡萄酒基質中丁酸乙酯、己酸乙酯、壬酸乙酯等6種酯類物質的口腔釋放量的影響,實驗發現乙醇體積分數的增加會促進丁酸乙酯、戊酸乙酯等logP值(油水分配系數)較低物質的釋放,同時也會抑制辛酸乙酯、癸酸乙酯等logP值較高物質的釋放。白酒作為我國獨具民族特色的蒸餾酒,其中含有非常豐富的風味物質[8-10],相比于葡萄酒,白酒酒精含量相對較高(30%～60%,體積分數),但是在高酒精度下,有關白酒風味物質口腔釋放過程的研究相對較少。

口腔頂空固相微萃取技術(oral headspace solid phase micro extraction,Oral-HS-SPME)是一種較為穩定和準確的分析口腔中風味物質的方法[4]。Oral-HS-SPME技術的原理是在品評員飲酒后,香氣物質在口腔內釋放,將SPME萃取針插入口腔中萃取釋放的香氣物質,之后,再結合GC-MS等儀器分析由萃取針解吸附出的香氣物質[4]。目前,Oral-HS-SPME技術主要應用于分析葡萄酒中的香氣物質[4,7,11],近兩年,YU等[12-13]優化了Oral-HS-SPME的條件參數,將Oral-HS-SPME技術結合全二維氣相色譜-質譜聯用儀應用于我國白酒中,分析了醬香型和濃香型白酒香氣物質在口腔中的釋放,解析了成品白酒中醇、醛、酸、酯等共91種香氣物質的釋放過程。然而成品白酒基質非常復雜,酒體乙醇體積分數、pH、不同種類化合物等因素都可能會影響香氣物質的釋放。因此,有必要在一個基質較為簡單、影響因素較少的體系中去進一步分析白酒風味物質的釋放規律。

酯類物質是酒類飲品最重要的一類香氣物質[14-17],為了分析高乙醇體積分數下酯類物質在口腔中的釋放過程,本實驗控制實驗參數,減少其他因素對酯類物質釋放的影響,以溶解于較高乙醇體積分數中的酯類物質為研究對象,應用Oral-HS-SPME技術分析不同體積分數乙醇對酯類物質在口腔中吸附和釋放過程的影響,研究結果有助于進一步認知香氣物質的口腔釋放機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗參考白酒酯類物質的相關研究[15,18-19],選出20種典型酯類物質進行實驗(表1)。所有酯類物質純度均高于97%、食品級乙醇(純度≥99%),上海安譜;2-辛醇(123-96-6,純度≥98%)、碳酸氫鈉、氯化鈣,上海國藥;純凈水,杭州哇哈哈。

表1 本實驗所用酯類物質及其相關理化性質Table 1 Physicochemical properties of the esters employed in this study

1.2 儀器與設備

6890 N-5977A氣相色譜-質譜聯用儀,美國安捷倫;固相微萃取手柄、DVB/CAR/PDMS三相SPME萃取頭,美國Supelco;磁力攪拌器,上海一恒儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 酯類混合酒樣的制備

根據實驗條件,將20種酯類物質溶解至不同體積分數(10%、30%、50%、70%)的乙醇水溶液中,所有混標酒樣中酯類物質的質量濃度均為5 mg/L,配制完成后置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 品評員的培訓

由于在本實驗中,待測酒樣需要經過品評員的口腔加工,因此在實驗起始階段,先要對品評員進行培訓,以確保實驗能夠準確進行。由于品評員的個人差異對風味物質在口腔中的吸附和釋放過程有一定影響[11],本實驗挑選3名長期從事感官品評實驗的品評員(2名女生,1名男生,年齡20～22歲)組成感官品評小組進行實驗。為了減少其他因素對實驗結果的影響,在實驗開始前2 h內,要求3位品評員不允許進食與吸煙;在開始實驗前15 min,要求3位品評員依次刷牙,使用稀碳酸氫鈉溶液和純凈水漱口;且在每次開始實驗前,重復告知品評員具體實驗流程。

