基于電子鼻和溶劑輔助風味蒸發-氣相色譜-質譜聯用技術分析調味小龍蝦揮發性風味特征差異

張權,李金林,*,胡明明,彭斌,鐘比真,涂宗財,,3*

1(江西師范大學 生命科學院,江西 南昌,330022)

2(江西師范大學國家淡水魚加工技術研發專業中心,江西 南昌,330022)

3(南昌大學,食品科學與資源挖掘全國重點實驗室, 江西 南昌,330047)

小龍蝦,學名克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),淡水螯蝦的一種,是我國重要的經濟淡水養殖蝦類[1],因其肉質鮮美、風味獨特、營養價值高,深受國內外廣大消費者的喜愛。2021年我國小龍蝦加工產量約為85.00萬t,受疫情影響略有下降,但小龍蝦產業發展仍穩中有進,其中加工總產值達368.51億元[2]。近年來,隨著速凍制品為主的初級加工產品占比逐年下降,以調味小龍蝦為代表的即食產品需求大幅度增加,已然成為市場新寵[3]。調味小龍蝦產品種類豐富,形式多樣。然而,受原料、生產工藝等因素影響,不同調味小龍蝦形成了獨特的風味特性,其市場認可度和消費者喜愛程度也各有不同,因此對不同調味小龍蝦風味品質差異的研究具有一定的研究意義與價值。

揮發性風味物質是構成食品風味的重要因素,通常人們對食品的選擇和喜愛取決于其揮發性風味。電子鼻由一系列傳感器、信號采集系統和模式識別系統組成,通過模擬動物嗅覺方式識別樣品的風味成分,可客觀地評價樣品的風味特征,并表征它們之間的差異[4]。溶劑輔助風味蒸發萃取(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)是利用溶劑在低溫和高真空的條件下快速汽化來輔助目標物質的蒸發,使揮發性風味物質從樣品中快速分離,所得萃取物風味自然逼真[5]。近年來,溶劑輔助風味蒸發-氣相色譜-質譜聯用(solvent-assisted flavor evaporation-gas chromatography-mass spectrometry,SAFE-GC-MS)技術被提出,并開發用于各種食品風味成分分析鑒定。OKABE等[6]以阿根廷紅蝦為原料,通過SAFE-GC-MS技術研究了其烤蝦的特有風味,確定了17種關鍵風味物質,主要為吡嗪、噻唑和噻吩類等化合物。隨新平等[7]采用SAFE-GC-MS技術從油炸黑虎蝦中檢出93種揮發性風味物質,確定了其關鍵風味物質為2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮、2-乙?；量?、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛等。目前,關于調味小龍蝦的研究主要集中在保鮮技術、品質變化、加工方式及工藝優化等方面[8-10],而對不同調味小龍蝦揮發性風味成分差異的相關研究鮮有報道。

本文以市售常見的調味小龍蝦為研究對象,采用電子鼻結合SAFE-GC-MS技術對其揮發性風味物質組成與含量進行確定,分析比較不同調味小龍蝦風味特征差異及原因,并根據相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)篩選鑒定關鍵特征風味物質,旨在為調味小龍蝦風味統一、產品開發和生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售預制調味小龍蝦(3種麻辣小龍蝦S1-S3、3種蒜蓉小龍蝦G1-G3、2種十三香小龍蝦T1-T2)均購自于南昌市天虹商城,具體信息見表1;二氯甲烷、無水硫酸鈉、氯化鈉,分析純,西隴科學股份有限公司;C8～C40正構烷烴混標,美國AccuStandard公司。

表1 市售調味小龍蝦信息表Table 1 Information table of seasoned crayfish

1.2 儀器與設備

HH-6數顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責任公司;BC206E超級恒溫水槽,深州勒普拓儀器技術有限公司;SAFE60溶劑輔助風味蒸發器,北京康百特科技有限公司;TS85D分子渦輪泵,英國Edwards公司;PEN3電子鼻,德國Airsense公司;7890A/5975氣相色譜-質譜聯用儀,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

