沙蠶運動飲料的制備及其對小鼠運動耐力的影響

朱國萍,陳自豪,葉寧

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東 湛江,524088)

2(廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室,國家貝類加工 技術研發分中心(湛江),南海生物資源開發與利用協同創新中心,廣東 湛江,524088)

3(遂溪騰飛生物科技有限公司,廣東 遂溪,524300)

4(廣東海洋大學 水產學院,廣東 湛江,524088)

人在運動過程中伴隨著體內水分、碳水化合物、電解質等物質的流失,會在運動后產生疲勞的感覺。運動后疲勞的產生與體內產生過量的自由基有關。在劇烈運動時,人體體內生成的大量自由基導致體內抗氧化與氧化的平衡穩態被破壞[1-2],引起肝臟和骨骼肌線粒體發生脂質過氧化損傷,破壞生物膜正常功能,導致肌肉工作能力下降[3-4]。為了減輕運動后的疲勞,通過補充外源性抗氧化劑可減少機體的氧化損傷,減輕運動后的疲勞。近年的研究發現,動植物來源的一些活性肽具有良好的抗氧化活性及抗疲勞功效[5-8],安全性高,穩定性良好,是制備運動飲料的理想原料。

沙蠶俗稱海蟲、海蜈蚣等,是一種食療兼優的藥膳[9]。近年的研究發現雙齒圍沙蠶的超高壓提取物[5]及酶解產物(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶)均具有良好的DPPH自由基、超氧陰離子自由基、及羥自由基清除作用,具有很強的抗氧化活性;且雙齒圍沙蠶酶解產物的小分子肽得率較高[10],是一種制備小肽運動飲料的理想原料,因此本研究擬利用湛江地區養殖的雙齒圍沙蠶為實驗原料,以低于5 kDa的堿性蛋白酶酶解產物作為目標肽段,進行沙蠶運動飲料的研制,并探究沙蠶運動飲料的體內抗疲勞功效,為雙齒圍沙蠶功效食品的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雙齒圍沙蠶,遂溪騰飛生物科技有限公司;羅漢果多糖,河南天宸生物科技有限公司;安琪酵母,安琪酵母發展有限公司;白砂糖、檸檬,廣東海洋大學商中小賣部;氫氧化鈉、堿性蛋白酶、無水乙醇、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉(以上均為分析純)、硝酸(優級純),廣東光華科技股份有限公司;DPPH,廣州市齊云生物科技有限公司;平板計數培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養基,北京陸橋技術股份有限公司;尿素氮、乳酸、肝糖原試劑盒,南京建成生物工程研究所;昆明小鼠,廣西醫科大學。

1.2 儀器與設備

FM-100雪花制冰機,寧波新芝生物科技股份有限公司;BM255攪拌機,廣東美的精品電器制造有限公司;BSA124S-CW萬分之一電子天平,賽多利斯科學儀器北京有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋,上海梅香儀器有限公司;AUY220電子天平、UV-2550紫外分光光度計,日本島津公司;CR22GⅡ高速冷凍離心機,日本日立公司;LD-50G-D超純水機,重慶利迪實驗儀器設備有限公司;DHG-9240A電熱鼓風干燥箱,上海-恒科學儀器有限公司;SKY-1102C搖床,SUKUN;PHS-3C pH計,上海精密科技有限公司;YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海博訊實業有限公司;Mini pellicon超濾裝置,美國Minipore。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗原料的預處理

新鮮沙蠶勻漿后以料水比為1∶5(g∶mL)的比例加水,按3 000 U/g原料比例加入堿性蛋白酶后調節pH至8.5,于搖床中50 ℃水溫酶解7 h后,沸水浴滅酶10 min,高速離心機8 000 r/min離心20 min后取上清液,依次過8 kDa與5 kDa的分子質量超濾膜,所獲得的透過5 kDa超濾膜的小于5 kDa的沙蠶酶解產物即為沙蠶運動飲料的原料。

