混合乳酸菌發酵對臭鱖魚風味特征的影響

梁鉆好,黃寧,馬曉飛,杜冰*

1(陽江職業技術學院 食品與環境工程系,廣東 陽江,529566)

2(華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510642)

臭鱖魚,徽州名菜,是指將新鮮的鱖魚進行腌制和發酵,最終魚體散發出似臭非臭的獨特風味,魚肉變得緊致爽口、骨肉分離,形成獨特的“蒜瓣肉”,具有“聞臭吃香”的特點[1]。其特殊“臭”味源于發酵,本質是微生物和內源酶作用使魚肉蛋白質變性、脂肪氧化[2]。蛋白質代謝是臭鱖魚特征風味物質形成的關鍵途徑。微生物發酵過程逐步把蛋白質水解成大量小分子多肽和游離氨基酸,形成某些重要特征風味物質的前體物質[3],氨基酸在相關酶的脫羧和脫氨作用下進一步形成揮發性鹽基氮、組胺、三甲胺、氨、胺類、硫化氫、吲哚、甲基吲哚等,一方面導致魚體的腐敗變質,另一方面,這些含氮、含硫化合物是臭鱖魚的重要風味物質,尤其是具有腐敗魚肉味和氨臭味的三甲胺,是自然發酵臭鱖魚特征風味形成的關鍵成分[4]。揮發性物質的另一個重要來源是脂類的氧化降解[5],脂解和脂肪氧化均是臭鱖魚制品在加工過程中的重要生化反應,這兩大反應通常是同時進行的。關于脂解反應,肌肉中的內源酶和微生物分泌的酶均參與作用,把飽和脂肪酸降解,釋放出中短鏈脂肪酸和更多的不飽和脂肪酸[6]。臭鱖魚的微生物脂解作用主要還是以釋放多不飽和脂肪酸為主[7],一定程度上增加臭鱖魚肉的食用價值和保健作用[6]。脂解促進脂肪酸釋放的同時也易引起強烈的脂肪酸氧化[7]。脂肪酸的部分氧化可促進醛、酸、酯、酮類等揮發性物質的生成,如壬醛、辛醛、癸醛、胡椒酮等多種由脂肪酸衍生的揮發性物質均在臭鱖魚中被檢測出來,這些揮發性物質可賦予臭鱖魚魚腥味、油脂味、奶油香等多種氣味,促進發酵風味的形成[6,8]。

可見,發酵過程引起的蛋白質變性和脂肪氧化對臭鱖魚關鍵風味的形成具有決定性作用,特定微生物可促進特定風味物質的形成。如弓形桿菌(Arcobacter)和嗜冷單胞菌(Psychrobacterspp.)是褐蝦在保藏過程中硫化物、酮類、氨類、醇類等重要揮發性成分產生的主要優勢菌群[9];具有乳香味的雙乙酰主要由乳酸菌發酵產生,適當的菌種搭配可高產雙乙酰成分[10]。清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)可促進芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和檸檬烯等香氣物質的生成,抑制魚肉甲硫醇等惡臭氣味的積累[11]。大量研究表明,乳酸菌是自然發酵臭鱖魚的優勢菌群[12],人工添加優勢乳酸菌干預發酵,可定向改善和提升臭鱖魚風味。

乳酸芽孢桿菌DU-106(Bacillussp.DU-106)是食品工業益生菌發酵劑的一株新型潛在候選菌株[13]。課題組前期研究已表明,該菌株在發酵臭鱖魚中也表現出明顯的優勢[14]。本研究利用人工感官和電子鼻技術評價整體風味,頂空固相微萃取-氣質聯用(headspace-solid phase micro extraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)定性揮發性成分氣味活性值(odor activity value,OAV)篩選關鍵風味物質,綜合多種風味檢測方法評價乳酸芽孢桿菌DU-106和植物乳桿菌(Lactobacillusplanturum)混合發酵對臭鱖魚風味特性的影響,助力新型食品工業益生菌發酵劑——乳酸芽孢桿菌DU-106在水產品發酵中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱖魚、生姜,購于陽江市木賚市場。