將預制調味小龍蝦室溫下自然解凍至完全解凍,除去蝦線,倒入鍋中加熱翻炒至湯汁沸騰,改小火保持3 min,熄火,出鍋,晾至室溫,瀝干湯汁,剝殼取蝦肉部分,攪碎,置于4 ℃冰箱暫存,待用。

1.3.2 電子鼻測定

參考FAN等[11]的方法加以修改,稱取5.00 g蝦肉樣品置于20 mL樣品瓶內,加入5 mL 18%的NaCl溶液,加蓋密封,50 ℃水浴平衡30 min,插入電子鼻探頭進行測定。測定條件:清洗時間90 s,歸零時間10 s,準備時間5 s,測定時間120 s,載氣速度為300 mL/min,進樣流量為300 mL/min,特征值提取時間設定為117～119 s。電子鼻10個不同傳感器對應物質種類見表2。

表2 電子鼻不同傳感器對應物質種類Table 2 Corresponding aroma types of different sensors of electronic nose

1.3.3 揮發性風味物質測定

1.3.3.1 風味物質提取及SAFE條件

參考LIU等[12]的方法稍作修改,采用SAFE法提取樣品中的揮發性風味物質。稱取50.00 g攪碎的蝦肉樣品于錐形瓶中,加入200 mL二氯甲烷,封口,于室溫下攪拌萃取過夜(12 h)。萃取液經中性濾紙過濾,轉移至SAFE裝置的滴液漏斗中,循環水及恒溫水槽溫度均設置為40 ℃,同時在冷阱和保溫瓶中加入液氮,系統的真空度達到1×10-4MPa時,開始緩慢滴加萃取液。待收集瓶中提取液自然融化后加入無水硫酸鈉,于-18 ℃冰箱中靜置12 h,過濾、收集提取液采用韋氏蒸餾柱精餾濃縮至1.5 mL,采用注射器轉移至樣品瓶并定容至2 mL,樣品瓶經封口膜密封,放置于-18 ℃冰箱,待進行GC-MS檢測。

1.3.3.2 GC-MS條件

GC條件[13]:色譜柱為DB-Wax毛細管柱(30 m×0.25 μm×0.25 mm);進樣口溫度250 ℃,載氣He,流速1.0 mL/min,采用不分流模式;升溫程序:起始溫度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min的速度升至240 ℃,保持15 min。

MS條件[13]:EI電離源,電離電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃。

1.3.4 揮發性風味物質鑒定與分析

通過NIST 14質譜庫對未知化合物進行檢索匹配,并結合保留指數(retention index,RI)對正反匹配度大于800(最大值為1 000)的化合物進行鑒定,給出化合物名稱。蝦肉中各揮發性風味成分相對含量根據所得峰面積之比計算。

1.3.5 關鍵風味物質評價方法

采用劉登勇等[14]提出的ROAV法對蝦肉樣品中關鍵性風味化合物進行分析。

1.4 數據分析

所有試驗均作3次平行,實驗結果用“平均值±標準差”表示,采用Origin 2021繪圖并進行主成分分析(principal component analysis,PCA),SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA),顯著性差異分析采用Duncan檢驗,P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 調味小龍蝦電子鼻雷達圖分析

圖1雷達圖顯示了電子鼻的10個傳感器對調味小龍蝦的響應值大小。由圖1可知,W1S、W5S、W3C、W6S、W5C、W2S和W3S傳感器對所有調味小龍蝦樣品的響應值都很小,沒有明顯差異。與其他傳感器相比,調味小龍蝦樣品對W1W(對無機硫化物靈敏)傳感器的響應值最大,其次分別是W1S(對甲基類靈敏)和W2W(對芳香成分、有機硫化物靈敏)傳感器,其中蒜蓉小龍蝦樣品的響應值均明顯比麻辣小龍蝦與十三香小龍蝦大,而麻辣小龍蝦與十三香小龍蝦的響應值差異較小,這可能是因為相比其他調味小龍蝦,蒜蓉小龍蝦中揮發性物質種類與含量存在較大差異,而麻辣小龍蝦與十三香小龍蝦中揮發性物質種類與含量差異較小。這些結果表明,對區分不同調味小龍蝦樣品最重要的貢獻來自于上述3個傳感器。