1.3.2 沙蠶運動飲料輔料的確定

參考GB 15266—2009《運動飲料》,篩選幾種沙蠶運動飲料的輔料以及電解質種類,測定添加輔料1[小于5 kDa的沙蠶酶解產物50%、酵母0.08%、羅漢果多糖0.02%、白砂糖5%、檸檬汁1.2%、氯化鈉0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸二氫鈉0.1%(均為質量分數)和水補足余量]、輔料2[小于5 kDa的沙蠶酶解產物50%、羅漢果多糖0.02%(均為質量分數)和水補足余量]和不添加輔料[小于5 kDa的沙蠶酶解產物50%(質量分數)和水補足余量]對DPPH自由基清除作用的影響。

1.3.3 沙蠶運動飲料殺菌條件的確定

參考飲料殺菌的方法篩選3種殺菌方法:

a)巴氏殺菌:溫度為80～85 ℃,殺菌時間30 min;

b)煮沸殺菌:溫度為95～100 ℃,殺菌時間為20 min;

c)高壓蒸汽滅菌:壓力103 kPa,溫度為121 ℃,殺菌時間為15 min。

將配制好的飲料灌裝排氣后分別采用以上方法殺菌,殺菌后的飲料分別檢測其對DPPH自由基的清除能力及其殺菌效果,從而確定最優的殺菌條件。

1.3.4 小于5 kDa的沙蠶酶解產物添加量的確定

在其他輔料添加量不變的情況下(白砂糖5%、羅漢果多糖0.02%、檸檬汁1.2%、氯化鈉0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸二氫鈉0.1%,均為質量分數),添加不同量的小于5 kDa沙蠶酶解產物(35%、40%、45%、50%,質量分數)配制飲料,水補充余量,配制好的飲料灌裝排氣后采用高壓蒸汽滅菌后分別檢測其對DPPH自由基的清除能力。

1.3.5 沙蠶運動飲料口感的確定

參考尤久勇[11]的實驗方法,篩選來自不同人群的15個人設計正交試驗進行飲料調試,以10分制按表1所示的評分標準確定沙蠶酶解產物、糖和酸的添加量。

表1 感官評定指標Table 1 Organoleptic evaluation index

1.3.6 DPPH自由基清除能力的確定

采用比色法測定DPPH自由基的清除作用[12]。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的樣品溶液,蒸餾水補足至1 mL,加入3 mL DPPH溶液,搖勻靜置20 min后,8 000 r/min離心10 min,取上清液于517 nm處測定其吸光度,DPPH自由基清除率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0是DPPH空白對照組,即0 mL樣品管的吸光度;Ai為其余樣品管的吸光值。

計算出DPPH自由基清除率后再利用IC50軟件計算出各樣品的IC50值。

1.3.7 理化性質的檢測

可溶性固形物按GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》規定的方法(20 ℃時折光計法)測定,鉀含量、鈉含量采用火焰原子吸收光譜法按GB 5009.91—2017《食品安全國家標準 食品中鉀、鈉的測定》測定。

1.3.8 微生物指標的檢測

菌落總數的檢驗方法參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》;取樣方法參照GB 4789.1—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》;大腸菌群數的檢驗方法參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》中的平板計數法;霉菌、酵母的檢測方法參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》。

1.3.9 抗疲勞功效的研究

1.3.9.1 小鼠的飼養及分組

小鼠適應5 d后,進行適應性游泳訓練,剔除游泳能力特強或者游泳能力特弱的小鼠后將小鼠隨機分成陰性對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組5組,每組小鼠16只。

1.3.9.2 灌喂

每天灌喂一次。陰性對照組以蒸餾水灌喂,每次灌喂劑量為0.3 mL/10 g體重;陽性對照組以紅牛飲料灌喂,每次灌喂劑量為0.3 mL/10 g;低劑量組、中劑量組、高劑量組均以沙蠶運動飲料進行灌喂,灌喂劑量分別為0.2 mL/10 g體重、0.3 mL/10 g體重、0.4 mL/10 g體重,連續灌喂30 d。