乳酸芽孢桿菌DU-106凍干粉(活菌數為3×1010CFU/g),華南農業大學新資源食品與功能性原料研究及評價中心;植物乳桿菌nbk-MA2(活菌數為3×1010CFU/g),諾佰克(武漢)生物科技有限公司;2,4,6-三甲基吡啶(純度99%),上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖粉、可溶性膳食纖維、菊粉、花椒粉、小紅椒粉、茴香粉、白糖和味精,均為食品級,購于超市。

1.2 儀器與設備

LAB254e電子精密天平,艾德姆衡器(武漢)有限公司;SPX-250BⅢ生化培養箱,天津市泰斯特儀器有限公司;萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美國Supelo公司;GCMS-QP2010 UItra氣質聯用儀、Rtx-Wax色譜柱,日本(島津)有限公司;PEN3電子鼻,德國AIRSENSE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵臭鱖魚的制備

原料預處理及配料:鮮活鱖魚,去魚鰓、魚鱗和內臟,魚酮體用清水沖洗干凈至無血絲,瀝干,稱重,質量約(500±100) g。輔料配比:花椒粉10 g、小紅椒粉20 g、茴香粉5 g、剁碎的生姜10 g、白糖10 g、味精5 g,臨用前混合均勻。發酵劑配比參照馬曉飛等[14]方法:乳酸芽孢桿菌DU-106為2.75 g,植物乳桿菌nbk-MA2為0.25 g、葡萄糖粉80.00 g、可溶性膳食纖維7.00 g、菊粉10.00 g,混合均勻,使用前先用10 mL無菌生理鹽水30 ℃活化30 min。

混合乳酸菌發酵臭鱖魚:按魚酮體質量計算,2.8%(質量分數,下同)食鹽,0.5%輔料和5.8%發酵劑混合均勻后均勻涂抹在魚酮體表面,置于密封容器中,15 ℃發酵,每天翻1次魚身,倒掉多余的浸出液,發酵9 d。發酵結束后清洗干凈魚身,進行風味評價。對照組為自然發酵,不添加發酵劑。

1.3.2 感官評價

對臭鱖魚的風味進行評價,其中氣味是以生魚作評價,肉質和滋味是以熟魚(清蒸,武火至水沸后轉文火蒸10 min)作評價。采用風味剖面檢驗分析法分析:對風味(酸味和臭味)、肉質(彈性和蒜瓣狀)、滋味(咸味和酸味)采用6分定義的標度方法(1分,不存在的;2分,非常輕微的;3分,輕微的;4分,明確的;5分,顯著的;6分,非常顯著的)對臭鱖魚樣品進行風味強度評價,并將所得到的結果進行風味剖面檢驗分析。

1.3.3 電子鼻分析

參照楊召俠等[15]方法,臭鱖魚清洗干凈,去骨去皮取肉,研缽磨成魚糜,取5 g放入密閉頂空瓶,60 ℃恒溫30 min,插入電子鼻進樣針進行測定,進樣流量300 mL/min,分析采樣時間250 s,確保樣品分析平穩,數據記錄時間間隔1 s,空氣清洗探針280 s。重復3次。各傳感器對物質的響應類型見表1[15]。

表1 電子鼻傳感器所對應的香氣類型Table 1 Aroma type corresponding to e-nose sensor

1.3.4 揮發性成分分析檢測

參照楊召俠等[15]方法,采用HS-SPME-GC-MS分析法分析臭鱖魚揮發性成分。臭鱖魚去骨、去皮,取肉,用研缽磨成魚糜,待測。

頂空固相微萃取步驟:準確稱取5.00 g樣品和10 μL 0.1 mL/L 2,4,6-三甲基吡啶溶液放入密閉頂空瓶中,60 ℃平衡15 min,然后將已經老化好的50/30 μm DVB / CAR / PDMS萃取頭插入頂空瓶中富集萃取30 min,在250 ℃脫附3 min進樣。