圖1 調味小龍蝦電子鼻雷達圖

2.2 調味小龍蝦電子鼻PCA分析

對調味小龍蝦電子鼻數據進行PCA分析,結果如圖2-A所示,PC1的貢獻率為91.60%,PC2的貢獻率為7.80%,PC1和PC2的總貢獻率為99.40%,大于85.00%,表明PC1和PC2可以反映調味小龍蝦揮發性物質的主要信息特征[15]。PCA圖(圖2-A)結果顯示,調味小龍蝦樣品大致可分為3個相對獨立的區域,即3種不同風味類型。S1、S2和S3數據相對集中位于最左側,T1和T2分布于中間,其中T1與S1-S3相距較近,表明其風味具有一定相似性。G1、G2和G3位于最右側,且主要體現在PC1上,在PC1軸(91.60%)上與其他調味小龍蝦組分相距較遠,表明蒜蓉小龍蝦的風味成分明顯區別于其他調味小龍蝦樣品。同時,G2在PC2軸(7.80%)上與G1、G3距離相對較遠,可能是受原料、生產工藝等的影響,風味存在一定差異性。載荷圖(圖2-B)可反映各傳感器對于調味小龍樣品區分的貢獻,距離原點越遠貢獻越大[16]。結果顯示,W1W和W1S傳感器對PC1貢獻值較大,W1S和W2W對PC2的貢獻值較大,因此可以通過這些特征傳感器將不同調味小龍蝦區分開,這與圖1中雷達圖結果相一致。

A-PCA圖;B-載荷圖

2.3 調味小龍蝦揮發性風味物質分析

為研究不同調味小龍蝦的風味特征,利用SAFE-GC-MS技術對調味小龍蝦的風味類別及相對含量進行鑒定分析,結果如圖3和表3所示。調味小龍蝦中共檢測出127種揮發性風味物質,其中S1、S2、S3、G1、G2、G3、T1和T2中分別檢出53、55、42、37、36、32、53和50種揮發性風味物質,包括萜類26種、烷烴類13種、醇類14種、醛類6種、酮類10種、酸類8種、酯類6種、芳香類34種以及其他類12種。不同調味小龍蝦中揮發性風味物質組成類別和相對占比存在較大差異,其中麻辣小龍蝦中占比最高的是萜類物質,蒜蓉小龍蝦中占比最高的是烷烴類物質,而十三香小龍蝦則以萜類和芳香類物質為主。

A-風味類別;B-占比

表3 調味小龍蝦揮發性風味物質組成及相對含量Table 3 Composition and relative content of volatile flavor substances of seasoned crayfish

調味小龍蝦中檢出的萜類物質種類較多,如β-蒎烯、D-檸檬烯、γ-萜烯、桉葉油醇、芳樟醇、側柏酮、茴香腦等,萜類物質很少在小龍蝦中檢出[17],它們主要來自于調味小龍蝦制作過程添加的辣椒、蔥、姜、蒜等香辛料[18],其感官閾值較低,對調味小龍蝦的整體風味起重要作用。除G1、G2和G3外,其余調味小龍蝦樣品中萜類物質含量均較高,為42.78%～72.27%。其中S1、S2、S3和T1相對占比最高的是芳樟醇,在35.49%以上,其感官閾值較低(6 μg/kg),對調味小龍蝦整體風味貢獻較大,具柑橘味、花香、木香、青草香等特征風味[19],而在蒜蓉小龍蝦中僅G3有少量檢出(1.45%),這可能是造成蒜蓉小龍蝦風味明顯區別于麻辣小龍蝦和十三香小龍蝦的主要風味化合物。此外,T1和T2中還檢出含量較高的茴香腦(19.00%～19.82%)和桉葉油醇(5.09%～10.40%),且均顯著高于(P<0.05)其他調味小龍蝦樣品,可能是十三香小龍蝦區別于其他調味小龍蝦的主要風味物質,賦予小龍蝦茴香、甘草香、藥香和樟腦香。MORALES-SORIANO等[20]從辣椒中鑒定出檜烯、(+)-δ-杜松烯、L-石竹烯、芳樟醇、D-檸檬烯、畢澄茄烯等萜類化合物。李金林等[13]研究發現D-檸檬烯、β-水芹烯、桉葉油醇、對傘花烴、芳樟醇、α-姜烯、(+)-δ-杜松烯等主要來源于生姜和大蒜。萜類物質在調味小龍蝦中差異顯著,可能是不同調味小龍蝦風味差異的主要原因之一。

