高效定向馴化人工窖泥功能菌群及機制的研究

毛鳳嬌,黃鈞,周榮清,2*,張宿義,秦輝

1(四川大學 輕工科學與工程學院,四川 成都,610056)

2(國家固態釀造工程技術研究中心,四川 瀘州,646699)

3(四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州,646699)

白酒是全球著名的蒸餾酒之一,2022年全國白酒累積產量為671.24×104m3,濃香型白酒超過了總產量的60%。濃香型白酒生產關鍵設施之一的窖池性能顯著地影響發酵過程及基酒的品質與風味特征[1-2]。內襯窖泥中棲息微生物群落中的功能菌群結構與豐度至關重要,且新構筑的窖池泥中功能菌群的定向馴化是一個漫長的漸進過程,需要持續使用數十年,甚至百年才能形成穩定的功能菌群[3]。因此,百年窖池的生物學功能不僅難以復刻,也是寶貴的釀酒微生物資源[4],嚴重地阻礙了行業的持續穩定發展。自20世紀60年代伊始,工業微生物培養技術促進了以功能菌株及優質窖泥為菌源的人工窖泥(artificial pit mud, APM)培養應用技術的開發與應用,顯著地推動了濃香型白酒生產技術的進步和核心競爭力的提升[2,5]。但如何選擇高活力窖泥資源及對其培養過程群落定向進化的調控面臨巨大的挑戰。曾報道功能菌群擾動大曲發酵,顯著改善了其品質,用于濃香型白酒發酵,不僅改善了基酒的品質及產率[6],且促進了APM的理化性質及群落中功能菌群的定向進化[3],如提高了功能菌群Methanobacteriales和Methanosacinales的豐度。這些成果為開發新的APM培養與應用技術奠定了重要的基礎[7]。

本研究以不同窖齡泥為對象,探討了基于太空(taikong, TK)大曲對窖泥微生物群落及揮發性代謝組分的影響,以優質窖泥的功能菌群及代謝組分為模板[2],進行APM培養及模擬發酵實驗,解析TK大曲的貢獻特征和主要功能菌與代謝成分的相關性。旨在為人工窖泥高效生產與應用技術的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 窖泥培養和應用

不同窖齡泥,常規(DZ)大曲、強化(QH)大曲、太空(TK)大曲,酒糟及黃水,瀘州老窖股份有限公司(四川省瀘州市)。QH大曲按照HE等[8]描述的生產工藝,按1∶1比例接種B.velezensis和B.subtilis組成的菌懸液,在曲坯中的初始濃度為2.3×106CFU/g(以小麥干重計算)。TK大曲是通過接種10 g/kg的母曲生產的,母曲是在神舟十一號飛船的太空艙中停留了一個月的大曲粉經逐批擴大培養得到[9]。DZ大曲是按常規操作規范生產。以下所有實驗均設置了3組平行。

窖泥培養物的制備:分別取50年、100年和200年窖齡泥10 g加入90 mL無菌生理鹽水中充分分散混勻制備為窖泥菌懸液,以100 mL/L的接種比例接種到滅菌后的培養基中,同時接種2 g/L的TK大曲,置入厭氧瓶,通N2置換瓶中空氣后密封。35 ℃條件下厭氧培養10 d。培養基:5 g/L NaHCO3、1 g/L酵母浸粉、1 g/L蛋白胨、3 g/L葡萄糖、0.2 g/L半胱氨酸鹽酸鹽、170 mL/L鹽溶液A[3 g/L KH2PO4、6 g/L NaCl、3 g/L(NH4)2SO4、0.3 g/L CaCl2、0.3 g/L MgSO4],170 mL/L鹽溶液B(3 g/L K2HPO4),150 mL/L黃水,115 ℃滅菌30 min,冷卻后加0.001 g/L刃天青。

APM培養:不同窖齡泥培養物以5%(體積分數)的接種比例接種到1年齡的新泥(PM0)中,同時接種1%(質量分數)的TK大曲,室溫厭氧發酵60 d。不同窖齡泥培養物的APM分別簡寫為APM50,APM100,APM200。