1.3.3 Spit-off odorant measurement procedure(SOOM)分析方法

為了考察酯類物質在口腔黏膜上的吸附,本研究參考ESTEBAH-FERNNDEZ等[4]和BUETTNER等[20]建立的SOOM法并稍加修改。具體實驗流程為:品評員飲入5 mL溶解于50%乙醇水溶液中的酯類混標酒樣,不吞咽酒樣,使酒樣在口中回旋,保持15 s后吐出酒樣,收集吐出的酒樣。使用飽和氯化鈣溶液將收集到的酒樣定容至25 mL,處理后的酒樣置于-20 ℃冰箱備用。

初始酯類混標溶液中酯類物質的分析:取5 mL乙醇的體積分數分別為10%、30%、50%和70%酯類混標酒樣,同樣使用飽和氯化鈣溶液將其定容至25 mL,之后取10 mL,加入2-辛醇(使其最終質量濃度為200 μg/L)作為內標,裝入頂空瓶中進行頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)。吐出酒樣中酯類物質的分析:取已處理完成的品評員吐出酒樣10 mL,加入2-辛醇(使其最終質量濃度為200 μg/L)作為內標,裝入頂空瓶中進行HS-SPME。HS-SPME條件為:50 ℃預熱5 min后,使用磁力轉子攪拌萃取吸附50 min,萃取完成后,迅速將萃取針插入溫度為250 ℃的GC-MS進樣口解吸附5 min,最后進行GC-MS分析。在完成每次進樣分析后,需要對萃取頭清理10 min以避免風味物質在萃取頭上殘留。以上所有樣品均由3個品評員進行分析,且每個樣品分析3次,最后取9個實驗結果的平均值。

口腔黏膜對酯類物質吸附率的計算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:a前為初始酯類混標酒樣中各酯類的色譜峰面積;a后為品評員吐出酒樣中與吐前相對應的各酯類的色譜峰面積。

1.3.4 口腔頂空固相微萃取法(Oral-HS-SPME)

實驗所用Oral-HS-SPME方法參考PéREZ-JIM NEZé等[21]研究并加以改進。具體實驗流程為:品評員飲入標準酯類酒樣5 mL,不吞咽酒樣,使酒樣在口中回旋,保持15 s后吐出酒樣(該部分品評過程與前面所述SOOM方法中的品評過程相同);之后迅速屏住嘴巴正常呼吸,保持30 s后,將SPME三相萃取頭插入口中進行萃取,萃取過程中仍保持屏住嘴巴正常呼吸,萃取時間2 min;萃取完成后,迅速將萃取針插入溫度為250 ℃的GC-MS進樣口解吸附5 min,最后進行GC-MS分析。在完成每次進樣分析后,需要對萃取頭清理10 min以避免風味物質在萃取頭上殘留。

應用上述方法完成以下實驗:品評員分別飲入溶解于體積分數為10%、30%、50%、70%乙醇水溶液中酯類標準溶液5 mL,完成品評后(方法同上),吐出酒樣,之后屏住嘴巴正常呼吸,分別保持30 s、2 min、4 min后,進行Oral-HS-SPME結合GC-MS分析。以上所有樣品均由3個品評員進行分析,且每個樣品分析3次,最后取9個實驗結果的平均值。

1.3.5 GC-MS分析條件

色譜條件:VF-WAX色譜柱(60 m×250 μm×0.5 μm),進樣口溫度為250 ℃,不分流進樣,氮氣為載氣,流速1 mL/min,升溫程序:烘箱初始溫度50 ℃,保持2 min,以4 ℃/min速率升溫到180 ℃,然后以10 ℃/min升到240 ℃,保持5 min。

質譜條件:電子轟擊離子源,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,電離能量70 eV,掃描范圍m/z40～400,溶劑延遲5 min。