色譜條件:DB-Wax極性毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),載氣為氦氣,流速為1 mL/min;恒壓模式,壓力112 kPa;色譜柱起始柱溫為40 ℃(保持2 min),首先以8 ℃/min升到200 ℃,然后以3 ℃/min升到215 ℃,最后以10 ℃/min升到230 ℃保持4 min。進樣量為10 μL,不分流。進樣口溫度:250 ℃,檢測器溫度:280 ℃。

質譜條件:EI離子源溫度230 ℃,能量70 eV,掃描范圍33～450 amu。數據由Xcalibur軟件系統處理,未知化合物經計算機檢索NIST譜庫(107 k compounds)相匹配,正反匹配度>80的鑒定結果才予以報道。

化合物含量和內標物質含量計算公式分別如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:ρ,內標物密度,視為1 g/mL;V,內標物體積,mL;c,內標物濃度,mL/L;m,魚肉質量,g。

1.3.5 特征風味化合物鑒別

查閱相關文獻獲得揮發性化合物的嗅覺閾值,通過OAV確定特征風味化合物,計算如公式(3)所示:

(3)

式中:OAV>1的化合物視為對整體風味有重要貢獻,其值越大,風味貢獻越大。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用Microsoft Excel 2019進行處理,并用Origin 8.0進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 混合乳酸菌發酵對臭鱖魚感官評分的影響

臭鱖魚風味剖面分析結果如圖1所示。不同發酵方式制備的臭鱖魚在酸味(風味)、蒜瓣狀(口感)、滋味上有顯著差異,其中混合乳酸菌發酵的臭鱖魚在酸味(風味)上和蒜瓣狀(口感)上更明顯,而滋味上的咸味和酸味適當?；旌先樗峋l酵的臭鱖魚相比對照組,在風味和滋味上明顯增加了酸味,臭味減弱。

圖1 臭鱖魚風味剖面分析雷達圖

雖然2種發酵方式的加鹽量一致,但對照組的咸味較強,而混合乳酸菌發酵組的咸味適中,這與味的相互作用有關,混合乳酸菌發酵的酸性代謝物在發酵過程中滲透到魚肉中,酸味調和了咸味,因此表現為咸味減弱。此外,乳酸菌及其酸性代謝物對臭鱖魚蒜瓣狀的肉質形成有促進作用?；旌先樗峋l酵組的臭味明顯,但評分略低于對照組非常顯著的臭味,2種臭味不同,混合乳酸菌發酵的臭鱖魚所帶的酸臭味相對柔和,相比之下,對照組的臭味略帶尖銳刺鼻的腐味和腥味。

2.2 電子鼻分析

臭鱖魚風味的主成分分析結果如圖2所示,第一主成分貢獻率為99.38%,第二主成分貢獻率為0.62%,2種處理方式得到的臭鱖魚風味有顯著差異,可明顯區分開。

圖2 臭鱖魚氣味的主成分分析圖

傳感器靈敏度如圖3所示(除去靈敏度較低的1、3、4、5號傳感器),對照組在2號傳感器的響應值非常高,表明其氮氧化合物含量特別高,7號和9號傳感器的響應值也相對較高,這2個傳感器對應的化合物為含硫化合物和芳香化合物。表明對照組臭鱖魚主體風味物質為含硫含氮氧化合物以及芳香化合物,其中氮硫化合物主要表現為腐臭、腥臭和硫化味,而且氣味尖銳刺鼻(2號傳感器響應值獨高)。