烷烴類物質可能來源于脂肪酸中烷氧自由基的均裂,在G1、G2和G3中,烷烴類物質相對占比最高(39.07%～61.43%),且顯著高于(P<0.05)其他調味小龍蝦樣品(4.24%～21.38%),主要為十三烷、十四烷、十六烷和十七烷等長鏈烷烴,由于烷烴類物質通常感官閾值高,大多香氣較弱或者無味,對調味小龍蝦整體風味貢獻小[21]。醇類物質一般由脂質受熱氧化分解生成,其中對調味小龍蝦風味貢獻較大的多為感官閾值較低的不飽和醇類[22],如3-戊烯-2-醇、苯甲醇主要來自于亞油酸和花生四烯酸氧化形成[23]。G3中醇類含量最高(9.59%),主要為丙烯醇,其次分別是S3、S1,分別為6.33%和6.03%,而在G1和G2中醇類物質相對占比僅為0.23%和0.47%。

醛類物質主要由不飽和脂肪酸氧化降解產生,具清香、果香和脂肪味等特征風味,因其感官閾值低,對蝦、蟹等水產品風味特性起重要作用[24]。調味小龍蝦中醛類物質種數較少,共檢出6種,其中G3中醛類物質相對占比最大(1.12%),其次是S1和G1,分別為1.11%和1.07%。壬醛賦予調味小龍蝦清香、青草香等風味,同時也是主要的蝦腥味成分[25],其在S2、G3、T1和T2中均有檢出。此外,苯乙醛僅在G2中檢出,2-甲基-2-丁烯醛僅在G1中檢出,枯茗醛僅在S1中檢出。酮類物質主要是脂質氧化和氨基酸降解的產物,感官閾值較醛類物質高,具有獨特的清香和果香,對調味小龍蝦腥味消減有一定作用[26]。調味小龍蝦中共檢出酮類物質14種,其中G3、T2中酮類物質相對占比較高,分別為9.89%和6.65%,顯著高于(P<0.05)其他調味小龍蝦樣品(0.00%～2.61%)。(S)-5-羥甲基二氫呋喃-2-酮含量較高,除S2和G2外,其余樣品中均有檢出,其中G3中含量最高,高達5.73%,可能來自于脂質氧化產物與美拉德反應產物相互作用產生。

酸類物質主要由脂肪酸經氧化降解形成,通常具刺鼻的不愉快氣味,其感官閾值極高[27],對調味小龍蝦的風味幾乎沒有影響。8個調味小龍蝦樣品中酸類物質相對占比為1.24%～22.47%,樣品間差異顯著(P<0.05),主要為肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸,在所有調味小龍蝦樣品中均有檢出。酯類物質由醇和羧酸的酯化反應形成,呈清淡的水果香和花香,可以減弱脂肪酸的辛辣味和氨基的苦味[28]。調味小龍蝦中酯類物質種數及含量均較少,共檢出6種酯類物質,T2中酯類物質相對占比最高,為6.83%,其次是G2(4.03%),其他調味小龍蝦樣品中含量均較低(0.00%～2.99%)。

