?；矸巯^程中結構變化及其發酵特性研究

詹錦玲,許倩,梁玉燊,麻榮榮*,田耀旗

1(江南大學,食品科學與資源挖掘全國重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

2(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)

淀粉是日常飲食中的重要碳水化合物,具有來源廣泛、成本低廉的優點,廣泛應用于食品和非食品領域[1]。通過物理、化學、生物改性等手段改變淀粉的理化、結構特性,可拓展其應用范圍或挖掘其功能特性。?；矸凼且环N將?；氲矸鄣幕瘜W改性淀粉,可改善結構、理化及功能特性。?；矸壑饕譃橐阴；?、丙?；投□；矸?種。研究表明,添加乙?；矸劭梢栽黾用鏃l剛度和黏性,提高面條穩定性[2]。YAO等[3]制備了乙?；矸奂{米顆粒,它可以作為乳液穩定劑應用在食品和制藥乳劑中。近年來,?；矸鄣南?、發酵及功能特性也得到學者廣泛研究。?；矸劭梢蕴岣叩矸鄣目瓜訹4],在大腸發酵時能夠促進短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)釋放[5],對脂肪肝[6]、糖尿病[7]、腸炎[8]等多種疾病具有輔助治療作用,這表明?；矸劭赏ㄟ^不同的干預途徑對機體產生有益影響。

?；矸鄣慕Y構、性質及對代謝性相關疾病的影響已得到廣泛研究。然而,?；剐缘矸墼谶M入機體后,先經過胃、小腸消化系統,再進入大腸發酵。該過程較為復雜,在消化階段?；矸鄣慕Y構變化及消化殘余物結構對后續發酵特性的影響尚不明確,不同種類?；矸巯?、酵解特性尚缺乏系統研究。因此,本課題以3種?；矸蹫檠芯繉ο?解析其在小鼠體內消化前后結構、性質變化及大腸中的發酵特性。本研究有助于進一步理解?；矸鄣南?、發酵過程,為功能性食品配料開發提供重要理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級雄性BALB/c小鼠[5周齡,(20±2) g],浙江維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物使用許可證編號SYXK(蘇)2021-0056。動物實驗方案經實驗動物福利與倫理審查委員會批準,批準編號JN.No20220615b0520728[234]。

玉米淀粉,杭州普羅星淀粉有限公司;乙酸酐、丙酸酐,國藥集團化學試劑有限公司;丁酸酐,阿法埃莎化學有限公司。

1.2 儀器與設備

FE28-Standard型精密pH計,瑞士Mettler-Toledo儀器有限公司;IS10型傅里葉變換紅外光譜儀,美國Thermo Nicolet公司;D2型X-射線衍射儀,德國Bruker AXS公司;高壓離子色譜系統,美國Thermo Fisher Scientific公司;TGA2型熱重分析儀,瑞士Mettler-Toledo儀器有限公司;GC-MS-QP 2010型氣相色譜質譜聯用儀,日本島津公司;Novaseq型Illumina MiSeq測序儀,美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ?；矸鄣闹苽?/p>

?；衩椎矸鄣闹苽鋮⒄誅AI等[9]的方法制備,作適當修改。將一定量的玉米淀粉(maize starch, MS)分散于去離子水中,配制為30%(質量分數)的淀粉懸浮液,置于加熱板上并保持溫度為40 ℃。用1 mol/L的NaOH溶液調節懸浮液的pH為8～9,然后在0.5 h內逐滴加入酸酐[乙酸酐∶淀粉=15∶100(mL∶g),丙酸酐∶淀粉=20∶100(mL∶g),丁酸酐∶淀粉=25∶100(mL∶g)],持續反應2 h。最后用1 mol/L的HCl溶液調節體系pH至6.5以終止反應。將所得的?；矸巯群蠼浫ルx子水、乙醇各洗滌2次,然后在40 ℃烘箱中進行烘干,經研磨并過100目篩得到樣品。乙?；?、丙?；投□；矸鄯謩e命名為MSA、MSP和MSB。

采用LI等[5]的方法測定?；矸廴〈?并作部分修改。稱取500 mg樣品于250 mL錐形瓶中,加入50 mL去離子水使其分散均勻,并加入3滴酚酞作指示劑。之后,在體系中添加25 mL 0.5 mol/L NaOH溶液,反應持續2 h,在此過程中保持不斷轉動(25 ℃,300 r/min)。反應結束后,用0.5 mol/L HCl溶液滴定過量的堿。原淀粉作為空白對照。最終測得MSA、MSP和MSB的取代度分別為0.157、0.161和0.167。