1.4 數據分析

使用EPIWEB4.1軟件計算酯類物質的油水分配系數(logP),使用Microsoft Office Excel 2010對數據進行皮爾森相關性分析和單因素顯著性差異分析(P<0.05);數據圖使用Origin 9制作,并使用Adobe Illustrator CS4對圖進行文字添加與修飾。

2 結果與分析

2.1 不同體積分數乙醇對酯類物質口腔吸附率的影響

當酒體飲入口中,口腔黏膜對酒體有一定的吸附作用,該吸附作用會影響風味物質在口腔中的駐留及釋放[11]。為了考查口腔黏膜在不同乙醇體積分數下對酯類物質的吸附,本實驗選出20種典型白酒中酯類物質(表1),將其分別溶解于10%、30%、50%和70%(體積分數)乙醇水溶液中配制成質量濃度為5 mg/L酯類混標酒樣。參考ESTEBAN-FERNNDEZ等[4]和BUETTNER等[20]的研究方法,通過分析由品評員品評后吐出酒樣中酯類物質的回收率,計算酯類物質的口腔吸附率(吸附率=100%-酯類回收率)。

實驗結果顯示(圖1),酯類混標酒樣在口中保持15 s后,溶解于10%乙醇水溶液中的20種酯類物質口腔吸附率較低(1.4%～22.9%),除乳酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯外,其他酯類物質在10%乙醇下的口腔吸附率均顯著低于它們相應溶解于30%、50%、70%乙醇水溶液的口腔吸附率(16.8%～76.7%);而溶解于30%、50%、70%乙醇水溶液中酯類物質(除癸酸乙酯)之間的口腔吸附率無顯著性差異。實驗表明,相較于溶解于10%的酯類物質,體積分數為30%的乙醇能夠顯著增加酯類物質的口腔吸附率(P<0.05)。

圖1 不同乙醇體積分數(10%、30%、50%、70%)口腔黏膜對酯類物質的吸附率

除以上理化作用外,乙醇也可能會通過生理作用影響口腔中酯類物質的代謝從而影響它們的口腔吸附率[22]。由于乙醇會抑制唾液中酯水解酶的酶活[23],降低了酯水解酶與長鏈酯類物質的相互作用,從而導致長鏈酯類物質在口腔中駐留減少。而本實驗中酯類物質的口腔吸附率隨乙醇體積分數提高而增加的實驗現象是理化作用與生理作用共同作用的結果,且理化作用是主導因素。

2.2 不同體積分數乙醇對酯類物質口腔釋放過程的影響

進入口腔中的酯類混標酒樣先被口腔黏膜吸附,繼而陸續釋放到口腔頂空中。為了考察酯類物質在不同體積分數乙醇(10%、30%、50%、70%)中的釋放過程,本實驗要求品評員在吐出混標酒樣后,迅速屏住嘴巴同時保持正常呼吸,讓酯類物質在口腔內自然釋放,并在30 s、2 min和4 min 3個釋放時間點進行Oral-HS-SPME結合GC-MS分析,檢測這些酯類物質在不同時間點的口腔釋放量。

實驗結果(圖2)顯示,質量濃度均為5 mg/L的酯類混標酒樣在經過品評吐出后,瞬時釋放(30 s)的20種酯類物質均可在口腔中被檢測到;隨著釋放時間的延長(2、4 min),溶解于不同體積分數乙醇水溶液中的20種酯類物質在口腔中的釋放量均呈現下降趨勢,但下降幅度具有一定差異。釋放時間為2 min時,溶解于10%、30%、50%、70%乙醇水溶液中的酯類物質,分別有12、13、11、5種物質的口腔釋放量較瞬時口腔釋放量(30 s)有顯著性降低;釋放時間為4 min時,除乙酸乙酯、乳酸乙酯這2個logP值最低的酯類物質外,其他酯類物質在4個體積分數的乙醇水溶液中的口腔釋放量較瞬時口腔釋放量(30 s)均顯著性降低(P<0.05)。

