金花茶花活性組分成分分析及抗炎作用

吳海英,黃倩倩,李詩華,秦小明,2*,鐘賽意,2,陳建平,2

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東 湛江,524088)

2(廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心,廣東 湛江,524088)

金花茶(CamellianitidissimaChi)具有獨特的金黃色蠟質花朵及其豐富的天然活性成分,被賦予植物界大熊貓”、“茶族皇后”和“國寶神茶”等美稱。目前,金花茶主要研究方向是花色基因保護、栽培技術、植物系分類等,而化學成分、藥理作用及機制研究較少[1-3]。在廣西民間,金花茶一直被用做傳統中草藥,其葉和花用于治療咽喉炎、高血壓、痢疾、預防腫瘤、便血、預防腫瘤疾病[4]。而炎癥是一種機體對自身的保護性反應,可以抵抗、削弱或者清除機體的有害物質,同時清除受損的組織,促進新組織的生成。因此,炎癥是機體的一種自我防御保護機制[5]?，F代臨床醫學多用抗生素或者甾體類藥物來治療過度炎癥引起的各類疾病[6],這些藥物在起到治療的同時會給機體帶來毒副作用,如胃潰瘍、腎衰竭等,長期使用還會引起耐藥性[7]。因此,從天然花卉植物中研發出具有抗炎作用的保健食品或者藥物具有重要意義。

目前,對金花茶的抗炎作用研究主要是葉片,溫靜等[8]采用金花茶葉提取物不同萃取部位對脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)導致的腹腔巨噬細胞炎癥對的抗炎保護作用研究,發現正丁醇萃取部位的抗炎活性最強,猜測主要活性成分為三萜類物質;曾英港等[9]發現金花茶葉提取物對小鼠耳腫脹有抑制作用(P<0.05),其抗炎作用可能是通過減少炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A分泌而實現,但對金花茶花的抗炎作用研究較少。有研究表明含有豐富的黃酮類化合物的花卉植物能夠起到良好的抗氧化及抗炎作用[10],在實驗室前期研究中發現金花茶花含有豐富的黃酮類化合物,并有良好的抗氧化作用。因此,本研究采用70%(體積分數)乙醇溶液對金花茶花進行超聲提取,并對提取物進行分離富集,測定不同組分中總黃酮、總糖、總酚、總皂苷的含量,并基于二甲苯致小鼠耳腫脹實驗模型,考察不同組分的抗炎作用,以期為金花茶花活性成分的分離及天然植物抗炎物質的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康SPF級4周齡雄性昆明小鼠,購于廣州市謹為生物科技有限公司,動物許可證號SYXK (京)2019-0010,飼養溫度為22～26 ℃,濕度為50%～60%,光周期為12 h明暗交替,喂以C60輻照維持飼料和蒸餾水。

金花茶花選購自廣西防城港市嫦龍金花茶種植園,為廣西防城港市普通金花茶花,經過干燥處理,室溫下貯藏;甲酸、乙醇、濃硫酸、苯酚、碳酸鈉、氫氧化鈉,國藥控股股份有限公司;亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁,麥克林有限公司;大孔樹脂XAD1600、福林酚顯色劑、沒食子酸標準品(純度≥95%)、蘆丁標準品(純度≥95%)、葡萄糖標準品(純度≥98%),上海源葉生物科技有限公司;二甲苯,西隴科學股份有限公司;吲哚美辛片(批號:20220202),上海金不換蘭考制藥有限公司;小鼠白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒,江蘇酶免實業有限公司;以上試劑除非特別聲明,均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-500DB數控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;HH-S4數顯恒溫水浴鍋,金壇市博朗儀器制造有限公司;Lynx6000高速落地離心機、Varioskan Flash多功能酶標儀,美國賽默飛世爾科技有限公司;N-1100V-W旋轉蒸發儀、FDU-1110冷凍干燥機,東京理化器械株式會社;Cary 100紫外可見光分光光度計,美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 金花茶花提取物及分離組分制備