1.3.2 小鼠飼養和分組

實驗小鼠共有52只,其中20只用于小腸消化特性研究,另外32只用于大腸發酵特性研究。

小腸消化特性實驗:小鼠經適應1周后,開展實驗,進行小腸消化殘余物收集。小鼠禁食不禁水19 h后,分別灌胃0.5 mL不同淀粉懸浮液(MS、MSA、MAP和MSB,1.25 g/mL)。灌胃30 min后,小鼠經麻醉脫頸處死,之后進行解剖,提取十二指腸內容物(分別記作MS-d、MSA-d、MSP-d和MSB-d),并置于無菌離心管中,用于后續結構性質測定。

大腸發酵特性研究:32只小鼠分為4組(MS組、MSA組、MSP組和MSB組),每組8只,對照組采用AIN-93G[10]標準純化飼料進行喂養,MSA、MSP和MSB組分別飼喂添加了對應?；矸鄣亩ㄖ骑暳?。在喂養第4周時,采集小鼠糞便,測定其短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)含量。干預4周結束時,小鼠禁食不禁水14 h,采用異氟烷進行麻醉,脫頸、處死并解剖,提取盲腸內容物于無菌離心管中,于-80 ℃冰箱貯存,用于后續腸道菌群的測定。

1.3.3 短程和長程有序性測定

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定淀粉的短程有序性[11],將樣品與溴化鉀按照1∶50的質量比進行混合、研磨、壓片,將壓片置于模具中進行測定,獲得紅外圖譜,掃描范圍為400～4 000 cm-1,并通過傅里葉去卷積處理,計算短程有序性參數。

采用X-射線衍射儀(X-ray diffraction, XRD)測定樣品的長程有序性,將樣品均勻平鋪在載玻片中間的凹槽中,然后將其放在儀器中央的載物臺上進行測試,掃描范圍和速率分別為4°～40°和4°/min。采用公式(1)計算樣品的相對結晶度(relative crystallinity, RC):

(1)

式中:Ac為結晶區面積,Aa為無定形區面積。

1.3.4 鏈長分布測定

將10 mg樣品分散于pH 4.5的醋酸鈉緩沖液中,于沸水浴中煮沸30 min,從中取1.5～2 mL于離心管中,待溫度降至40 ℃時,加入2 U異淀粉酶,在氣浴中反應12 h,反應結束后進行煮沸滅酶,過0.45 μm濾膜后,采用高壓離子色譜系統進行測試[12]。

1.3.5 熱穩定性測定

利用熱重分析儀(thermal gravimetric analyzer,TGA)測定淀粉的熱穩定性[13],稱取4 mg樣品于坩堝中,然后將其放置在自動進樣盤中待測試。加熱溫度為30～600 ℃,升溫速率為10 ℃/min。通過對TGA曲線取一階導數,獲得差熱分析(differential thermal analysis,DTA)曲線。

1.3.6 短鏈脂肪酸測定

SCFAs測定參照CHANG等[14]的方法做適當修改。分別測定喂養4周時小鼠糞便中SCFAs含量。取25 mg待測樣本于2 mL EP管中,加入純水并渦旋均勻,在4 ℃條件下離心20 min(5 000 r/min)。取0.8 mL上清液于2 mL EP管中,加入0.1 mL H2SO4溶液(50%)和0.8 mL提取液,離心15 min(4 ℃,10 000 r/min)后于-20 ℃中靜置30 min。最后,取上清液于進樣瓶中,通過氣相色譜質譜聯用儀(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)進行檢測。

色譜條件:色譜柱:Agilent HP-FFAP毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);升溫程序:80 ℃保持1 min,以10 ℃/min升至200 ℃,保持5 min,以40 ℃/min升至240 ℃,保持1 min;載氣(He)流速3 mL/min,進樣量1 μL;分流比:5∶1。

質譜條件:電離電壓-70 eV;傳輸線溫度240 ℃;離子源溫度200 ℃;四級桿溫度150 ℃;質量掃描范圍m/z33～150。

1.3.7 菌群多樣性測定

采用DNA提取試劑盒從盲腸內容物中提取DNA,以DNA為模板,使用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)引物擴增原核生物16S rDNA上的可變區,并對PCR產物進行純化,然后在其末端加上帶有Index的接頭,隨后進行文庫的構建,最后通過酶標儀檢測文庫濃度,使用Illumina MiSeq儀器進行PE250/FE300雙端測序,獲得測序數據。