A-對照組;B-混合乳酸菌發酵組

混合乳酸菌發酵組雖然也是在2、7、9號傳感器的響應值偏高,但相比對照組響應值低很多,而且三者的比例較恰當。此外,6、8、10號傳感器響應值也較高,表明醇類、醛酮類、芳香類化合物含量也是主要的風味貢獻物。由圖3可知,混合乳酸菌發酵組各敏感傳感器的響應值比例相對均衡,風味較對照組柔和、豐富、細膩。

2.3 揮發性成分分析

臭鱖魚的主要揮發性成分如表2所示。對照組和混合乳酸菌發酵組臭鱖魚分別檢測出30種和48種揮發性成分,含有醇類、酮類、醛類、烯炔類、芳香類、酯類、醚類、烷烴類和含氮含硫化合物。其中對照組未檢測出醛類和酯類化合物,混合乳酸菌發酵組未檢測出醚類化合物。共同化合物有19種。

表2 臭鱖魚主要揮發性成分Table 2 Main volatile components of stinky mandarin fish

結合表2和表3,顯而易見,對照組臭鱖魚的揮發性成分為以三甲胺(9.172%)和吲哚(25.015%)為代表的含氮含硫化合物;以苯酚(31.546%)為代表的芳香類化合物;以芳樟醇(17.294%)為代表的醇類化合物為主,這三大類揮發性化合物的相對含量占總揮發性化合物含量的96.645%,三大類化合物比例約為1.6∶1.6∶1,而三甲胺、吲哚、苯酚和芳樟醇占比達83%,除了芳樟醇具有花香和柑橘香味[16],其他3種物質都具有腐敗魚肉味、土腥味和刺鼻的特殊臭味,特征氣味明顯,是臭鱖魚的主要特征揮發性成分。這也與電子鼻分析結果得出對照組臭鱖魚氣味單一、某種特征氣味顯著偏高的結論一致。另外,對照組還檢測出6種含硫化合物(表2),主要是微生物分解蛋胺產生的具有令人不愉快的硫臭味[1]。

表3 臭鱖魚揮發性成分相對含量和種類對比Table 3 Comparison of volatile components content and species of stinky mandarin fish

混合乳酸菌發酵臭鱖魚以醇類、酮類、芳香類、醛類和烯炔類化合物為主,占比依次減少。最大的特點是增加了4.728%的醛類化合物(對照組未檢測出醛類化合物),含氮含氧化合物含量大大降低(僅有1.305%吲哚),未檢測出任何含硫化合物。醛類化合物氣味閾值高,對風味貢獻大,是混合乳酸菌發酵組區別于對照組的重要揮發性成分。在占比最高的醇類化合物中,除芳樟醇(35.356%)和異戊醇(7.885%)含量較高,4-萜烯醇、1-辛烯-3-醇、α-松油醇和β-松油醇含量也較高。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和草的氣味[17],其閾值較低,對臭鱖魚風味有重要貢獻,主要源于氧化酶對不飽和脂肪酸的氧化分解作用[18],也是酸魚[17]和魚露[19]的特征氣味。酮類化合物在混合菌發酵臭鱖魚中占比第二,主要來源于微生物發酵、多不飽和脂肪酸和氨基酸的氧化[18],同樣具有較低的閾值,賦予奶油香、乳香等香氣,可進一步豐富和融合臭鱖魚風味[2,20]?；旌先樗峋l酵臭鱖魚的酮類揮發性物質以乙偶姻(14.170%)為代表,乙偶姻具有發酵的奶酪香氣,與雙乙酰等8種其他酮類化合物共同賦予臭鱖魚混合菌發酵的特殊香氣。相比之下,對照組的酮類化合物只有2種,占比0.537%。在芳香類和烯炔類化合物中,除茴香腦含量略高,其他18種的占比都比較均衡,雖然每種物質含量不高,但由于種類多,對整體的風味柔和也具有很大貢獻。此外,未檢測出含硫化合物,也表明乳酸菌對腐敗菌有一定的抑制作用,抑制腐敗菌對魚肉蛋氨的分解作用[21]。