白酒釀造實驗:不同窖齡泥培養物的APM涂掛在5 L塑料容器(28 cm×19 cm×14 cm)中,窖底和四周的厚度分別為4 cm和3 cm。參照企標DB 510500/T36—2016所述的步驟和條件蒸糧、冷卻后,分別加入15%(質量分數)的DZ大曲、QH大曲、TK大曲混合均勻后,溫度降至24 ℃入窖,常溫(26～28 ℃)發酵60 d[6]。其中使用APM50,APM100,APM200和TK大曲發酵后的窖泥簡寫為PM50TK,PM100TK,PM200TK。使用APM100和DZ大曲及QH大曲發酵后的窖泥簡寫為PM100DZ和PM100QH。

1.2 儀器與設備

PHS3C pH計,大普儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜,安捷倫科技有限公司;Alltech OA-1000有機酸柱,格雷斯公司;TRACE 1300-TQS 9000氣相質譜聯用儀,島津(上海)實驗器材有限公司;NanoDrop ND-1000分光光度計,賽默飛世爾科技公司。

1.3 理化指標檢測

水分測量:采用重量法。pH和酸度:分別將窖泥與重蒸水以料液比1∶5(g∶mL)的比例混合后,室溫下浸提30 min,然后用pH計測定其pH值?？偹?滴定法用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至終點pH 8.2?？傰ズ?采用皂化滴定法[6]。

1.4 有機酸含量測定

參照CHEN等[10]描述的方法測定有機酸含量。取5.000 g樣品置于50 mL離心管中,加入20 mL H2SO4溶液(9 mmol/L),渦旋5 min(200 r/min)后,超聲60 min(100 W,40 kHz),期間每隔15 min將其渦旋1 min,離心(4 ℃、12 000 r/min)15 min。取上清液,經活化的C18 SPE純化柱純化后,經0.22 μm濾膜過濾,20 mL濾液通過Agilent 1260高效液相色譜進行分析,色譜柱為Alltech OA-1000(300 mm×7.8 mm)機酸柱。色譜條件:流動相為9 mmol/L的H2SO4,流速0.6 mL/min,柱溫75 ℃,紫外檢測波長為210 nm。用標準品乳酸、乙酸、丁酸和己酸等的出峰時間和標準曲線對樣品進行定性、定量分析。

1.5 揮發性代謝物的檢測

頂空固相微萃取-氣相質譜聯用法[11]:稱取0.500 g樣品,加入20 μL辛酸甲酯(0.007 9 g/100 mL)作為內標置入萃取瓶,60 ℃水浴中平衡15 min,固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)萃取50 min后,插入氣相質譜儀的進樣口。GC條件:進樣口溫度為250 ℃;載氣為高純氦氣(>99.999%);流速恒定為1 mL/min;不分流模式。柱溫箱的升溫程序為:初溫40 ℃維持5 min,以4 ℃/min升至100 ℃,再以6 ℃/min升至230 ℃保持10 min。MS條件:離子源溫度為250 ℃;傳輸線溫度為300 ℃;電離模式為EI(70 eV);掃描范圍為35～400 amu;掃描速率為1 scan/s。定性分析:與NIST 2017數據庫比對后,保留正、反相似度>80%的物質進行后續分析。

1.6 微生物檢測

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)法:準確稱取1.00 g窖泥樣品置于50 mL離心管中,加25 mL PBS緩沖液(10 mmol/L,pH 7.2),渦旋振蕩5 min,離心10 min(800 r/min,4 ℃)重復洗滌沉淀3次,收集上清液離心(12 000 r/min,4 ℃)10 min,所獲微生物沉淀用無菌的PBS緩沖液洗滌3次后,按照DING等[5]描述步驟進行熒光檢測。所用寡核苷酸探針委托Sangon(中國上海)合成,5′端采用Cy3標記。

高通量測序:參照MU等[3]描述的方法,使用Omega Mag-bind soil DNA kit試劑盒提取DNA。1%(質量分數)的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000分光光度計檢測DNA的濃度、純度和完整性。使用引物338F和806R擴增16S rRNA V3/V4高變異區域。真菌擴增區域為ITS1區。擴增的PCR產物被用于構建文庫,然后在Illumina Miseq測序平臺對DNA片段進行雙端(Paired-end)測序。