1.3.8 數據統計分析

所有測試均重復進行3次。使用IBM SPSS 26.0對數據進行分析,采用鄧肯多重范圍檢驗進行顯著性分析,P<0.05表示有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 短程和長程有序結構變化

a-MSA;b-MSP;c-MSB

a-MSA;b-MSP;c-MSB

經過傅里葉去卷積處理,計算得到比值R1 050/1 020和R990/1 020(表1),分別代表淀粉短程有序性和雙螺旋程度,MSA-d、MSP-d及MSB-d的2個比值均低于未消化樣品的比值,表明?；矸墼谙笃涠坛逃行蚪Y構遭到一定程度破壞。MSA-d、MSP-d及MSB-d的RC值較未消化樣品降低,分別為11.35%、10.97%及10.51%,這說明經小鼠體內消化作用后,?；矸鄣木w結構被顯著破壞。

表1 ?；矸劢浭改c消化前后的短程有序性 參數和相對結晶度Table 1 Short-range order parameters and relative crystallinity of acylated starches before and after duodenal digestion

2.2 鏈長分布變化

?；矸劢浭改c消化前后的鏈長分布如圖3所示。?；矸鄣逆滈L分布較原淀粉略向左(低聚合度方向)偏移。

由表2可知,?；矸燮骄酆隙?degree of polymerization, DP)為15左右。經小鼠十二指腸消化后,各?；矸鄣逆滈L分布發生了明顯的變化,DP≤5的短鏈顯著增加,占比約77%,DP 13～24的中鏈顯著降低,占比11%～13%,MSA、MSP和MSB的平均DP分別從15.09、14.78、14.64降為5.10、4.75、4.56,約為原來的1/3,表明?；矸墼诮涍^小鼠胃酸水解、十二指腸消化后,其直鏈淀粉、支鏈淀粉均被破壞,產生了大量的短鏈。結合XRD數據分析結果,?；矸巯蟊Ａ袅瞬糠帜兔附饨Y構,消化過程中產生的短鏈也可能會聚集形成微晶結構,可進一步被運至大腸中酵解。

表2 ?；矸劢浭改c消化前后的鏈長分布Table 2 Chain length distribution of acylated starches before and after duodenal digestion

2.3 熱穩定性變化

?；矸劢浭改c消化前后的TGA和DTA曲線如圖4所示。在十二指腸消化后,?；矸墼跓岱纸怆A段出現了2 ～ 3個熱分解溫度,表明消化后產生了不同分子質量、不同鏈長的產物。其中,MSA-d有2個熱分解溫度,MSP-d和MSB-d有3個熱分解溫度,表明MSP和MSB的消化殘余物鏈長分布較為分散。此外,三者的熱分解溫度均低于未消化樣品,表明經體內十二指腸消化后,?；矸蹮岱€定性降低;MSA-d、MSP-d和MSB-d最高熱分解溫度分別為310.33、311.00、317.33 ℃,依次增加,這可能與消化殘余物中?；姆N類和數量有關。

a-MSA TGA曲線;b-MSP TGA曲線;c-MSB TGA曲線;d-MSA DTA曲線;e-MSP DTA曲線;f-MSB DTA曲線

2.4 短鏈脂肪酸分析

圖5展示了干預4周后BALB/c小鼠糞便中SCFAs含量和所占比例。由圖5-a可得,?；矸劢M小鼠糞便中總SCFAs濃度均明顯高于MS組,MSA、MSP和MSB組SCFAs質量濃度分別為4 145.23、4 117.34、2 078.37 μg/g,表明在提高總SCFAs含量方面,MSP和MSB組促進程度相當,MSA組促進程度相對較低。

圖5-b展示了各SCFAs占總酸的比例。MSA組產生的乙酸占比最高,MSP組丙酸占比最高,MSB組丁酸占比最高,表明MSA、MSP和MSB分別能特異性促進乙酸、丙酸和丁酸的釋放,與LI等[5]的研究結果一致。與MS組相比,MSA組的乙酸、丙酸、丁酸占比均略有增加,其中,乙酸增加了3.11%;MSP組的乙酸占比降低,丁酸占比略有增加,丙酸占比增加了34.99%;MSB組的乙酸和丙酸占比均降低,丁酸占比增加了48.59%。結果表明,在微生物作用下,乙酸、丙酸和丁酸之間存在一定的轉化[16],3種?；矸鄞龠M特定SCFAs的能力由高到低依次是MSB、MSP和MSA。