A-10%乙醇水溶液中的酯類混標酒樣;B-30%乙醇水溶液中的酯類混標酒樣;C-50%乙醇水溶液中的酯類混標酒樣; D-70%乙醇水溶液中的酯類混標酒樣

為了更好地分析乙醇對酯類物質口腔釋放量的影響,實驗對圖2中數據進行整理,比較了在相同釋放時間下溶解于不同乙醇體積分數中的20種酯類物質的口腔釋放量(圖3～圖4)。結果顯示,隨著乙醇體積分數的增加(10%～70%),20種酯類物質的瞬時(30 s)口腔釋放量具有不同的變化趨勢。乙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、乳酸乙酯這些logP值較小(-0.18～1.77)酯類物質的口腔釋放量有降低趨勢;丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯(1.85～2.26)無明顯變化規律;戊酸乙酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯等logP值較大(2.34～4.79)酯類物質的口腔釋放量顯著增加(P<0.05)。

圖3 駐留口腔中的酯類物質在不同乙醇體積分數(10%、30%、50%、70%)下的瞬間(30 s)口腔釋放量

A-釋放時間為2 min;B-釋放時間為4 min

之前BOELRIJK等[24]的研究顯示,在低乙醇體積分數(<10%)時,乙醇對乙酸乙酯(logP=0.73)和己酸乙酯(logP=2.83)的口腔釋放呈促進作用,但隨著乙醇體積分數的增加(10%～40%),促進作用逐步變為抑制作用,當抑制作用到達一定程度后,進而趨于穩定,但高體積分數乙醇對logP值相對較低的乙酸乙酯的最終抑制作用要高于對logP值相對較高己酸乙酯的抑制。結合MUOZ-GONZLEZ等[7]、BOELRIJK等[24]的研究和本實驗現象,實驗推測高體積分數乙醇對酯類物質的抑制作用可能具有以下規律:隨著乙醇體積分數的增加,其對酯類物質的抑制作用也會逐漸增加,當抑制作用增加至一定程度后進而趨于穩定。且高體積分數乙醇對酯類物質的最終抑制作用與它們的logP值有關,對logP較低酯類物質的抑制作用較強,對logP值較高酯類物質的抑制作用相對較弱。

同樣在本研究中,高體積分數乙醇(>10%)對logP值較小(-0.18～1.77)酯類物質瞬時(30 s)口腔釋放的抑制作用較強,且隨著乙醇體積分數的增加,其抑制效果也會逐漸增加;對于logP值較大(2.34～4.79)物質的抑制作用相對較弱且趨于穩定。同時,乙醇體積分數的增加也會增加酯類物質的口腔吸附率,即酯類物質在口腔中的駐留量會增加,因此,理論上它們的口腔釋放量也會相應增加。而實驗中20種酯類物質的實際口腔釋放量可能是以上2種因素競爭性作用所形成的結果。例如,對于乙酸乙酯、異丁酸乙酯等logP值較低的物質,乙醇對它們口腔釋放的抑制作用更強,且該抑制作用會隨著乙醇體積分數的增加而增強,所以,它們的口腔釋放量呈下降趨勢;而對于壬酸乙酯、癸酸乙酯等logP值較大的物質,乙醇對它們的抑制作用相對較弱且趨于穩定,所以,口腔駐留量的增加是它們口腔釋放量的增加的主要因素。此外,通過分析這些酯類物質的口腔吸附率與相應口腔釋放量的皮爾森相關系數(圖3),也間接驗證了以上觀點。