1.3.9.3 小鼠游泳訓練

灌喂完成1～2 h后讓小鼠在100 cm×50 cm×60 cm的泳池中進行游泳訓練,水溫保持在25 ℃,游泳時間60 min左右后逐漸加強至90 min,訓練完成后用毛巾將小鼠擦干。每周2次,訓練至第30天。

1.3.9.4 力竭游泳

飼養灌喂30 d后進行小鼠負重游泳實驗,將被選的8只實驗小鼠尾尖綁上小鼠體重5%的鉛墜,在灌喂30 min后按批次投入游泳箱中并驅使小鼠不停的游動,且水溫保持在30 ℃,直至小鼠沉入水中5.0 s不能浮出水面即可判斷為力竭[13]。記錄小鼠游泳力竭的時間和序號。

1.3.9.5 血液、肝臟采集

飼養灌喂30 d后進行小鼠血樣及肌肉的采集。小鼠灌喂30 min后按批次放入游泳池中并驅趕使小鼠不停地游泳,水溫保持在25 ℃,每組游泳90 min后將小鼠身體擦干立即進行眼球取血,3 000 r/min離心10 min進行血清分離,用于血清尿素氮、血乳酸測定,并解剖小鼠采集完整肝臟,用錫紙包裹放入-80 ℃超低溫冰箱保存備用,用于測定肝糖原[13]。

1.4 數據統計分析

所有實驗至少重復3次,數據以平均數±標準差表示,采用SPSS 19.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行統計學分析,GraphPad Prism6進行繪圖。參數數據的分析采用Tukey秩后檢驗進行顯著性分析(單因素方差分析);非參數數據采用bonferroni校正后的Wilcoxon-Mann-Whitney U檢驗進行顯著性分析(Kruskal-Wallis檢驗),P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 輔料對DPPH自由基清除作用的影響

在沒有滅菌情況下,測定添加輔料1(小于5 kDa的沙蠶超濾組分50%、酵母0.08%、羅漢果多糖0.02%、白砂糖5%、檸檬汁1.2%、氯化鈉0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸二氫鈉0.1%和水補足余量)、添加輔料2(小于5 kDa的沙蠶超濾組分50%、羅漢果多糖0.02%和水補足余量)和不添加輔料(小于5 kDa的沙蠶超濾組分50%和水補足余量)對DPPH自由基清除作用的影響,結果如圖1所示,添加輔料不會抑制沙蠶原料清除DPPH自由基的活性,反而增強了清除自由基的能力,同時也證明了羅漢果多糖是輔料中的活性物質之一。

圖1 輔料對DPPH自由基清除作用的影響

2.2 滅菌方式對沙蠶運動飲料的DPPH自由基清除作用的影響

為了了解不同的滅菌方式對飲料的DPPH自由基清除作用的影響,選擇了3種不同的滅菌方式(巴氏殺菌:溫度為80～85 ℃,殺菌時間30 min;煮沸殺菌:溫度為95～100 ℃,殺菌時間為20 min;高壓蒸汽滅菌:壓力121 kPa,溫度為121 ℃,殺菌時間為15 min)與未滅菌的飲料進行DPPH自由基清除作用的對比,結果如圖2所示,3種滅菌方式對沙蠶飲料滅菌后其DPPH自由基清除率均顯著提高,其中高壓蒸汽滅菌(121 ℃,15 min)后沙蠶飲料DPPH自由基清除效果最好。由此確定沙蠶運動飲料的滅菌方式為高壓蒸汽滅菌(121 ℃,15 min)。