金花茶花的超聲輔助提取工藝參照本實驗室方法[11]并略加修改。金花茶花提取物提取條件:金花茶花粉末按照料液比1∶10(g∶mL)、70%(體積分數)乙醇溶液,在60 ℃浸提30 min后,在超聲功率為300 W、溫度60 ℃下提取30 min后,在8 000 r/min下離心20 min,收集上清液,濾渣按照上述步驟再提取1次。合并2次濾液,在45 ℃旋轉蒸發濃縮,并冷凍干燥后得到金花茶花提取物(CamellianitidissimaChi flower extract,CNFE)。

金花茶花提取物的分離富集根據本實驗室前期研究[12]并略加修改。將金花茶花提取物溶解于水中,配成40 mg/mL的溶液后,經3 000 r/min,離心10 min,取上清液置于處理好的XAD1600型大孔樹脂柱上(8.0 cm×60 cm),依次用0、30%、70%、95%(體積分數)乙醇溶液進行梯度洗脫,收集每個組分進行減壓濃縮后冷凍干燥即得水洗組(CNFE.A)、30%乙醇組分(CNFE.B)、70%乙醇組分CNFE.C)、95%乙醇組分(CNFE.D),用于后續實驗。

1.3.2 金花茶花提取物及分離組分的活性成分分析

1.3.2.1 總黃酮含量測定

采用NaNO2-Al(NO3)3法[13]測定各組分中總黃酮的含量,在510 nm下測定反應后的吸光度,代入蘆丁標準曲線方程y=1.008 5x+0.007 2(R2=0.998 1)計算黃酮含量,并表示為蘆丁g/100 g各組分。

1.3.2.2 總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[14]并略加修改測定各組分中總糖的含量。在490 nm下測定反應后的吸光度,代入葡萄糖標準曲線方程y=11.982x-0.013 5(R2=0.997 8)計算總糖含量,并表示為葡萄糖g/100 g各組分。

1.3.2.3 總酚含量測定

采用福林-酚比色法[15]并略加修改測定各組分中總酚的含量;在765 nm下測定反應后的吸光度,代入沒食子酸標準曲線方程y=12.03x+0.016 9(R2=0.997 5)計算總酚含量,并表示為沒食子酸g/100 g各組分。

1.3.2.4 總皂苷含量測定

采用香草醛-冰乙酸法[16]并略加修改測定各組分中總皂苷的含量。在545 nm下測定反應后的吸光度,代入齊墩果酸標準曲線方程y=21.207x-0.008 4(R2=0.997 4)計算總皂苷含量,并表示為齊墩果酸g/100 g各組分。

1.3.3 金花茶花提取物及分離組分的抗炎作用

1.3.3.1 實驗動物分組及給藥

84只4周齡SPF級昆明小鼠購回后適應性喂養7 d,飼養溫度為25 ℃,相對濕度為50%。將小鼠隨機分組,為模型組(Model)和陽性對照(吲哚美辛, Indomethacin)組,實驗組分別為CNFE組、CNEF.A組、CNFE.B組、CNFE.C組、CNFE.D組。根據預實驗結果,各實驗組按1.0 g/(kg·d)劑量灌胃,陽性組按10 mg/(kg·d)劑量給藥,模型組灌胃等體積蒸餾水,每天1次,連續7 d。

1.3.3.2 二甲苯誘導小鼠急性耳腫脹實驗

在最后一次給藥1 h后,在各組小鼠的右耳均勻涂抹二甲苯50 μL致炎[17],左耳均不涂抹二甲苯以作對照,30 min后,依次頸椎脫臼處死小鼠,沿耳廓基線剪下其雙耳,用8 mm打孔器在雙耳的相同部位進行打孔,得到大小一樣的耳朵組織,立即進行稱重、記錄,并分別按公式(1)、公式(2)計算耳腫脹度和耳腫脹抑制率:

耳腫脹度=右耳片質量-左耳片質量

(1)

耳腫脹抑制率/%=

(2)

1.3.3.3 耳朵組織病理學檢查

耳片稱重后,將右耳片用4%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片,進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,顯微鏡下觀察各組小鼠耳組織病理學變化。

1.3.3.4 血清中IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α的測定

小鼠摘眼球取血,用1.5 mL離心管收集,室溫血液自然凝固20 min, 3 000 r/min離心20 min, 收集上清,用酶聯免疫吸附法(ELISA法)測定小鼠血清中IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α。具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計方法