2.5 腸道菌群分析

?；矸跰SA、MSP及MSB和對照組MS在屬水平上排名前30的物種分布和聚類熱圖如圖6-a、圖6-b所示。從整體來看,與MS組相比,經?；矸鄹深A后,小鼠腸道菌群組成發生了明顯變化,且聚類熱圖表明,MSP和MSB在屬水平上較為相似,其次是MSA,最后是MS,表明?；矸劭捎行д{控腸道菌群。選取8種關鍵菌科(屬):毛螺菌科(f__Lachnospiraceae)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、糞小桿菌屬(Faecalibaculum)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、f__Oscillospiraceae、Colidextribacter、嗜膽菌屬(Bilophila)、毛梭菌屬(Lachnoclostridium),對其相對豐度進行詳細展示(圖6-c)。其中,f__Lachnospiraceae、Faecalibaculum和Lactobacillus屬于Firmicutes,Parabacteroides屬于Bacteroidetes[17]。?；矸劢M小鼠的f__Lachnospiraceae相對豐度均高于原淀粉,Lachnospiraceae能分解糖類、淀粉等從而促進SCFAs產生,有助于調節氨基酸、激素等的代謝[18],表明?；矸巯噍^于原淀粉更有助于維持機體穩態,其中,MSP的促進效果略高于MSA和MSB。張廷婷等[19]報道Parabacteroides也可以促進SCFAs的產生,該菌屬的增加能夠預防肥胖和非酒精性脂肪肝的發生[20]。本研究中3種?；矸劢M小鼠的Parabacteroides均明顯增加,從高到低分別是MSB、MSP和MSA。Faecalibaculum是開發益生菌最有前途的菌群之一,與機體健康息息相關[21],?；矸劢M該菌屬的相對豐度均高于原淀粉,彰顯了?；矸哿己玫墓δ芴匦?且MSB組Faecalibaculum相對豐度最高(1.19%),MS組僅有0.06%,這是因為Faecalibaculum主要促進丁酸產生[22]。Lactobacillus是常用益生菌之一,具有抗癌活性,能夠參與機體代謝,對疾病預防具有重要作用[23],MS組小鼠盲腸中的Lactobacillus相對豐度僅有0.032 5%,經?；矸鄹深A后,MSA組相對豐度變化不大,而MSP和MSB組相對豐度均增加,分別達到0.845%和0.195%,表明MSP對Lactobacillus具有特異性促進作用。除此之外,?；矸鄣母深A還能夠抑制有害菌的生長。f__Oscillospiraceae和Colidextribacter通常與一些急性腸炎等有關,能夠引起胃腸道感染[24];NATIVIDAD等[25]報道攜帶高水平Bilophila的個體更容易引發炎癥和代謝性疾病;有研究發現Lachnoclostridium與結直腸腺瘤和癌癥直接相關[26]。上述4種有害菌屬的相對豐度在?；矸劢M小鼠腸道中均降低,其中,Lachnoclostridium相對豐度降低最多,Colidextribacter相對豐度降低較少。在3種?；矸壑?MSA主要抑制了Bilophila生長,MSB在降低Colidextribacter和Lachnoclostridium相對豐度中效果最好,而對f__Oscillospiraceae抑制效果弱于MSA和MSP。綜上可知,經過3種不同?；矸凵攀掣深A后,小鼠的腸道菌群均發生了有利變化,既促進了益生菌生長,同時降低了有害菌豐度,不同?；矸劭梢蕴禺愋缘卮龠M或抑制相關菌生長。

a-物種分布;b-聚類熱圖;c-8種關鍵菌屬

3 結論與討論

本研究系統解析了3種?；矸墼谛∈篌w內消化前后的結構和性質變化,并闡明其對小鼠大腸代謝產物和腸道菌群影響規律。經小鼠十二指腸消化后,?；矸鄣亩喑叨冉Y構均被不同程度破壞,為大腸中微生物發酵提供更多作用位點。?；矸坶L期干預可提高小鼠糞便中總SCFAs含量,且MSA、MSP和MSB分別特異性促進乙酸、丙酸和丁酸的釋放,促進程度由高到低依次是MSB、MSP和MSA。在腸道菌群組成方面,?；矸劬龠M了有益菌屬Parabacteroide和Faecalibaculum生長,特別是MSB和MSP分別顯著提高了Faecalibaculum和Lactobacillus相對豐度,為?；矸墼谑称饭δ芘淞现械膹V泛應用提供潛在可能。

本研究也存在一些不足之處,一方面,熱加工處理會影響淀粉結構和性質,還需進一步研究熱加工對?；矸劢Y構、消化特性和發酵特性的影響,另外在發酵特性方面,本文側重分析不同?；矸蹖Υx產物及腸道菌群的影響規律,可以進一步分析并篩選差異代謝物和差異表達基因。