基于頂空固相微萃取-氣相色譜-嗅聞儀-質譜儀結合氣味活力值鑒定檳榔香六堡茶關鍵香氣物質

陳國和,胡騰飛,王樂涯,歐行暢,李勤,黃建安,3,劉仲華,3*,王超,3*

1(湖南農業大學,茶學教育部重點實驗室,湖南 長沙,410128)

2(國家植物功能成分利用工程技術研究中心,湖南 長沙,410128)

3(湖南省植物功能成分利用協同創新中心,湖南 長沙,410128)

六堡茶,我國特有的一種黑茶,因產于廣西壯族自治區梧州市蒼梧縣六堡鎮而得名,距今已有1 500年歷史[1]。六堡茶是以蒼梧縣群體種、大中葉種及其分離、選育的品種、品系茶樹[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]的毛茶為原料,經特定的加工工藝(篩分、拼配、汽蒸或不汽蒸、渥堆、汽蒸、壓制成型或不壓制、陳化等)制成的茶葉[2-3],其中微生物發酵在其品質形成中發揮了關鍵的作用[4],造就了其獨特的“紅、濃、陳、醇”,并帶有陳香、檳榔香或參香風味的品質,以及特殊的保健功效,產品遠銷香港、東南亞國家和地區,備受廣大消費者的青睞[5-8]。

檳榔香是六堡茶特有的、極具辨識度的獨特風味,也是六堡茶獨特魅力所在。作為六堡茶獨特的茶韻,檳榔香必須要在良好的倉儲環境下經歷一定年限的陳化才能形成,所以檳榔香大多存在于六堡陳茶和老茶中,新茶很少有檳榔香出現[9]。劉澤森等[10]采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)結合氣相GC-MS對不同年份檳榔香六堡茶進行研究,發現隨著貯藏年份的增加,檳榔香六堡茶中香氣越加渾厚,這可能與六堡茶中陳香類物質如雪松醇、杜松烯和花果香類物質如β-芳樟醇、氧化芳樟醇含量隨著陳化時間的延長而升高有關。目前對六堡茶檳榔香的研究主要集中在對其感官理化分析和揮發性香氣物質組成分析方面。黃林杰等[6]采用動態頂空結合氣相GC-MS對檳榔香六堡茶揮發性物質進行分析,初步確定檳榔香主要揮發性成分為α-雪松醇、β-芳樟醇、(Z)-芳樟醇氧化物、水楊酸甲酯、苯甲酸甲酯、α-雪松烯、奈和甲氧基苯類化合物。LI等[11]采用HS-SPME結合GC-MS對檳榔香六堡茶進行研究,發現普勒酮、萘、1-甲基萘、2-甲基萘、2-庚酮、二氫-β-紫羅蘭酮和2-戊基呋喃可能是形成六堡茶檳榔香的重要香氣化合物。目前研究均為對檳榔香六堡茶揮發性香氣物質的分析,對其關鍵香氣物質組成深入研究較少,值得進一步挖掘。

HS-SPME是一種集取樣、萃取、濃縮和進樣為一體的揮發性物質提取技術,具有操作簡單、樣品用量少、無需使用溶劑、萃取樣品后可直接色譜進樣等優點,現已廣泛應用于各種茶葉香氣的分析中[11-13]。本研究采用HS-SPME聯合氣相色譜-嗅聞儀-質譜儀(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry, GC-O-MS)和氣味活力值(odor activity value, OAV)對檳榔香六堡茶關鍵香氣物質進行研究,以期為揭示六堡茶檳榔香特征風味形成機理提供理論和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檳榔香六堡茶(5個樣品,均倉儲5～7年),梧州中茶茶業有限公司,茶葉經粉碎過2.0 mm圓孔篩,冰箱保存備用;氯化鈉(分析純),天津化學試劑一廠;六堡茶香氣化合物標準品(純度≥95%),上海思域化工科技有限公司;內標物(正癸醇,≥99.5%),上海騰準生物科技有限公司;C8～C32連續正構烷烴溶液(500 mg/L,溶解劑為氯仿),美國AccuStandard公司,用于氣味化合物保留指數的計算。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀、HP-5MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國Agilent公司;OPD Ⅲ嗅聞儀,哲斯泰(上海)貿易有限公司;固相微萃取裝置和固相微萃取頭(65 μm PDMS/DVB),美國Supelco公司;IT-09A恒溫磁力攪拌器,上海一恒科學儀器有限公司;YP1200電子天平,上海精科電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HS-SPME程序