原始測序數據主要基于QIIME2(2019.4)進行處理。首先,使用demux插件對原始序列進行解碼處理,并利用cutadapt插件進行引物切除。然后使用DADA2插件對序列進行質量過濾、去噪、合并和嵌合體去除等數據處理。對上述獲得的序列按100%的序列相似度進行歸并,生成特征性序列ASVs以及豐度數據表格,并進一步移除僅在一個樣本和單一序列中發現的ASV。最后,根據Silva(v 132)和UNITE(v 8.0)數據庫,使用特征分類器插件中的classify-sklearn樸素貝葉斯分類器將物種分類分配至ASV。

1.7 數據處理

統計樣本均值之間的差異顯著性通過使用SPSS Statistics 22的單因素方差分析進行檢驗,P<0.05被認為具有統計學意義。采用Excel 2021和Origin 2021軟件繪制數據并進行統計分析,結果以均數±標準差表示。采用Chao1指數和香農指數評價微生物群落α-多樣性,基于Bray-Curtis距離的主坐標分析評價微生物群落β-多樣性。用Simca 14.0軟件和pheatmap軟件分別對揮發性代謝物進行偏最小二乘判別分析和聚類熱圖分析。利用vegan包裝進行優勢菌與理化和有機酸之間的冗余分析,說明發酵環境對微生物群落結構的影響。采用線性判別分析效應量對不同窖泥樣品中具有顯著代表性的細菌和真菌群落進行判別分析(LDA score≥2),可視化分析在開放訪問網站中執行(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。

2 結果與分析

2.1 窖泥理化性質的變化

在白酒釀造生態系統中,理化指標顯著影響窖泥優勢菌群的形成[12],亦與窖泥的質量密切相關。如表1所示,不同窖齡APM和PM間含水率不同,范圍為32.78%～34.44%,其中APM200和PM200TK最低。相關研究顯示,通常優質或陳年老窖泥的pH值較高或總酸較低[13]。APM的pH值增加,發酵后的窖泥因有機酸積累pH降低。但使用TK大曲發酵后的窖泥pH值均顯著高于PM100DZ和PM100QH。窖泥的總酸在強化培養和發酵后,呈現增加的趨勢,其中APM100在強化窖泥樣品中最高,發酵后相應的PM100TK的增幅顯著低于PM100DZ和PM100QH。APM和PM的總酯含量顯著增加,且APM100和PM100TK顯著高于同組的其他樣品。使用發酵后窖泥同企業生產中使用了2年的強化窖泥相比,pH值略高,總酸略低,總酯提高了2倍[14]。因此百年窖泥培養物的微生物代謝活性最強,在發酵過程中TK大曲更有利于控制發酵后窖泥酸度的增加,及酯類化合物的積累,顯著改善了窖泥品質。

表1 窖泥理化參數Table 1 Physicochemical parameters of pit mud

2.2 窖泥中微生物群落多樣性

擴增子測序技術解析窖泥群落多樣性的結果如圖1所示。APM中細菌的豐富度和多樣性顯著提高,發酵后則降低。真菌群落的結果則相反(圖1-A,圖1-B),TK大曲和窖泥培養物對APM微生物群落馴化有顯著效果。APM的香農指數類似優質窖泥,香農指數高有利于其生態系統功能的實現,推測強化使其具有類似優質窖泥的活性[13]?；贐ray-Curtis距離矩陣的主坐標分析結果表明,PM0,APM和PM間的細菌群落結構差異顯著,分別聚為一簇(圖1-C)。不同窖齡泥培養物顯著影響APM及PM的真菌群落,不同屬性大曲使APM100及相應的PM真菌群落結構趨于類似,聚為一簇,APM50和APM200與相應的PM分別聚為一簇(圖1-D)。曾報道使用2年的強化窖泥亦有類似的結果[14],由此可見,TK大曲和窖泥培養物對APM的微生物群落的馴化有顯著的效果。