圖2 不同滅菌方式對DPPH自由基清除作用的影響

2.3 小于5 kDa的沙蠶酶解產物添加量對沙蠶運動飲料DPPH自由基清除作用的影響

沙蠶飲料中小于5 kDa的沙蠶酶解產物的添加量對沙蠶運動飲料DPPH自由基清除作用的影響如圖3所示,添加小于5 kDa的沙蠶酶解產物的濃度為35%～45%時飲料的DPPH自由基清除作用呈現出隨添加量的增加而增強的趨勢,添加量為45%～50%時飲料的DPPH自由基清除作用變化不大。

圖3 小于5 kDa的沙蠶酶解產物含量對DPPH自由基 清除作用的影響

2.4 飲料調試正交試驗

對沙蠶運動飲料的主料(小于5 kDa的沙蠶酶解產物)和影響口感的部分輔料(白砂糖、羅漢果多糖、檸檬汁)的含量進行篩選,采用正交試驗,具體方案如表2所示,以確定其對飲料口感的影響。由表3正交試驗結果可以看出,沙蠶運動飲料主料和部分輔料的最佳組合水平為6號(A2B2C1D4),即沙蠶酶解產物添加量40%、白砂糖添加5%、羅漢果多糖添加0.02%、檸檬汁添加1.2%。從Rj值可看出影響飲料感官的因素主要為白砂糖,其次是沙蠶酶解產物,最后是檸檬汁。確定沙蠶運動飲料主料及部分影響口感輔料的含量后,根據運動飲料國標中對電解質含量的要求,選用0.05%磷酸二氫鉀、0.1%磷酸二氫鈉與0.05%的NaCl作為電解質的主要來源,同時加入沙蠶酶解產物0.2%的酵母于37 ℃發酵30 min去除其中的腥味。對確定最佳配方的運動飲料進行抗氧化活性的測定,其DPPH自由基的清除率為94.1%,IC50值為0.8 mg/mL,具有良好的抗氧化活性。

表2 正交試驗方案Table 2 Orthogonal test

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test

2.5 沙蠶運動飲料對小鼠體重的影響

小鼠在灌喂沙蠶運動飲料期間的體重變化可反映運動飲料對其健康狀況的影響,小鼠體重過快增加或減少均不利于其健康。沙蠶運動飲料對小鼠體重的影響如表4所示,小鼠在灌喂周期內體重均呈平穩增長趨勢,各組間小鼠體重增加狀況不存在顯著性差異,結合在動物實驗期間小鼠沒有出現異常和死亡情況,也不見異常行為特征,表明沙蠶運動飲料中不存在影響小鼠生長狀況的特殊成分。

表4 沙蠶運動飲料對小鼠體重的影響(n=8) 單位:gTable 4 Effects of Nereis succinea sports beverage on body weight in mice (n=8)

2.6 沙蠶運動飲料對小鼠運動耐力的影響

2.6.1 沙蠶運動飲料對負重游泳時間的影響

負重游泳是一種評估抗疲勞實驗的運動模型[14],小鼠負重游泳時間的長短可反映其疲勞程度。由圖4可以看出,灌喂沙蠶運動飲料1個月后小鼠負重游泳時間與灌喂劑量呈正相關關系,負重游泳時間隨著灌喂飲料劑量的增大而延長,高劑量組的負重游泳時間與陰性對照組相比呈現顯著性延長(P<0.01),且長于陽性對照組,表明沙蠶運動飲料可提高小鼠的運動耐力,具有顯著延長小鼠力竭游泳時間的功效。

圖4 不同劑量沙蠶運動飲料對小鼠負重游泳時間的影響

2.6.2 沙蠶運動飲料對肝糖原的影響

肝糖原是提供機體運動能量的物質之一,其消耗和代謝副產物的堆積被認為是造成疲勞的原因[15],當肝糖原貯存量較少時會導致供能不足,使機體容易產生疲勞感[16]。不同劑量的沙蠶飲料均可以顯著提高小鼠體內的肝糖原含量(P<0.01)(圖5),且高劑量的沙蠶飲料提高小鼠肝糖原的含量高于紅牛飲料,表明沙蠶運動飲料可能是通過提高機體肝糖原的貯存量使機體達到抗疲勞功效。