檳榔香六堡茶揮發性香氣物質采用HS-SPME配置65 μm PDMS/DVB萃取頭進行富集,富集條件參考先前的報道[14-15],詳情如下:精確稱取1.0 g六堡茶樣品、2.0 g氯化鈉放置20 mL頂空瓶中,加入轉子、50 μL內標物(66.5 μg/mL)和5.0 mL煮沸超純水,迅速擰緊瓶蓋。將頂空瓶放置于60 ℃恒溫水浴杯中,平衡5 min,插入HS-SPME萃取頭,恒速攪拌吸附60 min,然后迅速將HS-SPME萃取頭插入氣相色譜進樣口,解析附4 min,同時啟動儀器數據采集。

1.3.2 儀器條件

儀器條件參考先前的研究[13]。GC-O條件是安捷倫GC(7890B)配置氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector, FID)和嗅聞儀,安捷倫HP-5MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)用于揮發性物質的分離。升溫程序:初始溫度40 ℃(保持5 min),以3 ℃/min升至180 ℃,然后以10 ℃/min升高到250 ℃,保持5 min;GC進樣口溫度、進樣模式和載氣(He>99.999%)流速分別為250 ℃、不分流模式和1.0 mL/min。嗅聞儀條件:空氣流量為60 mL/min,傳輸線溫度為250 ℃。色譜柱流出成分在毛細管末端以1∶1的分流模式分別進入檢測器和嗅聞儀。

GC-MS條件:色譜柱型號、升溫程序、GC進樣口溫度、進樣模式和載氣流速均與GC-O分析相同,進樣方式為自動進樣。質譜條件為EI源,電子能量70 eV;接口溫度為280 ℃;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度為150 ℃;發射電流為34.6 A;掃描方式:全掃描;質量掃描范圍:35～450 aum;溶劑延遲時間:3.0 min。揮發性香氣化合物的鑒定是基于NIST 17數據庫的匹配、化合物保留指數(保留指數是C8～C32連續正構烷烴相同色譜條件下分析后計算所得)和香氣化合物標準品。

1.3.3 嗅聞分析

嗅聞分析由4名(1名男士和3名女士)具有2年以上茶葉感官審評經驗的茶葉研究人員組成,平均年齡28歲。4名嗅聞分析人員來自于湖南農業大學和云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司,無抽煙史,且要求實驗期間不允許使用化妝品。嗅聞分析時要求每位人員記錄嗅聞到的氣味和氣味強度。其中氣味強度采用數字進行量化,其中0、1、5、9分別代表未嗅聞到氣味、氣味強度微弱、氣味強度中等和氣味強度高。實驗過程中至少有2名人員在同一保留時間處嗅聞到相同的氣味為有效結果,最終每個化合物的氣味強度為4名人員嗅聞到的氣味強度的平均值。

1.4 數據處理

采用氣味化合物標準品峰面積/內標物的峰面積為縱坐標(y),以氣味化合物標準品濃度/內標物濃度為橫坐標(x)建立每種氣味化合物標準曲線,對每種氣味化合物進行定量分析。在氣味化合物定量分析的基礎上,參考GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中的黑茶審評方法,3 g茶樣,茶水比1∶50(g∶mL)計算每種氣味化合物的濃度,結合已報道每種氣味化合物在水中的閾值(https://www.vcf-online.nl/VcfHome.cfm),計算氣味活力值(OAV=化合物濃度/化合物閾值)。使用MS Excel 2010(Microsoft,USA)對數據進行處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 六堡茶氣味化合物鑒定