A-細菌α-多樣性指數;B-真菌α-多樣性指數;C-細菌β-多樣性指數;D-真菌β-多樣性指數

2.3 基于FISH技術的微生物定量評估及構成差異性分析

基于FISH技術定量分析的結果如表2所示,相比PM0,APM總菌數增加不顯著,而PM顯著增加,APM和PM的古菌數均顯著高于PM0,但真細菌數則相反,表明APM經發酵后,窖泥中微生物數量增多。產甲烷古菌通常在新窖泥中含量較少[15],但在APM及PM中數量顯著增高,且APM100和APM200顯著高于APM50。作為評估窖泥質量重要參數的Methanosarcinales在PM中顯著增高了2～4倍[16],尤其在PM100TK中的數量高達(9.53±0.63)×109cells/g,Methanosarcinales具有包括糖酵解和合成己酸的潛在代謝活性。同樣的,Methanomicrobiales和Methanobacteriales在PM中顯著增高,在PM100TK中數量最高分別為(13.81±0.22)×109cells/g和(12.12±0.15)×109cells/g。APM100和TK大曲更有利于窖泥古菌群落的演替富集。此外,作為濃香型白酒釀造的關鍵功能菌Clostridium和Clostridiumkluyveri的變化亦是如此。氫營養型產甲烷菌和Clostridium之間的種間氫轉移有助于緩解氫分壓對后者的抑制作用,從而有助于己酸和丁酸的形成。人工窖泥新型制備方式能加速窖泥功能菌群定向進化。

表2 FISH檢測窖泥中不同微生物含量 單位:×109 cells/gTable 2 Different microbial contents in pit mud detected by FISH

窖泥樣品細菌群落屬水平的組成輪廓如圖2所示,其中優勢細菌有21個屬,占細菌總數的73.35%～98.70%(圖2-A)。APM中乳桿菌屬(Lactobacillus,LL)和梭狀芽孢桿菌(Clostridium_sensu_stricto_12)的相對豐度顯著高于PM0,且APM間LL的相對豐度差異顯著,其相對豐度排序為:APM50(29.52%)>APM200(21.09%)>APM100(10.78%),核心功能菌Clostridium_sensu_stricto_12相對豐度是APM100(15.15%)>APM50(10.68%)>APM200(10.66%),都較PM0增高了2倍以上。結果表明,在該窖泥培養體系中,使用100年窖泥培養物更有利于Clostridium_sensu_stricto_12的增殖和LL的抑制。線性判別分析也表明Clostridium_sensu_stricto_12是APM的潛在生物標志物(圖2-B),佐證了ZOU等[17]的研究結果。APM構造的模擬窖池用于發酵后,因受發酵酒醅的影響Lactobaciiius相對豐度增加,但在PM100TK中的增量最少,且PM100DZ和PM100QH中的增量也較低。適量的乳酸可以維持窖泥的理化環境,起到酸堿調節劑的作用,促進糖化和發酵能力,但乳酸含量的激增會導致窖泥微生物群落失衡,降低菌群的穩健性[18]。結果表明,基于百年老窖泥的微生物富集培養物和TK大曲發酵的人工窖泥更有利于維持窖泥群落結構穩定和優勢菌Clostridium的富集。窖泥樣品中共檢出了10種優勢真菌(圖2-C),其中Candida在所樣品中占優勢,相對豐度為57.26%～96.13%,PM0的優勢真菌是Penicillium和Pichia。Pichia的相對豐度在APM中增加至6.72%～39.90%,PM中Candida和Pichia依然是優勢真菌,相對豐度分別為57.26%～88.70%和10.14%～39.07%。Candida產乙醇能力強,且能代謝合成多元醇和呋喃酮[19],Pichia則是產乙醇和高級醇的能力強[20]。線性判別分析的結果也揭示了Pichia是窖泥差異優勢菌(圖2-D),是濃香型白酒發酵過程中的優勢酵母,在乙醇和風味醇的生產中起著關鍵作用[20]。