圖5 不同劑量沙蠶運動飲料對小鼠肝糖原含量的影響

2.6.3 沙蠶運動飲料對血清尿素氮的影響

血清尿素氮可反映出機體蛋白質的代謝情況,運動時體內蛋白質及氨基酸的分解代謝能力增強,使代謝產物血清尿素氮含量增高[17]。血清尿素氮含量與運動耐受力呈負相關關系,血清尿素氮增幅越大則表明機體的運動負荷能力越差[18]。不同劑量的沙蠶飲料均可以顯著降低小鼠血清中的血清尿素氮含量(P<0.01)(圖6),表明沙蠶運動飲料可能在運動過程中減緩小鼠運動時蛋白質的分解,抑制血清尿素氮的產生提高機體運動耐受能力,從而達到抗疲勞的目的。

圖6 不同劑量沙蠶運動飲料對小鼠血清尿素氮含量的影響

2.6.4 沙蠶運動飲料對血乳酸的影響

機體劇烈運動時,體內的糖通過無氧酵解為機體獲取能量,所產生的大量血乳酸堆積在體內,破壞體內酸堿平衡,導致肌肉出現酸痛,機體運動耐力下降[19]。不同劑量的沙蠶飲料均可以一定程度的降低小鼠血乳酸的含量,其中低劑量的沙蠶運動飲料可顯著降低小鼠血乳酸的含量(P<0.01)(圖7),表明沙蠶運動飲料可以抑制小鼠運動時血乳酸的產生或清除血乳酸,減少血乳酸在體內的積累量,起到一定的抗疲勞作用。沙蠶運動飲料降低血乳酸的水平與其劑量不呈劑量依賴性,低劑量沙蠶運動飲料呈現最好的降血乳酸的效果,推測灌喂低劑量的沙蠶運動飲料可能通過糖異生途徑,促進了乳酸向肝糖原的轉化,使得低劑量組小鼠的血乳酸含量降低,但具體原因有待未來進一步深入研究。

圖7 不同劑量沙蠶運動飲料對小鼠血乳酸含量的影響

2.7 產品質量評價

2.7.1 感官指標

色澤:飲料呈黃色,與原料顏色相符;滋味氣味:滋味適口,無其他異味;狀態:澄清透明、狀態均勻、無外來異物。

2.7.2 理化指標

配制好的沙蠶運動飲料經折光計法測得其可溶性固形物含量為6.0%,通過火焰原子吸收分光光度法測定以后確定鈉含量與鉀含量分別為749 mg/L和196 mg/L,符合運動飲料理化指標。

2.7.3 微生物指標

沙蠶運動飲料微生物指標符合GB/T 7101—2022《食品安全國家標準 飲料》,大腸桿菌、霉菌、酵母及菌落總數均未檢出。

3 結論

本研究以雙齒圍沙蠶小分子酶解產物(<5 kDa)為原料,以DPPH自由基清除率作為評價指標考察不同輔料、不同含量的沙蠶小分子酶解產物、不同的滅菌方式對飲料抗氧化活性的影響并結合感官評價確定了沙蠶運動飲料的最佳配方為:沙蠶小分子酶解產物(<5 kDa)含量40%、白砂糖含量5%、羅漢果多糖含量0.02%、檸檬汁含量1.2%、磷酸二氫鉀含量0.05%、磷酸二氫鈉含量0.1%、NaCl含量0.05%(均為質量分數),在此條件下配制得到的沙蠶運動飲料呈黃色、色澤均一、澄清透明、滋味適口,其(質量濃度為2.25 mg/mL)DPPH自由基的清除率為94.1%,IC50值為0.8 mg/mL,小鼠灌喂沙蠶運動飲料30 d后可顯著延長小鼠的負重游泳時間,提高小鼠肝糖原的含量并能顯著降低小鼠血清尿素氮含量及血乳酸的含量,具有顯著的抗疲勞功效。