采用SPSS Statistics 26.0軟件進行統計分析處理,并用GraphPad Prism 8.0作圖;計量數據資料用x±s表示,組間比較采用t檢驗,多組之間的數據比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 金花茶花提取物及分離組分活性成分分析

如圖1所示,CNFE呈棕黃色粉末,帶有獨特的清新花香味,室溫放置會受潮;CNFE.A呈金黃色濃稠液體,帶有麥芽糖香氣,遇冷變硬,遇熱變軟;CNFE.B帶細閃淺棕色粉末,具有淡淡的植物花香,質地輕盈;CNFE.C帶細閃棕黃色粉末,帶有微微甘澀的花香味,質地較輕;CNFE.D呈淡黃色粉末,帶有絲絲清涼的甘草味,質地輕柔、綿軟。

a-CNFE;b-CNFE.A;c-CNFE.B;d-CNFE.C;d-CNFE.D

金花茶花含有豐富的黃酮、皂苷、多酚等多種生物活性物質。由表1可知,金花茶花提取物中活性成分主要是黃酮類化合物和糖類化合物,含量分別為(37.20±4.70) g/100 g和(34.97±4.30) g/100 g,其次是酚類化合物。該結果與吳清孝[18]的測定結果相差不大,但采用超聲輔助提取可以減少提取次數、縮短提取時間以及減少乙醇使用量。CNFE經過XAD1600大孔樹脂分離后,CNFE.A主要是糖類化合物,含量為(68.11±2.61) g/100 g,其原因是糖類物質在水溶液中的溶解性優于乙醇溶液;活性成分主要是集中在CNFE.B和CNFE.C,均以黃酮類居多,含量分別為(263.7±10.62) g/100 g、(157.57±14.12) g/100 g,其次是酚類化合物。

表1 金花茶花提取物及分離組分活性成分含量Table 1 Content of active ingredients of of the extracts and isolated fractions of Camellia nitidissima Chi flower

2.2 金花茶花提取物及分離組分的抗炎活性比較

2.2.1 金花茶花提取物及分離組分對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

實驗期間,各實驗組小鼠狀態與實驗前無差別,飲食飲水量基本穩定,沒有出現異常精神狀態或死亡,各組小鼠體重增長沒有顯著性差異。由表2可知,與Model組相比,CNFE.A組無統計學差異,表明其對小鼠耳腫脹無抑制作用;CNFE組、CNFE.B組、CNFE.C組、CNFE.D組對二甲苯致小鼠耳腫脹均有顯著的抑制作用,抑制率分別為34.01%、61.79%、43.71%、42.22%。其中,CNFE.B組與Model組比較有極為顯著性差異(P<0.01),其耳腫脹抑制率比Indomethacin組(46.78%)還高15%。表明CNFE對小鼠耳腫脹具有一定的抑制作用,經過分離后,除CNFE.A組對耳腫脹小鼠無抑制作用外,CNFE.B組、CNFE.C組、CNFE.D組的抑制作用均增強,以CNFE.B組抑制率為最高。張震平[19]測得石榴花黃酮粗提物中黃酮含量約28%,其中高劑量組(1 800 mg/kg)對小鼠耳腫脹抑制率32.93%。

表2 金花茶花提取物及分離組分對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響Table 2 Effects of the extracts and isolated fractions of Camellia nitidissima Chi flower on xylene-induced ear swelling in mice

2.2.2 金花茶花提取物及分離組分對耳腫脹小鼠耳朵形態及組織病理學影響

由圖2可知,Model組的右耳毛細血管清晰可見,耳朵腫大、增厚,腫脹程度較其他實驗組明顯。與Model組相比,Indomethacin組和CNFE.B組、CNFE.C組均有明顯降低毛細血管的通透性、耳朵腫大。二甲苯致小鼠耳腫脹模型因其周期短、操作簡單、模型穩定等優點,常用來評價一些合成化合物和植物有效成分的抗炎活性,二甲苯為無色澄清液體,涂抹于小鼠耳廓后,由于其可引起組胺、激肽等炎癥介質的釋放,可導致局部毛細血管通透性增加及炎癥細胞浸潤,從而造成耳廓急性炎癥[20-21]。對小鼠涂抹二甲苯后,小鼠耳朵在短時間內毛細血管的通透性增強、清晰可見,耳朵腫大、肥大、增厚,小鼠撓耳朵動作次數增加,右耳豎立、焦躁不安。