A-細菌組成;B-真菌組成;C-細菌線性判別分析;D-真菌線性判別分析

2.4 揮發性代謝物的差異分析

乳酸、乙酸、己酸、丁酸是濃香型白酒發酵過程中的關鍵有機酸[21]。檢測結果如圖3-A所示,相比APM50和APM200,APM100的乳酸含量最低,乙酸、丁酸和己酸含量最高。APM應用到發酵后,受酒醅影響除丁酸外其余有機酸含量均出現增長的現象。PM100TK乳酸增加量最低,同樣的PM100DZ和PM100QH乙酸降低量和己酸增加量最高。TAO等[22]推斷,在濃香型白酒發酵過程中,Clostridium能利用乳酸通過鏈伸長途徑合成己酸,提高Clostridium豐度是改善窖泥功能活性的重要舉措。窖泥中共鑒定出了120種揮發性代謝物,包括74種酯、15種醇、14種酸、2種醛、7種酮、和8種其他類。這些揮發性代謝物中己酸乙酯、己酸丙酯、己酸丁酯、己酸和丁酸等是優勢組分,約占揮發性代謝物總量的55%。TK大曲和窖泥培養物影響揮發性酸、線性或支鏈酯在強化窖泥中的分布。APM中除酯類物質外,酸類物質的含量也較高,主要是己酸和丁酸,而PM中酯類物質的含量增加,特別是己酸乙酯(圖3-B)。變量重要性投影[VIP]≥1的分析結果表明,22種揮發性代謝物被鑒定為主要差異物(P<0.05),包括脂類、酸類和醇類,大部分已被報道為濃香型白酒的芳香活性化合物[23],特別是己酸乙酯、己酸丁酯、己酸、丁酸在白酒的風味中起著至關重要的作用(圖3-C)。偏最小二乘判別分析的結果表明,強化窖泥和發酵后窖泥風味化合物的組成發生了顯著變化。APM主要風味化合物是己酸、辛酸和丁酸與曾報道的窖泥微生物合成酸相吻合[21]。PM則主要是己酸乙酯、己酸丙酯和2,3-丁二醇(圖3-D)。己酸乙酯能產生蘋果味,是影響濃香型白酒風味和品質的關鍵化合物,在PM100TK中的含量最高,TK大曲顯著提高了窖泥的代謝活性。而窖泥中Bacillus產生的特定的風味化合物2,3-丁二醇有益于改善最終產品的風味[24]。

A-有機酸含量;B-揮發性代謝物總量;C-揮發性代謝物熱圖分析;D-揮發性代謝物偏最小二乘判別分析

2.5 微生物群落與主要揮發性代謝物和理化性質的關系

采用冗余分析表征窖泥中細菌和真菌群落與有機酸和理化因子之間的相關性,結果分別如圖4-A和圖4-B所示。酸度和pH是驅動窖泥細菌群落變化最大的非生物因素與LL呈正相關。Clostridium_sensu_stricto_12和Bacillus與丁酸和己酸呈正相關。有機酸與Bacillus呈正相關可能因Bacillus的耐酸性較強[25]。在真菌群落中,Pichia和絕大多數理化指標呈正相關,特別是總酯,總酸和己酸,Candida與pH和丁酸之間呈正相關。主要微生物群落與揮發性代謝物之間的斯皮爾曼相關系數的聚類分析結果表明,揮發性代謝物與微生物群落之間存在顯著的相關性。己酸、丁酸與窖泥中主要微生物都呈顯著正相關,而Clostridium_sensu_stricto_12主要與己酸、丁酸和2,3-丁二醇等呈顯著正相關(圖4-C),研究表明,Clostridium_sensu_stricto_12不僅能將乳酸轉化為己酸,還能促進各種揮發性化合物的形成[26],這也得到了本研究相關分析的支持。因此,LL的減少和Clostridium的增加可能是窖泥揮發性代謝物含量增加的原因[3]。

A-細菌冗余分析;B-真菌冗余分析;C-揮發性代謝物與微生物相關性熱圖分析

3 結論

基于TK大曲培養不同窖齡窖泥功能菌用于APM培養的結果表明,不同窖齡泥培養物都顯著提高了細菌量、群落多樣性及功能菌群的數量;100年窖齡窖泥培養物是最適合APM的功能菌群源,APM100及PM100TK的LL的增幅最少,而Clustridums、Methanomicrobiales、Methanobacteriales、Candida和Pichia等功能菌的相對豐度顯著提高,發酵亦改善了PM的風味輪廓,己酸乙酯、己酸丙酯、2,3-丁二醇等基酒的骨架成分的含量在PM中也顯著提高。研究結果為合理利用優質窖泥資源,開發新型人工窖泥培養技術奠定了理論基礎。