在釋放時間為2 min時(圖4-A),13種酯類物質的口腔釋放量隨乙醇體積分數的增加而呈現上升趨勢,同時溶解于70%乙醇水溶液中的9種酯類物質的口腔釋放量顯著高于其他乙醇體積分數(P<0.05)。MUOZ-GONZLEZ等[7]研究認為,酯類物質在口腔釋放過程中,乙醇體積分數的增加會改變口腔黏膜的表面張力,進一步影響酒體在口腔中的分布,便于酒體的分散,從而導致其釋放量的增加。同時,在酯類物質的釋放過程中,乙醇也可能會通過馬蘭戈尼效應(marangoni effect)增加風味物質的在口腔中的釋放。根據馬蘭戈尼效應,在酒體與口腔頂空界面,乙醇的揮發會導致酒體表面張力的提高,為了維持體系平衡,酒體中的乙醇分子會移動至酒體與口腔頂空界面來降低表面張力,而在乙醇移動的過程中,一些香氣物質也會隨乙醇移動至該界面,因此增加了它們釋放量。

在釋放時間為4 min時(圖4-B),在20種酯類物質中,有18種溶解于30%和50%乙醇水溶液中酯類物質的口腔釋放量高于溶解于10%和70%乙醇水溶液中的酯類。說明中等體積分數乙醇(30%～50%)能夠增加酯類物質的口腔滯留度。分析原因可能是乙醇體積分數的增加,導致它們在口腔中的駐留量增加,而相比于溶解于70%乙醇水溶液中的酯類,溶解于30%和50%乙醇水溶液中的酯類釋放速度相對緩慢,因此導致它們的口腔滯留度增加。而溶解于70%乙醇水溶液中的酯類,高體積分數乙醇加速了它們在口腔中的釋放(圖4-A),而溶解于30%、50%、70%乙醇水溶液中酯類物質的口腔駐留量并無較大差異(圖1),從而導致在4 min時,溶解于70%乙醇水溶液中酯類物質的口腔釋放量低于溶解于30%和50%乙醇水溶液中的酯類。

此外,本實驗發現不同體積分數乙醇對苯乙酸乙酯和苯丙酸乙酯的口腔吸附率和口腔釋放量的影響較小,而BOELRIJK等[24]研究發現乙醇體積分數的增加(2.5%～40%)對2,5-二甲基吡嗪在口腔中的釋放無明顯影響;由此推測乙醇對該類含芳香環的風味物質在口腔中的釋放量影響較小。

風味物質在口腔中的釋放是一個復雜的過程,除上述理化因素外,乙醇與唾液中酶類的相互作用也可能影響風味物質在口腔中的釋放[16,25],后續實驗會從該方面分析乙醇對風味物質口腔釋放過程的影響。

3 結論

本研究以溶解于不同體積分數(10%、30%、50%、70%)乙醇水溶液中的20種白酒典型酯類物質為研究對象,考察乙醇對它們在口腔中的吸附和釋放過程(30 s、2 min、4 min)的影響。研究表明,a)隨著乙醇體積分數的增加(10%～70%),17種酯類物質在30%乙醇水溶液中的口腔吸附率顯著高于溶于10%乙醇水溶液中的酯類(P<0.05);b)在酯類物質的口腔釋放過程中,乙醇體積分數的增加,會降低logP值(油水分配系數)較低酯類物質的瞬時口腔釋放量(30 s),增加logP值較高物質的瞬時口腔釋放量,推測該實驗現象是高體積分數乙醇對logP值不同酯類物質的抑制效果存在差異和酯類物質在口腔中駐留量的增加兩者競爭性作用的結果;c)隨著釋放時間的延長,在釋放時間為2 min時,體積分數為70%的乙醇能夠促進酯類物在口腔中的釋放;釋放時間為4 min時,30%和50%的乙醇能夠增加酯類物質的口腔滯留度。此外,酯類物質在口腔釋放的過程中,乙醇與唾液中酶類的相互作用也可能影響風味物質在口腔中的釋放,后續實驗會從該方面分析乙醇對風味物質口腔釋放過程的影響。