采用GC-O和GC-MS對檳榔香六堡茶進行分析,經數據庫比對、保留指數和化合物氣味,從檳榔香六堡茶中嗅聞、鑒定出37種呈現氣味的化合物(表1)。氣味強度(odor intensity, OI)中等以上的化合物有19種,其中酮類化合物氣味強度相對較高,二氫-β-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮氣味強度最高,均為9(氣味強度高),其次為脫氫二氫-β-紫羅蘭酮(OI=7.57)、α-紫羅蘭酮(OI=7.38)和(Z)-茉莉酮(OI=5.24)。二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮和α-紫羅蘭酮均為類胡蘿卜素衍生出的芳香化合物,呈現出“木質”氣味,曾被鑒定存在于各類茶葉中,對茶葉特征香氣的形成起關鍵作用[16]。(Z)-茉莉酮呈現“茉莉花”氣味,曾被報道是Chin Shin烏龍茶和四季茶的關鍵香氣化合物,相對含量高達7.00%～12.15%[17];醇類化合物氣味強度較高的化合物為β-芳樟醇和雪松醇,氣味強度分別為8.63和8.38,其次為香葉醇(OI=7.37)、苯乙醇(OI=7.09)、橙花醇(OI=6.54)和1-辛烯-3-醇(OI=6.24)。β-芳樟醇呈現令人愉悅的“花香”氣味,不僅被鑒定是各類茶葉特征香氣形成的關鍵化合物,也被鑒定是花卉和香料植物特征香氣形成的關鍵化合物[18-19];雪松醇呈現“木質”氣味,曾被鑒定是普洱茶特征香氣形成的主要香氣化合物,在六堡茶中也具有較高的含量,被認為是六堡茶特征香氣形成的關鍵化合物[11,20]。香葉醇、苯乙醇和橙花醇呈現令人愉悅的“花香”氣味,曾被鑒定對紅茶和普洱曬紅茶特征香氣的形成起關鍵作用[21-22]。1-辛烯-3-醇呈現“蘑菇”氣味,該物質來源于亞油酸的氧化降解,被鑒定是蘑菇風味形成的關鍵香氣物質[23],該物質也被鑒定是普洱茶特征香氣形成的主要香氣物質[24]。甲氧基苯類化合物氣味強度較高的為1,2,3-三甲氧基苯(OI=8.07),其次為4-乙基-1,2-二甲氧基苯(OI=6.19)、1,2,3,4-四甲氧基苯(OI=6.17)、3,4-二甲氧基甲苯(OI=5.09)和1,2,4-三甲氧基苯(OI=5.05)。甲氧基苯類化合物呈現特殊的“陳香”氣味,被認為是在發酵過程中微生物降解和甲基化兒茶素形成的一類物質,同時在茶葉堆積發酵中的熱降解也有助于甲氧基苯類化合物的形成,這類化合物是六堡茶、普洱茶等后發酵茶類特征風味形成的關鍵香氣物質[13,25]。醛類化合物氣味強度相對較高的化合物為(E,Z)-2,6-壬二烯醛(OI=6.83)和癸醛(OI=6.42)。(E,Z)-2,6-壬二烯醛呈現“黃瓜”氣味,曾被鑒定存在于普洱茶和紅茶中[26-27];癸醛呈現“脂肪”和“柑橘”的氣味,曾被鑒定是普洱茶的香氣化合物之一[28]。

表1 六堡茶氣味化合物GC-O分析結果Table 1 The results of odor compounds in Liupao tea by GC-O analysis

2.2 檳榔香六堡茶香氣物質定量分析和OAV計算

通過GC-O分析,確定了檳榔香六堡茶中呈現氣味的化合物,為了進一步評價氣味化合物對檳榔香六堡茶整體香氣形成的貢獻度,對每種氣味化合物進行定量分析,定量結果如表2所示。檳榔香六堡茶中含量較高的化合物為β-紫羅蘭酮(84 996.78 μg/kg)、二氫-β-紫羅蘭酮(54 637.50 μg/kg)、苯乙醇(13 582.16 μg/kg)、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮(6 872.67 μg/kg)、β-芳樟醇(4 424.37 μg/kg)、1,2,3-三甲氧基苯(1 931.23 μg/kg)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(726.83 μg/kg)、香葉醇(578.05 μg/kg)、癸醛(487.47 μg/kg)、4-乙基-1,2-二甲氧基苯(409.14 μg/kg)、1,2,3,4-四甲氧基苯(291.87 μg/kg)、3,4-二甲氧基甲苯(276.10 μg/kg)、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯(214.86 μg/kg)、(E)-2-壬烯醛(193.40 μg/kg)、α-紫羅蘭酮(193.29 μg/kg)、雪松醇(165.83 μg/kg)、橙花醇(103.81 μg/kg)和1,2-二甲氧基苯(101.69 μg/kg)。

表2 六堡茶香氣物質定量分析和OAV計算結果Table 2 The results of quantitative analysis and OAVs calculation of aroma-active compounds in Liupao tea