2.4 特征風味化合物分析

由表4可知,對照組特征風味化合物為芳樟醇、三甲胺、二甲基二硫和吲哚。其中帶有腐敗魚肉味和氨臭味的三甲胺OAV高達1 610.93,是對照組的第一特種風味化合物。三甲胺的產生源于細菌對氧化三甲胺的代謝作用及氧化三甲胺的裂解作用,這一過程是臭鱖魚風味改變的重要過程[8]。臭鱖魚感官評價表現出刺鼻難聞的腐臭味,與2.2節電子鼻分析中2號傳感器(氮氧化合物)響應值異常高的結果一致。第二特征風味化合物為芳樟醇,賦予了對照組花卉香和柑橘氣息,但貢獻度只有三甲胺的3%。

表4 臭鱖魚的特征風味化合物(OAV>1)Table 4 Characteristic flavor compounds of stinky mandarin fish (OAV>1)

混合乳酸菌發酵的臭鱖魚特征風味化合物種類較多,按貢獻度由大到小排序為:癸醛、芳樟醇、雙乙酰、1-辛烯-3-醇、壬醛、己醛和2,3-辛二酮。其中具有各種果香和花香的癸醛和芳樟醇以及具有發酵奶酪味的雙乙酰OAV都很高,對整體風味貢獻度最大,三者比例接近2∶1.5∶1,比例相對均衡。其次為具有蘑菇香、魚味、青草、脂肪香的1-辛烯-3-醇以及具有青蔥味和動物脂香的壬醛,OAV均在30以上,其中1-辛烯-3-醇常被認為是多種水產品草腥味的主要來源[5],與令人愉快的風味呈正相關[19]。此外,己醛OAV也不低(11.08),己醛具有青蔥味和青澀水果味,2,3-辛二酮具有甜的奶酪味,它們共同賦予了混菌發酵臭鱖魚各種花香、果香、魚香、脂香、青蔥、青澀和奶酪味。同時,混合乳酸菌發酵可降低三甲胺含量,達到脫腥目的[22],沒有自然發酵組的單一氣味,也沒有難聞的腐臭味,更多的是柔和、豐富、細膩的香氣。

3 結論

人工感官評價和電子鼻分析均表明,傳統自然發酵(對照)和混合乳酸菌發酵的臭鱖魚風味有明顯差異?；旌先樗峋l酵的臭鱖魚酸味(風味)和蒜瓣狀(口感)明顯,整體風味相對柔和。電子鼻分析顯示,對照組在2、7、9號傳感器的響應值較高,主體風味物質為含硫、含氮氧化合物以及芳香化合物,其中在2號傳感器的響應值獨高,表明氣味相對單一、尖銳刺鼻;混合乳酸菌發酵組同樣在2、7、9號傳感器的響應值偏高,但響應值比對照組低,而且比例恰當,同時,在6、8、10號傳感器也有高響應值,主要的風味貢獻物為醇類、醛酮類、芳香類化合物,風味相對豐富柔和,與感官評價結果一致。

HS-SPME-GC/MS分析表明,混合乳酸菌發酵的臭鱖魚含有更多的揮發性成分,揮發性物質中增加了醛類化合物,含氮含氧化合物含量大大降低,而且未檢測出任何含硫化合物;其有7種特征風味化合物(OAV>1),分別為癸醛、芳樟醇、雙乙酰、1-辛烯-3-醇、壬醛、己醛和2,3-辛二酮。而對照組僅有4種特征風味化合物,為三甲胺、芳樟醇、二甲基二硫和吲哚,除了芳樟醇,其他3種帶有刺鼻的腐臭味。

綜上所述,利用乳酸芽孢桿菌DU-106和植物乳桿菌混合發酵產生的各種含有花香、果香、魚香、脂香、青蔥、青澀和奶酪味的風味化合物可以協調和抑制腐敗菌產生的單一腐臭味、氨臭味和魚腥味,使臭鱖魚風味更加柔和、豐富和細膩。