a-Indomethacin組;b-CNFE組;c-CNFE.A組;d-Model組; e-CNFE.B組;f-CNFE.C組;g-CNFE.D組

金花茶花提取物及分離組分對耳腫脹小鼠的組織病理學影響如圖3所示。Model組棘層增厚,耳軟骨與皮下結締組織被破壞,間隙增寬,橫紋肌纖維離散斷裂,淋巴細胞、嗜酸性粒細胞大量浸潤;與Model組相比,CNFE組可以減輕棘層增厚程度、炎癥細胞的浸潤;CNFE.A組與Model組病理學觀察最為相近,表明其沒有起到明顯改善小鼠耳腫脹的作用,與2.2.1節的結果保持一致;Indomethacin組、CNFE.B組腫脹程度最輕,棘層肥厚不明顯,有少量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤,耳軟骨與皮下結締組織輕微破壞,橫紋肌纖維未斷裂;CNFE.C組、CNFE.D組腫脹程度均有減輕,炎性細胞浸潤減少,表明CNFE組、CNFE.B組、CNFE.C組、CNFE.D組都具有一定的抗炎效果,以CNFE.B組為最優。

a-Indomethacin組;b-CNFE組;c-CNFE.A組;d-Model組;e-CNFE.B組;f-CNFE.C組;g-CNFE.D組 A-棘層;B-耳軟骨;C-橫紋肌纖維;D-淋巴細胞

2.2.3 金花茶花提取物及分離組分對耳腫脹小鼠血清中細胞因子水平影響

如圖4所示,與Model組相比,CNFE能夠降低血清中IL-1β、TNF-α的水平(P<0.05),但對IL-10、IL-6因子的分泌量沒有影響;CNFE.A組和CNFE.C組可以提高抗炎因子IL-10的分泌量(P<0.05,P<0.01);Indomethacin組和CNFE.B組能夠顯著地降低小鼠體內的TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的含量,并提高IL-10的分泌量(P<0.05,P<0.01),可有效地降低炎癥的發生;CNFE.C組和CNFE.D組顯著降低了IL-1β的分泌量(P<0.05,P<0.01)。這可能由于金花茶花提取物及分離組分含有的物質不一樣,起到抗炎作用的機制通路不一致,造成對不同的炎癥因子的響應不同。在炎癥發生過程中相關免疫細胞會分泌各種炎癥介質,一類為促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6等,一類是抗炎因子如IL-10、IL-4。TNF-α是炎癥發生網絡中關鍵因子,可以促使IL-1β、IL-6分泌增加;IL-1β可以調控炎癥相關通路、趨化免疫細胞,引起發熱、炎癥加重。因此IL-1β是調控人體炎癥網絡中關鍵介質之一;IL-6是組織受損時迅速而短暫地產生的物質,在炎癥早期可以通過抑制巨噬細胞產生白細胞介素和腫瘤壞死因子從而起到抗炎保護作用,在急性和慢性炎癥中均起著關鍵作用;IL-10是一種多功能的抗炎因子,其可以抑制NF-κB通路的磷酸化,降低炎癥介質的分泌從而發揮作用。這些介質在炎癥前期可以起到消除外來病原體和修復受損的組織器官,隨著炎癥介質的分泌過量就會對各個器官組織產生破壞性的影響,從而導致疾病的發生[22-24]。

因而,某一種物質能夠抑制生物體TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細胞因子產生和提高抗炎因子IL-10的分泌,均具有一定的抗炎作用。因此,CNFE發揮抗炎作用和其機理可能與下調體內炎癥因子的分泌量和上調IL-10抗炎因子的含量有一定的關聯性,在一定程度上能夠抑制炎癥因子的惡性分泌循環,防止受損組織進一步損傷。結合耳腫脹抑制率以及耳朵組織病理學觀察可得5個組分中,CNFE.B為最優抗炎組分。

3 結論

金花茶花提取物能夠有效抑制二甲苯致小鼠耳腫脹程度,具有良好抗炎作用,經大孔樹脂分離后,活性成分主要集中在CNEF.B,以黃酮類化合物居多,且其抗炎作用為最佳,其抗炎機制可能與下調體內TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的分泌量和上調IL-10炎癥因子的含量有關。