目前食品領域中已經發現萬余種氣味成分,然而僅有一小部分會對食品整體香氣的形成起著關鍵決定作用,這一部分氣味成分稱為關鍵香氣成分[29]。風味化學研究者認為,OAV≥1的氣味化合物通常被認為對分析樣品整體香氣的構成其貢獻作用,OAV<1的氣味化合物被認為對分析樣品整體香氣的形成無貢獻作用或起較小的貢獻作用[30-31]?？梢?氣味化合物含量的高低并不能完全代表其對六堡茶檳榔香貢獻度的大小,需要結合GC-O-MS鑒定結果和OAV作進一步判斷。為了進一步篩選對檳榔香六堡茶整體香氣形成起主要貢獻作用的氣味化合物,在氣味化合物定量的基礎上,結合已報道氣味化合物在水溶液中的閾值計算OAV,結果見表2。

為準確研究六堡茶檳榔香的特點,以OAV≥1為標準共篩選出18種關鍵氣味物質,分別為:1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、癸醛、壬醛、β-芳樟醇、苯乙醇、橙花醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、雪松醇、二氫-β-紫羅蘭酮、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮、3,4-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯及1,2,3,4-四甲氧基苯,這些化合物對檳榔香六堡茶整體風味的形成起關鍵作用。其中,β-芳樟醇、苯乙醇、橙花醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮和α-紫羅蘭酮貢獻了花香;(E,Z)-2,6-壬二烯醛具有類似黃瓜的氣味,貢獻了清香;壬醛和癸醛貢獻了脂香;1-辛烯-3-醇和(E)-2-壬烯醛貢獻了青草香;雪松醇、二氫-β-紫羅蘭酮和脫氫二氫-β-紫羅蘭酮貢獻了木香;3,4-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯和1,2,3,4-四甲氧基苯貢獻了陳香。其中,二氫-β-紫羅蘭酮(OAV=1 092 750)、β-紫羅蘭酮(OAV=242 847.94)、苯乙醇(OAV=18 109.55)、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮(OAV=1 527.26)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(OAV=484.55)、β-芳樟醇(OAV=221.22)、癸醛(OAV=97.49)和1,2,3-三甲氧基苯(OAV=51.49)的OAV≥50,特別是二氫-β-紫羅蘭酮(0.001 μg/L)、β-紫羅蘭酮(0.007 μg/L)和苯乙醇(0.015 μg/L)有極低的閾值,OAV顯著高于其他氣味化合物,這些氣味化合物對于六堡茶檳榔香的形成具有重要的貢獻作用。六堡茶良好的倉儲環境對這些關鍵香氣物質的轉化、協調比例的形成及檳榔香的呈現起著決定性的作用[32]。通過對比OAV結果和GC-O分析結果,癸醛和(E)-2-壬烯醛具有較大的OAV,但GC-O分析香氣強度均小于5,這可能是物質間的相互作用導致?？傮w來說,2種方法所篩選檳榔香六堡茶關鍵香氣物質的分析結果基本保持一致。

3 結論

本研究采用HS-SPME結合GC-O-MS和OAV對檳榔香六堡茶香氣物質進行分析和關鍵香氣物質篩選。經GC-O分析,從檳榔香六堡茶共嗅聞、鑒定出37種呈現氣味的化合物,其中氣味強度中等以上的化合物為19種,主要為酮類、醇類、甲氧基苯類和醛類,其中香氣強度較高的化合物為二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-芳樟醇、雪松醇和1,2,3-三甲氧基苯。在GC-O分析的基礎上,結合氣味化合物定量結合和氣味化合物閾值計算化合物OAV,檳榔香六堡茶中OAV≥1的氣味化合物有18種,其中二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、苯乙醇、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、癸醛、β-芳樟醇和1,2,3-三甲氧基苯的OAV≥50,可以說明這些物質對檳榔香六堡茶整體香氣形成貢獻度較大。對比GC-O分析和OAV計算結果,2種方法所篩選檳榔香六堡茶關鍵香氣物質的分析結果基本一致,該研究結果對于六堡茶陳化過程中“檳榔香”的形成提供理論依據以及對于定向加工“檳榔香”六堡茶具有指導意義。

然而,通過GC-O-MS分析和OAV計算仍然無法準確解析檳榔香六堡茶中的關鍵香氣成分,在后續實驗中還需要通過香氣重組及遺漏實驗等進行關鍵香氣成分的驗證分析。此外,在2種分析方法中關鍵香氣物質存在一定的差異,這可能與化合物較高的閾值以及香氣化合物之間的相互作用等因素有關。值得注意的是,單個氣味化合物對檳榔香六堡茶香氣品質的貢獻不僅取決于其在茶葉中的含量,基質成分也會影響氣味化合物的釋放。因此,在后續研究中,還需要進一步針對基質成分、低OAV化合物對檳榔香六堡茶香氣品質的影響展開相關研究。