芳香類物質在調味小龍蝦中表現較為突出,共檢出芳香類物質34種,其可能來源于烴類、類脂等化合物高溫時裂解產生,或來源于香辛料中[29]。不同調味小龍蝦中芳香類物質含量差異顯著(P<0.05),十三香小龍蝦含量較高,為8.43%～34.46%,其次分別是蒜蓉小龍蝦(11.39%～28.47%)和麻辣小龍蝦(7.35%～9.53%),可能是造成不同調味小龍蝦風味差異性的一類重要風味物質,這與圖1中電子鼻W2W傳感器響應值存在較大差異相一致。此外,調味小龍蝦中還檢測出醚類、吡嗪類、吡咯類等其他類風味物質。醚類化合物感官閾值低,本身具有獨特的氣味,如二烯丙基硫醚具硫磺味、洋蔥味和蒜味。吡嗪、吡咯、噻吩等化合物是美拉德反應和肪質氧化的產物,如2-乙?；拎?、2-乙?；量┑饶苜x予調味小龍蝦烤香、肉香和堅果味[30]。

2.4 主體揮發性風味物質差異分析

揮發性風味物質的相對含量與整體風味特征之間無直接關系,其對整體風味的貢獻大小由相對含量和感官閾值共同決定[33]。因此,對風味物質進行ROAV分析,該方法認為ROAV≥1的組分為關鍵風味物質,0.1≤ROAV<1的組分為對整體風味具有重要的修飾作用,且ROAV越大對整體風味貢獻越大,本研究只選取ROAV≥0.1的風味物質。

由表4可知,調味小龍蝦中共鑒定出15種關鍵風味物質和10種修飾性風味物質,主要包括萜類、醛類和芳香類等物質。其中麻辣小龍蝦關鍵風味物質主要為芳樟醇、桉葉油醇、丁香酚、D-檸檬烯和壬醛,十三香小龍蝦關鍵風味物質主要為丁香酚、芳樟醇、桉葉油醇、壬醛、β-蒎烯、D-檸檬烯和肉桂酸乙酯,麻辣小龍蝦和十三香小龍蝦的關鍵風味物質具較高的相似性,表明這2種調味小龍蝦風味存在相似部分,這也驗證了圖2-A中麻辣小龍蝦與十三香小龍蝦相距較近的原因。相比于麻辣小龍蝦和十三香小龍蝦,蒜蓉小龍蝦關鍵風味物質種類和含量差異較大,G1的關鍵風味物質為2,4-二叔丁基苯酚、2-甲基-2-丁烯醛、棕櫚酸和乙基苯,而G2僅2種關鍵風味物質,分別為L-石竹烯和苯乙醛,G3的關鍵風味物質為壬醛、芳樟醇、二烯丙基硫醚、丁香酚和2,4-二叔丁基苯酚,因此,可推斷蒜蓉小龍蝦關鍵風味物質種數和含量上的差異是其風味特征存在差異的重要原因。沙小梅等[34]對自制麻辣小龍蝦和蒜香小龍蝦主體揮發性特征風味進行分析,結果表明,麻辣小龍蝦主要特征風味物質為萜類和醛類,如β-蒎烯、α-側柏烯、5-甲基糠醛、正丁醛等,與本文結果類似,而蒜香小龍蝦特征風味物質主要以二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚等硫醚類化合物為主,與本文結果存在一定差異,可能與制作工藝、檢測方法等不同有關。此外,檜烯、β-水芹烯、4-萜烯醇、α-松油醇、香葉醇、枯茗醛、2-甲基-3-羥基-4-吡喃酮、肉豆蔻酸、2,6-二叔丁基對甲酚和吲哚ROAV均小于1,具木香、松香、花香、丁香等氣味,對調味小龍蝦整體風味具有重要的修飾作用。這些重要的關鍵風味物質以及修飾性風味物質含量與種類上的差異形成了不同調味小龍蝦獨特的風味。

表4 調味小龍蝦的主體風味物質Table 4 The main flavor substances of seasoned crayfish

2.5 主體風味物質PCA分析

為進一步反映不同調味小龍蝦揮發性風味的差異,對調味小龍蝦中ROAV≥0.1的風味物質進行PCA分析,結果如表5和圖4所示。3個主成分的方差貢獻率分別為73.90%、21.20%和2.80%,累計方差貢獻率為97.90%,說明3個主成分能較好反映樣品的整體信息,可有效用于風味數據分析。芳樟醇在PC1上具較大載荷,為0.98;丁香酚、桉葉油醇、α-松油醇在PC2上具較大載荷,分別為0.88、0.30和0.20;棕櫚酸、硬脂酸、丁香酚在PC3上具較大載荷,分別為0.74、0.50和0.24。說明芳樟醇、丁香酚、桉葉油醇、α-松油醇、棕櫚酸、硬脂酸對不同調味小龍蝦風味差異區分有重要作用。由圖4可知,8個調味小龍蝦樣品以風味不同區分開,在PC1與PC2上,G1、G2、G3相距集中;T1、T2相對集中;S1、S2、S3相距集中。其中,G1～G3與S1～S3在PC1上相距較遠,即在芳樟醇上存在差異,S1～S3中芳樟醇相對含量為40.49%～46.06%,且ROAV均為100,而G1～G3中僅G3含量為1.45%,ROAV為51.43。G1～G3與T1～T2在PC2上相距較遠,即在丁香酚、桉葉油醇、α-松油醇上存在差異,T1～T2中丁香酚含量為4.87%～32.07%,ROAV為13.72～100,而G1～G3中丁香酚含量較低,為1.39%～3.31%,ROAV為0.23～7.40;T1～T2中桉葉油醇含量為5.09%～10.40%,ROAV為7.71～16.21,G1～G3中桉葉油醇含量(0.47%～2.77%)和ROAV(0.04～3.11)均較低。此外,在PC3上G3與G1～G2相距較遠,即在棕櫚酸、硬脂酸、丁香酚上存在差異,G3中棕櫚酸、硬脂酸含量分別為12.15%和8.05%,顯著高于G1與G2,且G3中含少量丁香酚,而G1與G2中未檢出。由此可見,通過對主體風味物質的PCA分析,可以從這3個主成分對不同調味小龍蝦樣品進行區分。

圖4 調味小龍蝦主體風味物質PCA圖

表5 主成分特征向量矩陣Table 5 Principal component eigenvectors matrix

3 結論

受原料、生產工藝等因素的影響,我國調味小龍蝦產品風味存在著較大的差異性,本研究采用電子鼻結合SAFE-GC-MS技術對調味小龍蝦揮發性風味差異進行分析。結果表明,電子鼻能夠較好地區分不同調味小龍蝦樣品的風味,W1W、W1S和W2W傳感器是其特征傳感器。SAFE-GC-MS可以較全面分析不同調味小龍蝦的風味差異,調味小龍蝦樣品中共檢出127種揮發性風味物質,其在不同調味小龍蝦中揮發性風味物質組成和相對占比差異顯著,這使得不同調味小龍蝦形成獨特的風味。進一步采用ROAV分析,確定了15種關鍵風味物質和10種修飾性風味物質,其中麻辣小龍蝦關鍵風味物質主要為芳樟醇、桉葉油醇、丁香酚、D-檸檬烯和壬醛,十三香小龍蝦關鍵風味物質主要為丁香酚、芳樟醇、桉葉油醇、壬醛、β-蒎烯、D-檸檬烯和肉桂酸乙酯,而蒜蓉小龍蝦關鍵風味物質種類差異較大,主要為2-甲基-2-丁烯醛、L-石竹烯、壬醛、苯乙醛、二烯丙基硫醚和2,4-二叔丁基苯酚等,并對這25種主體風味物質進行PCA分析,可以較好地對不同調味小龍蝦樣品進行區分。后續將進一步通過風味重組與缺失試驗等手段對不同調味小龍蝦主體關鍵風味物質進行驗證分析,以期為標準統一、風味可控的調味小龍蝦產品生產提供一定理論參考。